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1、(10)授权公告号 CN 101298596 B (45)授权公告日 2011.04.27 CN 101298596 B *CN101298596B* (21)申请号 200710098954.0 (22)申请日 2007.04.30 C12N 1/19(2006.01) C12N 15/52(2006.01) C12P 21/00(2006.01) A23K 1/16(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院饲料研究所 地址 100086 北京市海淀区中关村南大街 12 号 (72)发明人 姚斌 柏映国 杨培龙 罗会颖 史秀云 王亚茹 袁铁铮 。
2、孟昆 石鹏军 黄火清 (74)专利代理机构 北京法思腾知识产权代理有 限公司 11318 代理人 高宇 杨小蓉 CN 1333363 A,2002.01.30, 全文 . CN 1624106 A,2005.06.08, 全文 . 关艳丽等 . 酵母菌对高浓度味精废水的处理 条件研究 . 生物技术 .2006,16(2),76-78. 关艳丽等 . 酵母菌对高浓度味精废水的处理 条件研究 . 生物技术 .2006,16(2),76-78. (54) 发明名称 一种生产生物酶制剂和酵母饲料蛋白的方法 (57) 摘要 本发明属于生物工程领域， 具体地， 本发明涉 及一种生产生物酶制剂和酵母饲料蛋白。
3、的方法。 根据本发明的方法以表达所述生物酶的重组毕赤 酵母为出发菌株， 以氨基酸生产离子交换尾液为 基础发酵培养基， 经种子培养、 液体深层发酵和离 心分离制得所述含生物酶制剂和酵母饲料蛋白。 根据本发明的方法， 不仅减少了工业废水的处理 成本， 降低了对环境的污染， 而且还将工业废水变 废为宝， 生产出较高价值的产品。 植酸酶可使饲料 中的植酸磷降解成肌醇和磷酸， 提高植物性饲料 中磷的利用率， 减少动物粪便中磷的排出量， 从而 减少饲料中无机磷的添加量， 因此对提高畜牧生 产效益及降低其对环境的污染有重要意义。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 彭郁葱 (19)中华人民共和。
4、国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 CN 101298596 B1/1 页 2 1. 一种生产生物酶制剂和酵母饲料蛋白的方法， 其特征在于， 所述方法以表达所述生 物酶的重组毕赤酵母为出发菌株， 以谷氨酸生产离子交换尾液为基础发酵培养基， 经种子 培养、 液体深层发酵和离心分离制得所述生物酶制剂和酵母饲料蛋白， 其中， 在所述液体深层发酵步骤中， 所用发酵培养基配方 ： 谷氨酸生产离子交换尾液 300kg/ 吨、 KH2PO4 5kg/ 吨、 CaSO41.0kg/ 吨、 MgSO48kg/ 吨、 用 KOH 调 pH 值 5.0， 培养过程中。
5、 连续流加 50的葡萄糖， 流加量为 2 10ml/L/h ； 发酵培养条件 ： 在 5L 发酵罐中， 发酵时间 60 64 小时， 温度 30， 通风量 1.5 2.0vvm， 搅拌转速 1000rpm， pH 值用氨水维持在 5.0， 发酵过程溶氧不低于 20。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述酶为能在毕赤酵母中组成性表达的 酶。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 所述酶为植酸酶、 木聚糖酶、 葡聚糖酶、 纤 维素酶、 淀粉酶或半乳糖苷酶。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述酶为来源于大肠杆菌的植酸酶appA。 5. 根据权利要求 。
6、1 所述的方法， 其特征在于， 在所述种子培养步骤中 ： 所用种子培养基配方 ： 1酵母提取物， 2蛋白胨， 2葡萄糖 ； 培养条件 ： 培养时间为 20 24 小时， 温度 30， 摇床转速为 250rpm。 权 利 要 求 书 CN 101298596 B1/3 页 3 一种生产生物酶制剂和酵母饲料蛋白的方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程领域， 具体地， 本发明涉及一种生产生物酶制剂和酵母饲料 蛋白的方法。 背景技术 0002 随着经济的飞速发展和技术的不断进步， 自20世纪60年代以来， 味精生产量逐年 上升， 目前我国已经成为味精的生产和消费大国。 味精产量的不断提高， 味精。
7、工业废水对环 境造成的污染问题日趋突出。 而这些废水的主要来源是在味精提取过程中产生的离子交换 尾液 ( 简称离交尾液 )。味精废水的离交尾液中 COD( 化学需氧量 )、 硫酸根和氨氮的含量 非常高。因此味精废水的处理成为制约味精生产企业发展的重大难题。 0003 近年来， 国内外众多专家对味精废水的治理进行了大量研究， 主要方法包括物化 处理、 厌氧生物处理和好氧生物处理法。物化处理法 COD 去除率仅达 30 40。厌氧生物 处理虽然运行费用较低， 但在厌氧环境下， 高浓度氨氮和硫酸根对甲烷菌具有较强的毒害 和抑制作用， 因此一般要采用预先脱硫脱铵、 稀释进水等措施， 从而增加处理成本。。
8、好氧生 物处理在处理高浓度有机废水时易产生污泥膨胀， 因此也必须将废水大量稀释。目前一些 味精厂利用离交尾液生产饲料酵母 ( 通常是热带假丝酵母和产朊假丝酵母 )， 这种方法能 够去除 40 60的 COD， 而且产生的菌体能够作为饲料蛋白得到利用。但饲料酵母法要 求经常性地进行菌种培养和比较严格的无菌条件， 同时利用该法生产的细胞培养液中细胞 干物质较低， 约 20 30g/L， 这样在后提取过程中需要消耗大量的热能和电能， 使得生产成 本居高不下， 而且由于上述酵母不能够利用铵基氮因而生产的酵母蛋白产品仍含有较高的 铵基氮， 对产品的质量影响较大。因此寻求一种较理想的解决方案是摆在科研人员。
9、面前的 一项重大课题。 0004 磷是动物生长、 繁殖、 骨骼矿化及代谢所必需的矿物元素之一。 作为动物饲料主要 成分的植物性饲料中虽含有相当数量的总磷， 但其中 50 70是以植酸磷 ( 六磷酸肌 醇 ) 的形式存在， 单胃动物缺乏分解植酸磷所必需的酶， 故磷的利用率仅有 0 40， 从 而造成磷源浪费、 饲料成本增加和动物生产性能的降低。同时， 植酸磷不能被动物有效利 用， 而直接排出体外还会造成严重的土壤和水源的磷污染。 另外， 植酸磷在动物胃肠道的消 化吸收过程中， 还会与多种金属离子和蛋白质螯合成相应的不溶性复合物， 影响这些营养 元素的有效利用。 0005 植酸酶可使植酸磷降解成肌。
10、醇和磷酸， 其对单胃动物的饲喂效果已得到了广泛的 确证。它可使植物性饲料中磷的利用率提高 60， 粪便中磷的排出量减少 40， 从而减少 饲料中无机磷的添加量， 它还可降低植酸盐的抗营养作用， 因此对提高畜牧生产效益及降 低其对环境的污染有重要意义。 植酸酶广泛存在于微生物、 麦芽、 种子等中， 但含量低， 难以 获得大量产品， 价格昂贵， 从而一直限制着植酸酶的推广利用。通过基因工程的手段， 已经 实现了在生物反应器中高效表达植酸酶基因， 从而大幅度降低了植酸酶生产的成本。 0006 毕赤酵母本身具有很好的安全性， 自 20 世纪 70 年代起建立的以巴斯德毕赤酵母 说 明 书 CN 101。
11、298596 B2/3 页 4 作为单细胞蛋白生产菌的高密度发酵方法已经成熟， 干细胞产量可高达100g/L。 同时， 利用 基因工程构建的重组酵母中也不带任何抗药性标记， 所以重组酵母本身作为饲料蛋白是安 全的。 发明内容 0007 为了解决氨基酸生产过程中离交尾液的污染和再利用问题， 本发明的发明人提出 并完成了本发明。 0008 本发明的目的是提供一种生产生物酶制剂和酵母饲料蛋白的方法。 0009 根据本发明的方法以表达所述生物酶的重组毕赤酵母为出发菌株， 以氨基酸生产 离子交换尾液为基础发酵培养基， 经种子培养、 液体深层发酵和离心分离制得所述的生物 酶制剂和酵母饲料蛋白。本领域普通技。
12、术人员可以根据实际的研究和生产需求， 将某特定 酶的编码基因导入毕赤酵母中， 从而构建重组毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母是近十年来发展 起来的较为完善的， 被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母菌。在高效表达载体中最 常用的启动子是 AOX1 启动子， 它的甲醇诱导性很强， 使在它控制下的外源基因能得到较高 的表达。PGAP( 三磷酸甘油醛脱氢酶启动子 ) 是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组 成型启动子， 由于该组成型启动子不需甲醇诱导， 发酵工艺更为简单， 而同时其产量很高， 所以成为代替 PAOX1 的最有潜力的启动子。根据本发明的方法， 可以将大肠杆菌的植酸酶 appA 克隆到 PGAP 。
13、启动子上， 在流加葡萄糖的情况下可以组成性高效表达植酸酶， 来源于大 肠杆菌的植酸酶 appA 具有优良的酶学性质和较高的比活。 0010 根据本发明的方法， 其中， 所述酶为能在毕赤酵母中组成性表达的酶， 优选植酸 酶、 木聚糖酶、 葡聚糖酶、 纤维素酶、 淀粉酶或半乳糖苷酶、 更优选来源于大肠杆菌的植酸酶 appA。 0011 根据本发明的方法， 其中， 所述氨基酸为可用离子交换方法提取的氨基酸， 优选谷 氨酸或赖氨酸。 0012 根据本发明的方法， 其中， 在所述种子培养步骤中 ： 0013 所用种子培养基配方 ： 1酵母提取物， 2蛋白胨， 2葡萄糖 ； 0014 培养条件 ： 培养时。
14、间为 20 24 小时， 温度 30， 摇床转速为 250rpm。 0015 根据本发明的方法， 其中， 在所述液体深层发酵步骤中 ： 0016 所用发酵培养基配方 ： 氨基酸生产离子交换尾液 300kg/ 吨、 KH2PO45kg/ 吨、 CaSO41.0kg/ 吨、 MgSO48kg/ 吨、 用 KOH 调 pH 值 5.0， 培养过程中连续流加 50的葡萄糖， 流 加量为 2 10ml/L/h ； 0017 发酵培养条件 ： 在 5L 发酵罐中， 发酵时间 60 64 小时， 温度 30， 通风量 1.5 2.0vvm， 搅拌转速 1000rpm， pH 值用氨水维持在 5.0， 发酵过。
15、程溶氧不低于 20。 0018 本发明提出了一种处理工业废水的方法， 氨基酸生产过程中的离子交换尾液通过 液体深层发酵生产饲料用酶制剂和酵母饲料蛋白， 利用重组毕赤酵母在富含铵基氮的离子 交换尾液中快速生长， 并可以大幅度降低发酵液中铵基氮离子， 提升酵母蛋白产品的品质。 根据本发明的方法， 不仅减少了工业废水的处理成本， 降低了对环境的污染， 而且还将工业 废水变废为宝， 生产出较高价值的产品 ； 用该工业废水经液体深层发酵可制备植酸酶， 酶活 达到3025u/ml， 可添加到饲料中。 植酸酶可使饲料中的植酸磷降解成肌醇和磷酸， 提高植物 说 明 书 CN 101298596 B3/3 页 。
16、5 性饲料中磷的利用率， 减少动物粪便中磷的排出量， 从而减少饲料中无机磷的添加量， 因此 对提高畜牧生产效益及降低其对环境的污染有重要意义。 附图说明 0019 图 1 为发酵过程培养曲线。 具体实施方式 0020 培养基成份 ： 0021 种子培养基 (YPD) ： 1酵母提取物 ( 进口 )， 2蛋白胨 ( 进口 )， 2葡萄糖 0022 发酵培养基 ： 离子交换尾液 300kg/ 吨、 KH2PO45kg/ 吨、 CaSO41.0kg/ 吨、 MgSO48kg/ 吨、 用 KOH 调 pH 值 5.0。 0023 PTM1 成份 ： 0024 硫酸铜 ： 6.0g/L， 碘化钾 ： 0。
17、.18g/L， 硫酸锰 ： 3.0g/L， 钼酸钠 ： 0.2g/L， 硼酸 ： 0.02g/ L， 氯化钴 ： 0.5g/L， 氯化锌 ： 20g/L， 硫酸亚铁 ： 65g/L， 硫酸 ： 5.0mL/L( 以上成份配制后单独 高压灭菌 )， 生物素 ： 0.2g/L( 过滤灭菌 )。 0025 1、 种子液制备 0026 从斜面上刮取两环菌种， 置于装有 50ml 种子培养基的 250ml 三角瓶中进行种子 培养。条件为培养时间 24 小时， 温度 30， 摇床转速 250rpm。再以 10接种量接入装有 200ml 种子培养基的 1000ml 三角瓶中进行发酵培养。条件为培养时间 24。
18、 小时， 温度 30， 摇床转速 250rpm。此时菌液的 OD 值应达到 12( 以上 )。 0027 2、 发酵生产 0028 在 5L 发酵罐内装 3.0L 发酵培养基灭菌后， 按每升培养基加入 4.37mL PTM1， 5 10接种种子液， 温度 30， 通风量为 1.60L/L/min， 1000rpm 搅拌培养， 培养过程中连续 流加 50 (w/v) 葡萄糖 ( 每升中含 12mL PTM1)， 流加量为 2 8mL/h/L， pH 用氨水维持在 5.0， 溶氧维持在20以上。 培养结束时， 酶活可以达到3025U/mL， 菌体干重达到120-130g/ L( 如图 1 所示 )。 0029 3、 植酸酶活性测定的原理与定义 0030 植酸酶在一定温度和 pH 条件下， 水解底物植酸钠， 生成正磷酸和肌醇衍生物， 在 酸性溶液中， 用钒钼酸铵处理会生成黄色的 (NH4)3PO4NH4VO316MoO3复合物， 在波长 415nm 下进行比色测定。 0031 样品在底物浓度为 5.0mmol/L、 温度 37、 pH 值 5.0 的条件下， 每分钟从植酸钠中 释放 1mol 无机磷， 即为一个植酸酶活性单位， 以 U 表示。 说 明 书 CN 101298596 B1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 。