东紫苏类黄酮的制备方法及应用.pdf

本发明是一种东紫苏类黄酮的制备方法及应用。制备方法是：取东紫苏，净制，粉碎，用含水醇提取1～3次，物料比为1∶5～1∶25；提取液合并，过滤，浓缩成1.05～1.20·50℃浸膏；取该浸膏加入3～10倍量水，搅拌混悬，用碱调pH＝9～10，过滤，用乙酸乙酯萃取3次，所得水层溶液再用酸调pH＝1～3，乙酸乙酯萃取3次，浓缩乙酸乙酯溶液，得总酚成分；总酚成分用乙醇回流溶解，趁热过滤，放置结晶，得类黄酮。加入药物制剂允许加入的助剂，制成包括口服液、酊剂、片剂、胶囊、颗粒剂及注射剂在内的药品，用于防治心脑血管性疾病，血脂及胆固醇过高、血栓栓塞等疾病。

权利要求书
1、  一种东紫苏类黄酮的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)取东紫苏，净制，粉碎，用含水醇提取1～3次，物料比为1∶5～1∶25；
(2)提取液合并，过滤，浓缩成1.05～1.20·50℃浸膏；
(3)取该浸膏加入3～10倍量水，搅拌混悬，用碱调pH＝9～10，过滤，用乙酸乙酯萃取3次，所得水层溶液再用酸调pH＝1～3，乙酸乙酯萃取3次，浓缩乙酸乙酯溶液，得总酚成分；
(4)总酚成分用乙醇回流溶解，趁热过滤，放置结晶，得类黄酮。

2、  权利要求1所述的东紫苏类黄酮的制备方法所得到的类黄酮的应用，其特征在于用于防治心脑血管性疾病，血脂及胆固醇过高、血栓栓塞。

3、  根据权利要求2所述的东紫苏类黄酮的制备方法所得到的类黄酮的应用，其特征在于加入药物制剂允许加入的助剂，制成包括口服液、酊剂、片剂、胶囊、颗粒剂及注射剂在内的药品。

说明书东紫苏类黄酮的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及药品技术领域，具体地说是以东紫苏为原料制备类黄酮的方法及其在心脑血管疾病方面的应用。
背景技术
唇形科香薷属(Elsholtzia)植物在我国约30种，其中云南就有20多种，资源十分丰富，多数品种均可入药，为传统常用中药。东紫苏为香薷属植物Elsholtzia bodinieriVan’t.的全草，又名凉茶、山茶、香茶、宝珠茶，味甘苦微幸，性平，能“发散解表，理气和胃，治外感风寒，消化不良”，滇南各地少数民族作为日常茶饮广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能保留其活性物质的东紫苏类黄酮的制备方法，以及其在治疗心脑血管疾病药物中的应用。
东紫苏中含圣草素7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷，木犀草素7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷，山奈酚3-O-芦丁糖苷，芦丁等类黄酮及2，6-二甲基-8-羟基-2，6-辛二烯酸-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷多种活性成分，是强烈的抗脂质过氧化剂和高血脂、高胆固醇平衡剂，能有效增强血管通透性和调节血液流变学指标，是天然的心脑血管疾病防治药物。针对本品现有应用状态，把东紫苏深加工，提取浓缩、精制其心脑血管疾病的有效成分——类黄酮，应用于食品、保健品及药品，具有巨大的商业经济前景。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
东紫苏类黄酮制备方法，包括以下步骤：
(1)取东紫苏净制、粉碎，用含水乙醇提取1～3次，物料比为1∶5～1∶25；
(2)提取液合并，过滤，浓缩成1.05～1.20(50℃)浸膏；
(3)取该浸膏加入3～5倍量水，搅拌混悬，用碱调pH＝9～10，过滤，用乙酸乙酯萃取3次，所得水层溶液再用酸调pH＝1～3，乙酸乙酯萃取3次，浓缩乙酸乙酯溶液，得总酚成分。
(4)总酚成分用乙醇回流溶解，趁热过滤，放置结晶，得类黄酮。
取类黄酮，加入相关辅料，制成药品，包括口服液、酊剂、片剂、胶囊、冲剂(颗粒剂)及注射剂等。
本发明中的东紫苏类黄酮及其制剂可用于心脑血管疾病防治。
东紫苏类黄酮功能活性试验如下：
1、试验材料
1.1、供试样品
SC-1(东紫苏类黄酮)为淡黄色粉剂，样品水溶性差，体外试验用DMSO助溶，口服样品用0.5％羧甲基纤维素助悬，饮用水稀释至一定容积，小鼠按0.2ml/10g体重ig，大鼠按1ml/100g体重ig。
1.2、其他药品试剂
血脂康胶囊由北京北大维信生物科技有限公司生产，批号20050626阿司匹林由山东新华制药公司提供，二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、血小板活化因子(plateletactivating facter，PAF)及花生四烯酸(arachidonic acid，AA)系sigma公司产品，血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)及高密度脂量白一胆固醇(HDL-C)测定试剂盒购自北京中生北控生物科技股份有限公司。灯盏花素片为云南植物药业有限公司产品，批号20040402。
1.3、主要仪器设备
LBY-NJ2型血液凝聚仪由北京普制生精密仪器研究中心生产，日本岛津公司生产CL-770型临床分光光度仪，北京赛科希德SA-6000型锥板粘度计等。
1.4、实验动物
SD大鼠、ICR小鼠为SPF级，家兔为普通级，实验动物生产许可证号：SCXK(滇)2005-0008，由昆明医学院实验动物中心提供。
2、方法与结果
2.1、统计学方法
实验结果用X±S表示，组间差异用t检验，P＜0.05表示组间差异有显著性。
2.2、对血小板聚集功能的影响
2.2.1、富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)和贫血小板血浆(platelet-poorplasma，PPP)的制备。
自清醒家兔颈动脉取血收集于塑料离心管中，用3.8％枸橼酸钠抗凝(血与抗凝剂体积之比为9∶1)，1000rpm离心10min得PRP，吸出PRP后剩余血液再以3000rpm离心10min得PPP，PPP用于调零或调整PRP中血小板的数目，试验中血小板数控制在5×1011/L
2.2.2、血小板聚集性测定
按Born’s比浊法测定样品不同浓度对ADP，PAF和AA诱导的血小板聚集的影响，即将样品与PRP共同温育10min，再加入不同诱导剂(终浓度分别为ADP3μmol/L，PAF7.2nmol/L，AA0.35mmol/L)，测定5min内血小板最大聚集率(％)。结果见表1。
表1 SC-1体外对ADP、PAF或AA诱导血小板聚集功能的影响

n＝5与溶媒对照(0.5％DMSO)比ap＜0.01 bp＜0.05
结果表明，SC-1有显著抑制ADP诱导的血小板聚集作用，该作用呈一定的浓度相关性；对PAF、AA诱导的血小板聚集，只在较高浓度有抑制作用(80mg/L)。
2.2.3对小鼠断头后张口喘气时间的影响
选用ICR小鼠50只，雌雄各半，体重18～22g，按体重随机分为5组，即空白对照组，阳性对照组(灯盏花素片100mg、kg-1、d-1)及SC-1低、中、高剂量组和WF-1低、中、高剂量组(分别按50、100、200mg、kg-1、d-1给药)，样品用饮用水稀释至一定容积，按0.2ml/10g体重ig，每天一次，空白对照组ig等体积饮用水。连续给药(或水)6天。末次给药后1h进行断头张口喘息时间测定。
结果显示，除灯盏花素片组(100mg/kg)有显著延长小鼠断头后张口喘气时间外，其他各组喘气时间与空白对照组比均无显著差异(表2)。
表2 SC-1对小鼠断头张口喘气时间的影响

n＝10与空白对照组比bP＜0.05
2.2.4对出血时间的影响
选用ICR小鼠50只，雌雄各半，体重18～22g，按体重随机分成5组，分组及给药量同前，阳性对照改用阿司匹林(30mg/kg)，连续给药5天，末次给药后1h用断尾法进行出血时间测定，将小鼠尾尖8mm处剪断，从出血开始(滤纸上出现血迹)计时，每半分钟用滤纸吸去血滴一次，直到出血自然停止(滤纸上无血迹)，所计时间即为出血时间。
结果显示，SC-1有一定延长出血时间倾向，但与空白对照组比无显著差异(P＞0.05)，见表3
表3 SC-1、WF-1对小鼠尾尖出血时间的影响

n＝10与空白对照组比ap＜0.01，bp＜0.05
2.2.5 对凝血时间的影响—毛细玻璃管法
选用ICR小鼠50只，雌雄各半，体重20～24g，按体重随机分为5组，分组及给药量与观察对出血时间影响相同。按分组连续给药5天，末次给药后1h用毛细玻管法进行凝血时间测定。取内径1mm、长10cm毛细玻管自小鼠一侧眼球内眦插入球后静脉丛，深的4～5mm，至血液流入毛细玻管内开始计时，血液注满后将毛细玻管取出平放于桌上，每隔30秒折断二端毛细管约0.5cm，至血凝丝出现为止，所历时间即为凝血时间。
表4 SC-1对小鼠凝血时间的影响

n＝10与空白对照组比ap＜0.01，bp＜0.05
结果表明，SC-1有延长小鼠凝血时间作用。
2.2.6 对ADP诱发小鼠肺微循环血栓形成的影响
ICR小鼠50只，雌雄各半，体重18～20g，按体重随机分为5组，分组及给药量同前，连续灌胃给药5天，末次给药后1h按文献方法于小鼠尾静脉iv 400mg/kg的ADP生理盐水溶液(0.1ml/10g体重)，注毕，观察并记录15min内动物死亡数，计算死亡抑制率。

结果表明：100和200mg/kg体重SC-1有显著降低静脉注射ADP所导致的肺微血管栓塞动物死亡数，该作用呈剂量依赖趋势(表5)
表5 SC-1、WF-1对ADP致小鼠肺栓塞死亡的保护作用

与空白对照组比aP＜0.01，bP＜0.05
2.2.7对小鼠实验性高脂血症血脂水平的影响
雄性ICR小鼠50只，体重18～22g，按体重随机分为5组，全部动物饲以含高脂肪，高胆固醇饲料，自由进食，饮水不限。高脂饲料配方为(W∶W)：胆固醇2％，蛋黄10％，猪油7％，丙基硫氧嘧啶0.1％，胆酸钠0.3％，基础饲料80.6％，在进食高脂饲料的同时，各给药组按分组灌胃给予不同剂量的药物，空白对照组给相同体积饮用水。5天后摘眼球取禁食12h空腹血，用酶法按试剂盒说明书操作程序，测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白—胆固醇(HDL-C)，结果见表6。
结果表明，SC-1灌胃给药有降低实验性高脂血症小鼠血清TC和TG作用，该作用呈剂量相关性，200mg/kg体重降低TC和TG作用十分显著，与模型组比P＜0.01，随着TC下降，HDL-C也有一定降低，但HDL-C/TC比值略有升高，说明样品对脂蛋白分布无有害影响。
表6 SC-1对小鼠实验性高脂血症的影响

n＝10 x±s aP＜0.01与高脂对照组比较
2.2.8 对血浆粘度的影响
雄性SD大鼠40只，体重200～240g，按体重随机分为4组，分组及给药量同前，高脂饲料喂养，饲料配方不变，连续给药7天，禁食12h后由股动脉取血，1％肝素抗凝，分离血浆(3000rpm，10min)，用北京赛科希德SA-6000型锥板粘度计进行血浆粘度测定。结果显示，SC-1无明显影响大鼠血浆粘度作用(表7)
表7 SC-1、WF-1对大鼠血浆粘度的影响

小结：初步实验结果显示，SC-1有较好的抑制ADP诱导的家兔血小板聚集作用，终浓度分别为20mg/L(SC-1)即可显著抑制ADP诱导的血小板聚集(P＜0.01＝，此外，SC-1在较高浓度(80mg/L)有抑制AA诱导的血小板聚集作用。体内灌胃给药，SC-1可显著延长小鼠的凝血时间，对出血时间无明显影响；SC-1 100-200mg/kg可明显降低ADP致小鼠肺微血管栓塞的死亡数；200mg/kg显著降低实验性高脂血症小鼠血清TC、TG水平，对大鼠血浆粘度无明显影响。以上结果提示，SC-1具有改变血液流变学，防治心脑血管疾病作用。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，但不是对本发明的限定。
实施例1：
取东紫苏10公斤，净制，粉碎，用75％含水乙醇100公斤回流提取3次，每次2小时，提取液合并，过滤，浓缩至密度1.10(50℃)，得浸膏2.02公斤，加水6公斤，用NaOH液调pH＝10，过滤，用乙酸乙酯萃取3次，所得水层溶液再用盐酸调pH＝1～3，用乙酸乙酯萃取3次，浓缩该乙酸乙酯溶液，得总酚成分。总酚成分用乙醇回流溶解，趁热过滤，放置结晶，得类黄酮268g。
实施例2：
取东紫苏1公斤，净制，粉碎，用50％含水乙醇5公斤回流提取3次，每次2小时，提取液合并，过滤，浓缩至密度1.05(50℃)，得浸膏0.17公斤，加水1公斤，用碱液调pH＝9，过滤，用乙酸乙酯萃取3次，所得水层溶液再用盐酸调pH＝2，用乙酸乙酯萃取3次，浓缩该乙酸乙酯溶液，得总酚成分。总酚成分用乙醇回流溶解，趁热过滤，放置结晶，得类黄酮18.8g。
实施例3：
取东紫苏5公斤，净制，粉碎，用30％含水乙醇125公斤回流提取3小时，提取液过滤，浓缩至密度1.20(50℃)，得浸膏0.92公斤，加水8公斤，用碱液调pH＝9，过滤，用乙酸乙酯萃取3次，所得水层溶液再用盐酸调pH＝3用乙酸乙酯萃取3次，浓缩该乙酸乙酯溶液，得总酚成分。总酚成分用乙醇回流溶解，趁热过滤，放置结晶，得类黄酮112.4g。
应用实施例1：
取实施例1～3中的类黄酮制成制剂：
取类黄酮100g，加入蔗糖150g，制粒，填装成胶囊1000粒(每粒含类黄酮100mg)；每日服用2～3次，每次1～3粒，用于防治心脑缺血、血脂及胆固醇过高、预防血栓栓塞等。
应用实施例2：
取类黄酮100g，加入水500ml，加入NaOH液不断搅拌，至完全溶解，再用盐酸调pH＝7.5，加水至1000ml，混匀，过滤，罐封成口服液1000支(每支含类黄酮100mg)；每日服用2～3次，每次1～3支，用于防治心脑缺血、血脂及胆固醇过高、预防血栓栓塞等。