一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法.pdf

本发明公开了一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法，该方法包括如下步骤：(1)将菘蓝种子接种到MS培养基中获得无菌苗外植体；(2)将发根农杆菌接入YEB培养基中，制备所需的菌液；(3)将外植体通过预培养后，浸入已活化的农杆菌菌液中，利用超声波辅助，使外植体与农杆菌充分接触后，取出外植体转入筛选培养基上进行毛状根的诱导培养；(4)将获得的转基因毛状根进行增殖培养。本发明取消了共培养步骤，增加了用含有抗生素的脱菌水清洗外植体，从而使转化外植体的存活率明显增高，转化时间也明显缩短，降低了转化成本；另外由于在用农杆菌浸染外植体时，利用了超声波作辅助，因此提高了转化率。

权利要求书
1.  一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法，其特征在于包括下述步骤：
将农杆菌划线接种于YEB固体培养基上培养1～2天后，用牙签挑取生长好的单菌落于YEB液体培养基中震荡培养；
将菘蓝种子先用无菌水浸泡，再用消洗灵浸泡，然后用无菌水冲洗2～4次，再用1‰的升汞消毒，并在消毒后用无菌水冲洗2～4次，最后用无菌滤纸吸干水分，接种于MS固体培养基中，在光照条件下进行培养；
将上述获得的菘蓝无菌苗切成约1～2cm长的外植体，接种于MS固体培养基中预培养12～48小时，然后放入上述制得的农杆菌菌液中，在超声波的辅助下振荡浸泡，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液，转入筛选培养基中诱导毛状根，当筛选培养基上出现农杆菌菌斑时，取出外植体先用无菌水冲洗2～4次，再用含有抗生素的脱菌水除菌，然后用无菌滤纸吸干水后，接入新配制的筛选培养基上继续诱导培养，直至产生毛状根；
将上述获得的毛状根接入液体增殖培养基中培养，产生大量的毛状根。

2.  根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法，其特征在于：菘蓝种子先用无菌水浸泡2～6小时后，再用0.02％的消洗灵浸泡2～6min，1‰的升汞消毒1～2次，每次3～5min。

3.  根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法，其特征在于：所述农杆菌为发根农杆菌ATCC15834或Ri1601，培养温度为25～30℃。

4.  根据权利要求1或3所述的一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法，其特征在于：所培养的农杆菌菌液OD600＝0.3～0.8。

5.  根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法，其特征在于：菘蓝外植体在超声波辅助下振荡浸泡的时间为8～15min，其中超声波作用的时间为1～3min。

6.  根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法，其特征在于：所述筛选培养基是1/2MS+头孢噻肟钠200～500mg/L+琼脂6～8g/L+蔗糖15～25g/L，诱导毛状根的培养温度为25～30℃，光照强度为1500～2000Lx，每天光照8～16小时。

7.  根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法，其特征在于：所述脱菌水为含200～500mg/L头孢噻肟钠的抗菌素水。

8.  根据权利要求1或7所述的一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法，其特征在于：用脱菌水除菌的时间为3～10min。

9.  根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法，其特征在于：所述液体增殖培养基为1/2MS+头孢噻肟钠200～500mg/L+蔗糖15～25g/L。

10.  根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法，其特征在于：所述MS固体培养基为MS+琼脂6～8g/L+蔗糖20～30g/L，培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000Lx，每天光照8～16小时。

说明书一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法
技术领域
本发明涉及一种农杆菌介导的植物转基因方法，特别是涉及一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法。
背景技术
十字花科(Cruciferae)植物菘蓝(Isatis indigotica Fort)是我国南北各地广泛种植的一种大宗中草药，其根和叶是常用中药板蓝根和大青叶的主要来源。板蓝根在临床上用途较广，除板蓝板注射液外，主要常与其它中药组成复方广泛用于治疗多种疾病如流感、腮腺炎、乙脑、肝炎，是公认的有较好抗病毒效果的中药之一，此外，还具有抗炎、免疫调节、抗菌、解热、缓痛等药理作用。
80年代开始利用根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(Agrobacterium)的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，甚至是裸子植物而诱发植物产生毛状根。发根农杆菌中含有致使植物产生毛状根的Ri质粒，在Vir区基因产物协助下，Ri质粒中的T-DNA片段能转移进植物核基因组中，导致转化成功的植物产生大量的毛状根。毛状根具有生长速度快，不需要添加外源激素，并能提供大量可药用的次生代谢产物的特征。农杆菌Ri质粒上携带的生根基因不仅能使被感染植物部位产生大量的毛状根，而且由产生的毛状根还可以获得再生的转化植株，这些植株可表现出许多稳定遗传的表现变异，在植物品种的改良方面具有较广阔的应用前景。
目前已有农杆菌介导的植物转基因方法申请了专利，如申请号为200510037948.5的“一种杨树的农杆菌基因转化方法”等，这些方法目前存在如下问题：一是都包含有共培养步骤，因此转化步骤多，花费时间长，转化成本高；二是外植体除菌是通过在增殖培养基或/和筛选培养基中加入抗生素来实现的，因而只能去除与培养基相接触的表面上的细菌，其它未与培养基接触的表面上的细菌则不能去除，因此除菌效果不佳，存活率低；三是转化率较低。
本发明的目的是提供一种转化率高、转化成本低、除菌效果好的农杆菌介导的菘蓝转基因方法，该方法取消了共培养步骤。
为达到上述目的，本发明采用的解决方案包括如下步骤：
将农杆菌划线接种于YEB固体培养基上培养1～2天后，用牙签挑取生长好的单菌落于YEB液体培养基中震荡培养；
将菘蓝种子先用无菌水浸泡，再用消洗灵浸泡，然后用无菌水冲洗2～4次，再用1‰的升汞消毒，并在消毒后用无菌水冲洗2～4次，最后用无菌滤纸吸干水分，接种于MS固体培养基中，在光照条件下进行培养；
将上述获得的菘蓝无菌苗切成约1～2cm长的外植体，接种于MS固体培养基中预培养12～48小时，然后放入上述制得的农杆菌菌液中，在超声波的辅助下振荡浸泡，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液，转入筛选培养基中诱导毛状根，当筛选培养基上出现农杆菌菌斑时，取出外植体先用无菌水冲洗2～4次，再用含有抗生素的脱菌水除菌，然后用无菌滤纸吸干水后，接入新配制的筛选培养基上继续诱导培养，直至产生毛状根；
将上述获得的毛状根接入液体增殖培养基中培养，产生大量的毛状根。
上述菘蓝种子先用无菌水浸泡2～6小时后，再用0.02％的消洗灵浸泡2～6min，1‰的升汞消毒1～2次，每次3～5min。
所采用的农杆菌为发根农杆菌ATCC15834或Ri1601，培养温度为25～30℃，所培养的农杆菌菌液OD600＝0.3～0.8。
上述菘蓝外植体在农杆菌菌液中浸泡8～15min，其中用超声波辅助超声作用为1～3min。
上述筛选培养基是1/2MS+头孢噻肟钠200～500mg/L+琼脂6～8g/L+蔗糖15～25g/L，诱导毛状根的培养温度为25～30℃，光照强度为1500～2000Lx，每天光照8～16小时。
上述脱菌水为含200～500mg/L头孢噻肟钠的抗菌素水，用脱菌水除菌的时间为3～10min。
上述MS固体培养基为MS+琼脂6～8g/L+蔗糖20～30g/L，培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000Lx，每天光照8～16小时。
本方案中毛状根最好采用液体培养基进行增殖培养，所选择的液体增殖培养基为1/2MS+头孢噻肟钠200～500mg/L+蔗糖15～25g/L。
本发明具有如下效果：
(1)取消了共培养步骤，将浸染后的外植体直接接入含有抗生素的筛选培养基中，大大地减少了除菌环节，并由此节约了大量的药品，降低了转化成本；另外，增加了用含有抗生素的脱菌水清洗带有农杆菌的外植体，并用无菌滤纸吸干植物体表面的水分，可使转化外植体的存活率增高30％以上，从而使得毛状根的诱导率也明显增高。
(2)在用农杆菌浸染外植体时，利用了超声波作辅助，从而使外植体与农杆菌能充分接触，可提高转化率20％以上；
(3)操作简单、易推广。
具体实施方式
实施例1
(1)菌种及其活化
将发根农杆菌ATCC15834划线接种于YEB固体培养基上，27℃活化2次后用牙签在培养基上挑取生长好的单菌落于YEB液体培养基中，在27℃、100r/min的条件下震荡培养24小时，至OD600＝0.4～0.5时，即可用于浸染；
(2)无菌苗的获得
选取饱满的菘蓝种子先用无菌水浸泡5小时，再用0.02％的消洗灵浸泡3min，然后用无菌水洗涤4次，再在超净工作台上用1‰的升汞洗涤两次，每次2min，然后用无菌水洗涤4次，放于无菌滤纸上吸干表面多余水分后，放入固体培养基MS+琼脂6～8g/L+蔗糖20～30g/L中，在27℃、每天光照16小时，光照强度为1800Lx的条件下进行培养，7天即可得到无菌苗；
(3)转化培养
选择健壮的无菌苗，用手术刀将其切割成子叶、下胚轴、带子叶下胚轴三种长约1～2cm左右的外植体，子叶在主脉上切伤处理。将外植体接种于固体培养基MS+琼脂6～8g/L+蔗糖20～30gL中预培养24小时后，放入(1)步骤培养的农杆菌菌液中浸泡15min，其中辅以超声波仪超声处理的时间为2min，然后取出外植体，用无菌滤纸吸干植物体表面多余的菌液，放入筛选培养基1/2MS+头孢噻肟钠300mg/L+琼脂6～8g/L+蔗糖15～25g/L，在27℃暗培养1天后见光培养，光照强度为1800Lx，每天光照12小时，当筛选培养基上产生农杆菌菌斑时，立即用无菌水洗涤3次，再用含有300mg/L头孢噻肟钠的脱菌水浸泡5min，然后用无菌滤纸吸干植物体表面多余的水分，放入新配制的筛选培养基上再培养，直到产生毛状根；
(4)毛状根的增殖培养
将(3)步骤获得的毛状根切成3cm长，放入液体增殖培养基1/2MS+头孢噻肟钠300mg/L+蔗糖15～25g/L中，在27℃，光照强度1800Lx，每天光照15小时条件下培养25天，产生大量的毛状根，经PCR鉴定，发根农杆菌含有的RiT-DNA已整合入菘蓝基因组中并得到表达。本实施例的转化率可达70％。
实施例2
本实施例除农杆菌选用Ri16021外，其它步骤与实施例1相同。本实施例的转化率为48％，说明Ri1601的效果不如ATCC15834好。
实施例3
本实施例中筛选培养基和增殖培养基中抗生素头孢噻肟钠的浓度为200mg/L，其它步骤与实施例1相同。经观察发现，转化外植体的染菌率高于实施例1，而存活率低于实施例1，说明不同浓度的抗生素对农杆菌的抑菌作用是不同的。