具体实施方式
为克服上术现有技术的缺点，本发明主要目的是借由将神经细胞
培养于基础培养基6至9天而制备的培养基培养的脐带间叶细胞，可
高度(87％)分化成功能性后分裂神经细胞。
不欲受限于理论，吾人相信培养的神经细胞可释放出某种物质组
合，其提供理想状况使干细胞分化成神经细胞。
在此使用的″干细胞″乙词是指任何未分化、多能性(pluripotent)或多
效性(multipotent)的哺乳动物细胞，包括但不限于胚胎干(ES)细胞，胚
胎生殖(EG)细胞，胚胎癌(EC)细胞，骨髓基质细胞，骨髓造血细胞，
脐带血细胞及脐带间叶细胞。以上所有干细胞除了脐带间叶细胞外，
都已被报告可分化成神经细胞及/或胶质细胞。然而，经由本发明的培
养方法，即使是脐带间叶细胞也可高比例地分化成功能性神经细胞。
因此，任何哺乳动物干细胞皆适用于本发明的方法。较佳是使用
间叶细胞如BMSC或脐带间叶细胞。
本发明中用于制备培养基的神经细胞可得自哺乳动物之外围神经
系统及中枢神经系统(CNS)。较佳是得自中枢神经系统的神经细胞，更
佳是得自脑部，最佳是得自海马回。
本发明的培养基可借由将神经细胞培养于任何现有的培养基而
得。本发明适用的基础培养基包括但不限于添加胎牛血清的达尔克必
须基本培养基(FBS-DMEM)。
应了解本发明所用的基础培养基可添加一般用于细胞培养的其它
添加物。
根据本发明，神经细胞以现有方法在基础培养基中培养3至6天，
较佳是5天。所产生的混合物可直接用于培养干细胞。
根据本发明，在成熟神经细胞收成的前，干细胞以现有方法培养
于本发明培养基6至12天。较佳是在培养的第九天收成。
培养的神经细胞被移走后，本发明的培养基可分装为小份保存以
作为将来使用。
以下分析是用以定性根据本发明的方法所产生的神经细胞。
NF的免疫细胞化学
神经纤维(NF)是神经细胞中的主要细胞骨骼，其负责调整神经细
胞树突的大小、外观及直径。只有在发育晚期及成熟期的神经细胞才
会表现NF。对NF的免疫染色可用以确定神经细胞处于晚期。
NeuN的免疫细胞化学
神经细胞特定核蛋白(NeuN)是脊椎动物中枢神经系统神经细胞细
胞核中的特殊蛋白。在活体外NeuN可和DNA结合。已知在神经细胞
发育中，NeuN的出现较NF早。因此对NeuN的免疫染色可用以确定
神经细胞处于转型早期。
GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨点法
在哺乳动物的CNS中，谷胺酸是主要的刺激神经传导物质。大部
分的神经细胞都有谷胺酸受体来接收刺激信息。其中主要有二类谷胺
酸受体：离子型及代谢型。离子型受体可依照其不同的选择性激动剂，
进一步再分为：NMDA(N-甲基-D-天门冬胺酸)受体、AMPA(α-胺基-3-
羟基-5-甲基-4-异唑基丙酸)受体及KA(海人草酸)受体。KA受体是由
GluR5、GluR6、GluR7、KA1及KA2等次单元形成。因此，利用西方
墨点法检测GluR5、GluR6、GluR7及KA2可确定神经细胞具有合成
功能性蛋白质的能力。
Ca2+结合蛋白的免疫细胞化学
Ca2+在细胞的信息传递途径中扮演重要的角色。然而，在细胞中
大部分的Ca2+并不是单独作用，而是和Ca2+结合蛋白相结合。Ca2+
结合蛋白可以缓冲细胞内的Ca2+浓度，进而调节Ca2+的活性。在中枢
神经系统中存在着许多种类的Ca2+结合蛋白，分布最广的是
parvalbumin(PV)、calbindin-D28K(CB)及calretinin。PV及CB皆属于
EF-hand型Ca2+结合蛋白家族。在胚胎神经系统发育期间，PV及CB
被认为是神经细胞特定表现的Ca2+结合蛋白。因此，对PV及CB的
免疫染色可用以确定神经细胞具有合成功能性蛋白质的能力。
BrdU及DAPI的双重标记
DAPI(4′，6-二基-2-苯基 二盐酸盐)是一种萤光染料，可自由
地通过细胞膜和核膜，并和细胞核中的DNA结合，通常用以计算细胞
的数目。此外，在细胞复制过程中，细胞须合成另一组染色体，并将
外加的BrdU(溴化去氧尿核，其为胸腺嘧啶核 酸的相似物)纳入所
合成的染色体中。因此，观察BrdU的纳入可用以确定细胞的复制。
BrdU及DAPI的双重标记可确定神经细胞的复制。
BrdU及NF的双重标记
如上所述，NF的免疫染色用以确定是否为神经细胞，BrdU则用
以确定细胞的复制。因此，NF及BrdU的双重标记可确定神经细胞的
复制能力。
GAD的免疫细胞化学
GABA是神经传导物质的一，其是由谷胺酸经谷胺酸去羧基
(GAD)催化而合成。因此，利用对GAD的免疫染色可确定神经细胞具
有合成神经传导物质GABA的能力。
根据本发明的方法所产生的神经细胞可用于治疗神经退化疾病，
如帕金森氏症、阿兹海默症、亨丁顿氏症，及肌萎缩性脊髓侧索硬化
症或因中风及外伤造成的神经细胞死亡。
由以下的实施例对本发明做进一步说明，但不应以此限定本发明
的范围。
实施例1
人类脐带间叶细胞的制备
人类脐带间叶细胞是从一提供接生服务的诊所(蔡氏妇产科诊所，
台北市北投区石牌路一段72号)取得。脐带以无菌操作方式收集并在4
℃下储存于HBSS(Biochrom L201-10)不超过24小时。
脐带先泡在75％的乙醇中30秒以消毒。在无菌操作台中将消毒过
的脐带置于无钙及无镁离子的缓冲溶液(CMF，Gibco 14185-052)，以消
毒过的器具将脐带纵切，并将其中的血管及间叶组织(瓦顿氏凝胶)去
除。将间叶组织切成0.5立方公分的小块，以250×g离心5分钟。去
除上清液，并以适量的无血清DMEM(Gibco 12100-046)清洗沉淀物二
次，再以250×g离心5分钟。间叶组织在37℃下以胶原 处理14
至18小时，清洗后，再以2.5％的胰蛋白于37℃及震荡下处理30分
钟。加入FBS(Hyclone SH30071.03)至间叶组织以终止胰蛋白 反应。
此时间叶组织已变成间叶细胞。
间叶细胞以10％FBS-DMEM使其分散并计算其数量后，便可直接
用于培养。
实施例2
培养过神经细胞的FBS-DMEM的制备
用以制备培养过神经细胞的FBS-DMEM的神经细胞是取自七天
大的史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠的脑部(中华民国台湾省台北市
国立阳明大学动物中心)。
在以下的操作的前，先将含有24ml 10％FBS-DMEM的50ml离
心管置于37℃培养箱内。
大鼠以i.p.注射给予0.3ml的10％水合氯化物。3至4分钟后，完
全麻醉的大鼠以75％乙醇全身消毒。在无菌操作台中将大鼠脑取出并
置于CMF中。将脑以900rpm离心5分钟。去除上清液，添加10％
FBS-DMEM至沉淀物(脑组织)。以移液器吸放15次将脑组织打散成单
细胞。将打散的细胞加至的前准备的50ml离心管，与其中的
FBS-DMEM充分混合。将此混合物加至24孔盘的涂覆有聚-L-离胺酸
的孔中，在37℃培养箱中培养。第二天加入最终浓度为2μM的阿糖
胞(Arac)。
培养的第五天，此培养基即可取出用来培养脐带间叶细胞。
实施例3脐带间叶细胞转型为神经细胞
将由实施例1得到的脐带间叶细胞，培养于由实施例2得到的培
养过神经细胞的FBS-DMEM培养基中，或培养于FBS-DMEM(控制组)
中，置于37℃培养箱。在第3、6、9及12天收集细胞。
如图1(A)所示，培养于FBS-DMEM 6天的脐带间叶细胞(控制组)
的形态为纺锤型，且因细胞增殖而互相紧密地贴附。培养于培养过神
经细胞的FBS-DMEM培养基6天的脐带间叶细胞显现神经的表型，包
括细胞体收缩、精致化历程(process elaboration)及细胞集簇(图1B)。
实施例4
分析
在实施例3中收集的细胞用以做以下的分析，其结果描述如下：
(1)NF的免疫染色：
以0.1M磷酸缓冲液(0.1M PBS，pH 7.4)清洗生长在盖玻片上6天
的细胞5分钟二次；再以固定液(4％多聚甲醛溶于0.1M PBS中)固定
20分钟；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以阻断液(0.05％ Triton
X-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)处理30分钟以避免非专
一性抗体-抗原结合。
处理后的细胞与初级抗体(兔子抗神经纤维200多株IgG，1∶250
稀释，Chemicon AB1982)在4℃下反应至少12至18小时；以0.1M PBS
清洗5分钟三次；再与二级抗体(生物素共轭的的山羊抗兔子IgG，1∶
1000稀释，Sigma b-8895)在室温下反应1小时；以0.1M PBS清洗5
分钟三次；接着与亲和素-生物素化-辣根过氧化 还合物(ABC KIT，
Vectorlabs PK-4000)在室温下反应1小时；以0.1M PBS清洗5分钟三
次；再以3，3′-二胺基联苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml
的50mM Tris缓冲溶液中)显影。
以上得到的样品以浓度渐增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)
的乙醇及二甲苯进行脱水反应，每一浓度5分钟。盖玻片以封片胶
(permount)封在载玻片上并在光学显微镜(Olympus BH-2)下观察。
如图2(A)所示，培养于培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基6
天的脐带间叶细胞表现NF，显示其已转型成神经细胞。
本实验也测定以培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基处理不同
时间的脐带间叶细胞表现NF的比例。如图3所示，处理后第3天有
59.4％的脐带间叶细胞表现NF，处理后第6天NF的表现量达到最大，
87.4％。处理时间延长NF表现量既不升高也不降低(n＝3，单因子变异
数分析，续以LSD分析，P＜0.01)。
(II)NeuN的免疫染色：
以0.1M磷酸缓冲液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生长在盖玻片上6天
的细胞5分钟二次；再以固定液(4％多聚甲醛溶于0.1M PBS中)固定
20分钟；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以阻断液(0.05％ Triton
X-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)处理30分钟以避免非专
一性抗体-抗原结合。
处理后的细胞与初级抗体(小鼠抗神经核单株IgG，1∶100稀释，
Chemicon MAB377)在4℃下反应至少36至42小时；以0.1M PBS清
洗5分钟三次；再与二级抗体(生物素共轭的山羊抗老鼠IgG，1∶250
稀释，Chemicon AP124B)在室温下反应1小时；再以0.1M PBS清洗5
分钟三次；接着与亲和素-生物素化-辣根过氧化 还合物(ABC KIT，
Vectorlabs PK-4000)在室温下反应1小时；以0.1M PBS清洗5分钟三
次；再以3，3′-二胺基联苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml
的50mM Tris缓冲溶液中)显影。
以上得到的样品以浓度渐增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)
的乙醇及二甲苯进行脱水反应，每一浓度5分钟。盖玻片以封片胶封
在载玻片上并在光学显微镜(Olympus BH-2)下观察。
如图2(B)所示，培养于培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基6
天的脐带间叶细胞表现NeuN，显示其已转型成神经细胞。
(III)GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨点法
(a)细胞膜的制备
细胞膜的制备是由以培养过神经细胞的FBS-DMEM处理不同时
间的脐带间叶细胞及七天龄大鼠的脑而得。以0.1M磷酸缓冲液清洗
培养的细胞3分钟二次。在4℃下添加Tris-HCl缓冲液(50mM，pH7.4)
至细胞，以刮刀将细胞从培养皿上刮除。将刮除的细胞置于一15ml
的铁氟龙-玻璃均质机中磨20次以使其均质化，接着在4℃下以30000g
离心30分钟。所得到的沉淀物大部分为细胞膜，再磨沉淀物并溶解于
适量的Tris-HCl缓冲溶液中，储存于-20℃冰箱中以备将来使用。
(b)蛋白质浓度的测定
为了用于西方墨点法，由以上方法得到的样品中的蛋白质以595
nm吸光值测定蛋白质浓度，此蛋白质浓度的测定是依据Bradford法实
施(MM.Bradford，1976，Analytical Biochemistry 72：248-254)。
(c)电泳
样品中的蛋白质以20％SDS-PAGE分离。将凝胶中分离的蛋白质
转印至PVDF膜(NEW，NEF1002)以用于西方墨点法
(d)西方墨点法
以TBS溶液(0.9％NaCl溶于50mM Tris-HCl中，pH7.4)清洗含有
蛋白质的PVDF膜30分钟二次。以溶有5％脱脂奶粉的TBS缓冲液进
行阻断反应60分钟。接着将PVDF膜浸泡于阻断液(0.05％Triton-X100、
5％正常山羊血清及3％BSA)60分钟后，以TBS缓冲液清洗，再与初
级抗体(兔子抗KA2多株IgG，1∶1800稀释，UPSTATE06-315；山羊
抗GluR5多株IgG，1∶30稀释，Santa Cruz sc-7617；山羊抗GluR6多
株IgG，1∶30稀释，Santa Cruz sc-7618；山羊抗GluR7多株IgG，1∶
30稀释，Santa Cruz sc-7620；及兔子抗谷胺酸去羧基 多株IgG，1∶
1500稀释，Chemicon AB108)在4℃下反应12至18小时。
反应完成之后，以TTBS(0.05％Tween-20溶于TBS中)清洗PVDF
膜30分钟二次后，将此膜浸泡于阻断液中60分钟，再与二级抗体(抗
Glu5/6/7的生物素-抗山羊/绵羊IgG，1∶200稀释，Sigma B-3148；及
抗KAR2/GAD的生物素-抗兔子IgG，1∶250稀释，Chemicon AP187B)
在室温下反应1小时。以TTBS清洗反应过后的PVDF膜30分钟二次，
再与亲和素-生物素化-辣根过氧化 还合物(ABC KIT，Vectorlabs
PK-4000)在室温下反应1小时，以0.1M PBS清洗5分钟三次，再以
DAB(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml的50mM Tris缓冲溶
液中，pH7.4)显影。
如图4所示，脐带间叶细胞在以培养过神经细胞的FBS-DMEM培
养基处理前并无表现海人草酸(Kainate)受体次单元。以培养过神经细胞
的FBS-DMEM培养基处理后第6天，海人草酸受体次单元，包括
GluR6、GluR7及KA2，有少量地表现，处理后第12天，GluR5、GluR6、
GluR7及KA2有显著地表现。
(IV)Parvalbumin(PV)及Calbindin-D28K(CB)的免疫染色
以0.1M磷酸缓冲液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生长在盖玻片上6天
的细胞5分钟二次；再以固定液(2％多聚甲醛及7.5％piric酸溶于0.1M
的PBS中)固定20分钟；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以阻断液
(0.05％Triton X-100、正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)处理30分钟以
避免非专一性抗体-抗原结合。
处理后的细胞与初级抗体(山羊抗parvalbumin的多株IgG，1∶40
稀释，Santa Cruz sc-7449及山羊抗calbindin多株IgG，1∶40稀释，
Santa Cruz sc-7691)在4℃下反应至少12至18小时；以0.1M PBS清洗
5分钟三次；再与二级抗体(生物素共轭的小鼠抗山羊/绵羊单株IgG，1∶
250稀释，Sigma B3148)在室温下反应1小时；再以0.1M PBS清洗5
分钟三次；接着与亲和素-生物素化-辣根过氧化 还合物(ABC KIT，
Vectorlabs PK-4000)在室温下反应1小时；以0.1M PBS清洗5分钟三
次；再以3，3′-二胺基联苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml
的50mM Tris缓冲溶液中)显影。
以上得到的样品以浓度渐增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)
的乙醇及二甲苯进行脱水反应，每一浓度5分钟。盖玻片以封片胶封
在载玻片上并在光学显微镜(Olympus BH-2)下观察。
如图5所示，培养于培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基9天的
脐带间叶细胞表现parvalbumin(图5A)及calbindin-D28K(图5B)，显示
其已转型成神经细胞并具有合成Ca2+结合蛋白的能力。
(V)GAD的免疫染色及西方墨点法
以0.1M磷酸缓冲液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生长在盖玻片上6天
的细胞5分钟二次；再以固定液(2％多聚甲醛及7.5％piric酸溶于0.1M
的PBS中)固定20分钟；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以阻断液
(0.05％Triton X-100、正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)处理30分钟以
避免非专一性抗体-抗原结合。
处理后的细胞与初级抗体(兔子抗谷胺酸盐去羧基 多株IgG，1∶
1500稀释，Chemicon AB108)在4℃下反应至少12至18小时；以0.1M
PBS清洗5分钟三次；再与二级抗体(生物素共轭的山羊抗兔子IgG，1∶
300稀释，Sigma b8895)在室温下反应1小时，以0.1M PBS清洗5分
钟三次。接着与亲和素-生物素化-辣根过氧化还合物(ABC KIT，
Vectorlabs PK-4000)在室温下反应1小时，以0.1M PBS清洗5分钟三
次，再以3，3′-二胺基联苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml
50mM的Tris缓冲溶液中)显影。
以上得到的样品以浓度渐增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)
的乙醇及二甲苯进行脱水反应，每一浓度5分钟。盖玻片以封片胶封
在载玻片上并在光学显微镜(Olympus BH-2)下观察。
如图6(A)所示，培养于培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基6
天后的脐带间叶细胞表现GAD，显示其已转型成神经细胞并具有合成
神经传导物质GABA的能力。如图6(B)所示，脐带间叶细胞可在处理
后第6天被诱导出表现GAD的能力，且在第12天GAD的表现量有显
著地增加。
(III)、(IV)及(V)的结果证明根据本发明的方法得到的神经细胞具功
能性且可合成具有神经细胞特征的蛋白质及神经传导物质。
(VI)DAPI染色
以0.1M磷酸缓冲液清洗处理后的细胞5分钟二次，然后以50μ
g/ml的DAPI染色30分钟。细胞以Tris缓冲液(Tris-HCl 50mM，pH7.3)
完全清洗并以包埋剂(Tris∶甘油＝1∶1)包埋，在萤光显微镜下观察及
计算细胞数目。
图7(A)显示细胞密度的显微影像。利用DAPI标记(蓝色)测定处理
后第0、3、6及9天的细胞数目。图7(B)显示脐带间叶细胞以培养过
神经细胞的FBS-DMEM培养基处理不同时间后的细胞密度。在不同的
处理后时间点，利用DAPI染色测定细胞密度的改变。结果指出处理后
第9天的细胞密度显著高于第3天的细胞密度(n＝3，单因子变异数分
析，续以LSD分析，P＜0.01)。
(VII)BrdU及DAPI的双重染色
给予生长在盖玻片上的细胞最终浓度为50μM的BrdU(Sigma
B5002，配制为50mM库存溶液)，并使其继续生长24小时。以0.1M
磷酸缓冲液(0.1M PBS，pH7.4)清洗细胞5分钟二次；再以固定液(70％
乙醇于50mM甘胺酸缓冲液中，pH2.0)在-20℃下固定30分钟；以0.1
M PBS清洗5分钟三次；再以阻断液(0.05％Triton X-100、5％正常山
羊血清及3％牛血清白蛋白)处理30分钟以避免非专一性抗体-抗原结
合。
处理后的细胞接着与初级抗体(小鼠抗BrdU单株IgG，Chemicon
MAB3222，以0.66mM CaCl2及1mM β-巯基乙醇于66mM的Tris
缓冲液中1∶100稀释)在4℃下反应至少36至42小时；以0.1M PBS
清洗5分钟三次；再与二级抗体(萤光素共轭的山羊抗小鼠IgG，1∶50
稀释，Chemicon AP124F)及1mg/ml DAPI(Sigma D9542)在室温下反应
1小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次。盖玻片以包埋剂(Vector H-1000)
固定于在载玻片上，以指甲油密封，在萤光显微镜(Olympus BX50)下
观察。并计算单位面积内被BrdU标记的细胞数目。
(VIII)BrdU及NF的双重染色
给予生长在盖玻片上的细胞最终浓度为50μM的BrdU(Sigma
B5002，配置为50mM库存溶液)，并使其继续生长超过24小时。以
0.1M磷酸缓冲液(0.1M PB，pH7.4)清洗细胞5分钟二次；再以固定
液(70％乙醇于50mM胺基乙酸缓冲液中，pH2.0)在-20℃下固定30分
钟；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以阻断液(0.05％Triton X-100、
5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)处理30分钟以避免非专一性抗
体-抗原结合。
处理后的细胞与初级抗体(小鼠抗BrdU单株IgG，Chemicon
MAB3222，以0.66mM CaCl2、1mM β-巯基乙醇于66mM的Tris
缓冲溶液1∶100稀释)在4℃下反应至少12至18小时后；再与另一初
级抗体(兔子抗神经纤维多株IgG，1∶250稀释，Chemicon AB1982)在
4℃下反应至少12至18小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再与二
级抗体(萤光素共轭的山羊抗老鼠IgG，1∶50稀释，Chemicon AP124F
及若丹明(Rhodamine)共轭的山羊抗兔子IgG，1∶50稀释，Chemicon
AP132R)在室温下反应1小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次。盖玻片
以包埋剂(Vector H-1000)固定于在载玻片上，以指甲油密封，在萤光显
微镜(Olympus BX50)下观察。并计算单位面积内被BrdU标记的细胞数
目。
图8显示脐带间叶细胞以培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基处
理3天后的增殖分析结果(A-F)。大部分被DAPI标记的细胞(A中的蓝
色)为BrdU-阳性(B中的绿色)。(C)是结果(A)及(B)的合并。处理后第3
天的细胞已分化成可表现NF的细胞(D中的红色)，郄仍被BrdU标记
(E中的绿色)。(F)是结果(D)及(E)的合并。以培养过神经细胞的
FBS-DMEM处理后第9天的细胞失去增殖能力(G-L)。所有被DAPI标
记的细胞(G中的蓝色)为BrdU-阴性(H中的绿色)。(I)是结果(G)及(H)
的合并。处理后第9天的细胞已分化成可表现NF的细胞(J中的红色)，
但大部分无法被BrdU标记(K中的绿色)。(L)是结果(J)及(K)的合并。
总结来说，大部分的细胞在第9天已转型成神经细胞并停止增殖，由
此得知此神经细胞在第9天已进入后分裂阶段。
(VII)及(VIII)的结果显示，以培养过神经细胞的含血清的DMEM
培养基培养的脐带间质细胞可增殖并分化成神经细胞。