一种提高植物抗逆性的基因及其应用 【技术领域】
本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种提高植物抗逆性的基因、重组质粒及其在改良植物对干旱和盐的耐受性方面的应用
背景技术
环境胁迫(干旱、高盐、低温和高温等)对于植物的生长发育有很大的负面影响。传统育种方法培育新的植物抗逆品种周期长，见效慢。转基因方法培育植物抗逆新品种的周期较短，同时又不影响已有的好性状，因此逐渐成为抗逆植物品种改良的重要方法。
目前通过转基因改良植物抗逆性有两类方法：(1)过量表达转录因子(Jaglo-OttosenK.R.，Gilmour S.J.，Zarka D.J.，Schabenberger O.，Tomashow M.F.(1998)Arabidopsis CBF1verexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance.Science.280：104-106.Kasuga M，Liu Q.，Miura S.，Yamaguchi-Shinozaki K.，Shinozaki K.(1999)Improving plantdrought，salt and freezing by gene transfer of a single stress--inducible transcription factor.Nature Biotech.17：287-291.Hsieh T.H，Lee J.T，Charng Y.Y，Chan M.T.(2002)Tomatoplants ectopically expressing Arabidopsis CBF 1show enhanced resistance to water deficitstress.Plant Physiol.130：618-626.)。(2)过量表达单个结构基因(Kumar S，DhingraA，Daniell H.(2004)Plastid-expressed betaine aldehyde dehydrogenase gene incarrot cultured cells，roots，and leaves confers enhanced salt tolerance.PlantPhysiology 136：2843-2854.Zhu J-K.(2001)Plant salt tolerance.Trends in PlantScience 6：66-71.)。因此，开发出更多的来源不同的提高植物抗逆性的基因有着重要的意义。
【发明内容】
本发明的目的是在于提供一个新的提高植物抗逆性的基因、重组质粒，所述基因的过量表达可明显增强转基因植物对干旱和盐的耐受性。
本发明的技术方案如下：
本发明所述提高植物抗逆性的基因，命名为ZmALDH22A1，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所表达的多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。该基因的克隆：用拟南芥AtALDH22A1的推导氨基酸序列在TIGR网站(www.tigr.org)的Maize Gene Index数据库中用tBlastn程序进行同源序列比对搜索，获得一条含完整开放阅读框(ORF)的高同源(推导氨基酸序列的一致性为77％)的EST拼接序列(TC322649)，据此序列设计引物，利用反转录PCR(RT-PCR)技术从玉米中分离到ZmALDH22A1的cDNA，如序列表中SEQ ID NO：1所示。
本发明所述重组质粒，是将SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列插入到真核表达载体中获得，上述载体可选用本领域已知的真核表达载体(如pHB或PBI121)。
将上述重组质粒转化烟草，获转基因植株。试验表明：在外加有NaCl、甘露醇、脱落酸(ABA)的MS培养基上，转基因植株要比野生型植株生长良好，尤其是本发明所述基因表达量最高的转基因系，与野生型植株相比表型差异更为明显。将转基因植株和野生型植株在干旱处理18天后，转基因植株比野生型植株生长更好，丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量的测定数据显示，转基因植株在干旱条件下受损的程度低于野生型植株。因此，本发明所述所述提高植物抗逆性的基因可在植物抗干旱、抗高盐改良中应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明为培育抗干旱、抗高盐的植物提供了一种新的重组质粒，有利于农业的可持续发展与粮食增产。
2、本发明所述基因的克隆和植物转基因均为常规方法，所需材料易于获取。
【附图说明】
图1A是Real-time PCR分析ZmALDH22A1基因在玉米植株不同组织、器官中的表达模式图；图1B是Real-time PCR分析在不同胁迫条件下(干旱、高盐和脱落酸ABA)ZmALDH22A1基因在玉米幼苗根中的诱导表达模式图。
图2是ZmALDH22A1转基因烟草阳性筛选植株的RT-PCR分析图。
图3是野生型烟草以及ZmALDH22A1转基因烟草种子在含潮霉素的MS平板发芽及成苗实验结果图。
图4是ZmALDH22A1转基因烟草植株与野生型对照植株的抗逆性比较结果图。
图5是ZmALDH22A1转基因烟草植株与野生型对照植株的抗旱性比较结果图，图中，A为正常生长条件，B为干旱条件。
【具体实施方式】
下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆；实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：提高植物抗逆性的基因的克隆
1、试剂
限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、PrimeStar热启动高保真DNA聚合酶、pMD18-T克隆载体等购自大连宝生物工程公司；Trizol试剂购自北京天为时代科技有限公司；反转录试剂盒购自日本ToYoBo公司；质粒提取及DNA回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司公司；PCR引物由上海英俊生物公司合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
2、大肠杆菌菌株和植物材料
大肠杆菌克隆菌株为E.coli JM109，购自Clontech公司。玉米材料为自交系616-1，由四川省农科院提供。
3、培养基和溶液
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。
SOB培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.58g/L，KCl 0.19g/L，100×Mg2+10mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。
SOC培养基：SOB+20mM葡萄糖。
TB buffer(临用前配置)：1M KCl 4mL，0.45M MnCl22.4mL，0.50M CaCl20.6mL，0.50M K-MES 0.5mL，ddH2O 12.5mL(总体积20mL)。
100×Mg2+溶液：20.33g MgCl2.6H20和24.65g MgSO4.7H20定容于100mL H2O，高压灭菌。
20％葡萄糖溶液：20g葡萄糖定容于100mL H2O，过滤除菌。
1M KCl溶液：7.45g KCl定容于100mL H2O，高压灭菌。
0.45M MnCl2溶液：8.9g MnCl2.4H20定容于100mL H2O，高压灭菌。
0.50M CaCl2溶液：7.35g CaCl2.2H20定容于100mL H2O，高压灭菌。
0.50M K-MES溶液：9.76g MES定容于100mL H2O，用KOH调pH至6.3，过滤除菌，分装成0.5mL每管，-20℃储存。
DMSO：分装200μl新鲜DMSO，-20℃储存。
4、实验方法
4.1质粒微量提取
1)将带有克隆载体pMD18-T质粒的E.coli JM109接种于装有5ml LB培养液(含适量抗生素)的试管中，37℃搖床培养12～16hr，以扩增质粒。
2)取1.5～5ml的菌液，于室温下10,000xg离心1min。倒净培养基，往沉淀中加入250μl的ZL-I/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。
3)往重悬混和液中加入250μl ZL-II，轻轻翻转试管4～6次混和溶液，以获得一澄清的裂解液。
4)往上述混和液中加入350ul ZL-III，并温和地上下颠倒离心管数次，直至形成白色絮状沉淀。于室温下10,000xg离心10min。
5)取一干净的Mu-Pu质粒微量分离柱装在一个2ml收集试管上(已备)。小心吸出上清，并将其转至于柱子内，确保转至柱内的上清中没有细胞杂质沉淀。于室温下10,000xg离心1min，使裂解液完全流过柱子。
6)弃去离心甩出液，加入500μl的ZL缓冲液到柱子上，室温下10,000xg离心1min洗涤柱子，确保除去残余的蛋白质以得到后面操作所需的高质量DNA。
7)弃去收集液，加入720μl用无水乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子，室温10,000xg离心10min，弃去洗涤液。
8)可选做步骤：重复步骤7，再用720μl的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子一次。
9)室温下10,000xg离心空柱1min以甩干柱子基质。
10)把柱子置于一干净的1.5ml小离心管上，直接加入50～100μl灭菌去离子水或TE缓冲液液到柱子基质上(所加的量取决于预期终产物浓度)，10,000xg离心1min以洗脱出DNA。
4.2DNA回收方案
1)处理琼脂糖凝胶-EB电泳混和物以分别分离DNA片段。任何类型或等级的琼脂糖都可以使用。
2)当带纹间的间距达到足够的量的时候，在紫外灯上小心的把所需的DNA片段切下来。这样就能保证把含DNA的凝胶尽量多的取出来
3)通过把凝胶薄片装在1.5ml小离心管中称其重量的方法，近似地确定其体积。假设其密度为1g/ml，于是凝胶的体积便可通过如下方法得到：凝胶薄片的重量为0.2g则其体积为0.2ml。加入体积为凝胶体积3～4倍的NJ缓冲液，把混和物置于55～65℃水浴中温浴7min，或至凝胶完全融化。
4)把750μl的DNA-琼脂糖溶液加到一个Mu-Pu DNA回收纯化柱上，并把柱子装在一个干凈的2ml收集管内，室温下于10,000xg离心1min，弃去液体。
5)选做步骤：用300μl NJ缓冲液来洗涤柱子，并在10,000x g下离心1min。
6)用750μl无水乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子。室温下10,000xg离心1min。
7)弃去流出液，重复第6步一次。
8)弃去液体，把空柱10,000xg离心1min以甩干柱基质残余的液体。
9)把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入30～50μl 10,000xg离心(具体取决于预期的终产物浓度)的灭菌去离子水(或者PH8.0的TE缓冲液)到柱基质上，10,000xg离心1min以洗脱DNA。
4.3玉米总RNA提取
1)液氮迅速研磨玉米叶片组织，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，剧烈震荡，室温放置5min。
2)12,000rpm离心5min。
3)取上清，按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。
4)4℃12,000g离心15min。
5)取上清，按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置10min。
6)4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
7)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
8)4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。
9)室温干燥5-10min(RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。)。
10)用50ul DEPC-H2O溶解RNA样品，55-60℃，5-10min。
4.4RT-PCR
1)RT
冰上在一个200μl EP管中加入以下组分：
5×RT Buffer 4μl
dNTP Mixture(各10mM)2μl
RNase Inhibitor(10U/μl) 1μl
Oligo(dT)20(10pmol/μl)1 μl
Total RNA Xμl
RNase-Free H2O (11-X)μl
ReverTra Ace 1μl
按以下程序进行反转录：42℃20min(反应)；99℃5min(酶变性)；4℃5min(保存)。
2)PCR
冰上在一个的200μl EP管中加入以下组分：
5×PrimeStar Buffer 10μl
dNTP Mixture(各2.5mM) 4μl
RT产物 1μl
TC306087-f3 1μl
TC306087-r3 1μl
ddH2O 32.5μl
PrimeStar 0.5μl
按以下程序进行扩增：98℃3min(预变性)；98℃10s(变性)，55℃15s(复性)，72℃2.5min(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(终延伸)。
以上述PCR产物为模板，以巢式引物TC306087-f4和TC306087-r4进行第二轮高保真PCR，延伸时间2min，其它条件同上。
引物序列如下：
TC306087-f3：5’-CGGCTGGATTCCTCACTTTAGT-3’；
TC306087-r3：5’-GGCAGCACATTGACAGTTCCTA-3’(2180bp)；
TC306087-f4：5’-AGAGCAGGTGTCGGTGTCATG-3’；
TC306087-r4：5’-TGGGGAATGGGGAGGTTTAC-3’(1878bp)。
4.5高保真PCR产物加尾以及和克隆载体pMD18-T连接
在第二轮高保真PCR产物中加1μlTaq DNA聚合酶，72℃反应15min即可。若PCR产物不纯，则必须先回收纯化目标片段，再加入适量的PCR Buffer、dNTPs和Taq DNA聚合酶进行加尾。
加尾后的PCR产物与克隆载体pMD18-T按摩尔分子数比3/1连接，反应体系如下：
10×ligase Buffer 1μl
pMD18-T(50μg/μl) 1μl
加尾的PCR产物(～150μg/μl) 1μl
Ligase(350U/μl) 1μl
ddH2O 6μl
16℃连接过夜。
4.6大肠杆菌转化
1)感受态细胞的制备
a)接种大肠杆菌单菌落于2mL SOB培养液中，37℃过夜培养；
b)转接0.5mL过夜培养物至50mL SOB培养液中，18℃剧烈震荡18～24h至A600≈0.55；
c)将培养液转入50mL离心管中，冰浴10min，4℃4000rpm离心10min；
d)去上清，加16mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞(注意：轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸混匀)，冰浴10min，4℃4000rpm离心10min；
e)去上清，加4mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞，加入280μl的DMSO，轻柔混匀，冰浴10min；
f)分装于预冷得1.5mLEP管中，液氮冻存。
2)转化
a)从液氮中取出一管感受态细胞冰浴解冻；
b)将10μl连接产物与感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；
c)42℃热冲击90s，立即冰浴1-2min；
d)加0.8mL的SOC，混匀，37℃温和摇床1h。
e)室温13,000rpm离心1min，倒掉一部分上清液，留约200μl的上清液，用枪头将上清液与细胞混匀，涂布LB+amp(50μg/ml)平板，37℃培养过夜。
4.7细胞快速裂解法鉴定重组载体
1)挑取单个转化子接种于500μl含相应抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养至A600为0.6～0.8。
2)取200μl菌液至0.5ml EP管中，13,000rpm离心1min，去上清，留约20μl上清。
3)加20μl 2×快速裂解液[0.2mol/L NaOH 50mL+SDS 0.5g，蔗糖27.2g，加双蒸水至200ml]，剧烈振荡。
4)13000rpm离心15min。
5)取5μl上清直接电泳。与对照比，电泳带滞后的即可能是重组载体。
4.8菌落PCR鉴定重组载体
经过快速裂解法鉴定的重组载体再做菌落PCR以确定插入片段是目标片段，反应体系如下：
10×PCR Buffer 2μl
Mg2+(1.5mM)1.2μl
dNTP Mixture(各2.5mM) 1.6μl
菌液 1μl
TC306087-f4 0.4μl
TC306087-r4 0.4μl
ddH2O 12.4μl
Taq DNA聚合酶 1μl
反应条件：94℃5min(预变性)；94℃40s(变性)，55℃30s(复性)，72℃2min(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(终延伸)。
对菌落PCR确定的重组载体进行测序，测序结果为序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
实施例2：Real-time PCR(实时定量PCR)分析提高植物抗逆性的基因的表达模式
1、实验材料、试剂和仪器
常规试剂和玉米材料与实施例1相同。
Real-timePCR试剂盒为大连宝生物工程公司的SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect RealTime)，荧光定量PCR仪为百乐公司的荧光定量PCR仪(Bio-Rad Laboratories，USA)。
2方法
2.1玉米材料的处理
玉米种子用自来水37℃浸泡过夜。第二天把种子放在铺有湿润滤纸的培养皿中，于25℃、16h光照/8h黑暗条件下发苗，每日加水保持滤纸湿润。10天后，即玉米苗刚长出第三片叶子时，玉米苗用不同的胁迫条件处理：将玉米苗分别在250mM NaCl和100uM ABA溶液中浸泡4h，脱水处理则将玉米苗置于干的滤纸上4h，对照组即将玉米苗在水中浸泡4h。处理后分别收集每种处理条件下的至少5株玉米苗的根、茎或叶，立即在液氮中速冻并放入-80℃低温冰箱保存，直到使用。
2.2RNA的提取、电泳及反转录
分别取各种条件处理的玉米苗的根、茎、幼叶、成熟叶、花粉、花丝和幼胚提取总RNA，提取的总RNA用DNaseI处理。根据电泳结果，取大约1μgRNA用于反转录，获cDNA(具体方法见实施例1)。
2.3Real-time PCR引物的设计
ZmALDH22A1基因的引物如下，预期扩增片段145bp。
087RT-f：5’-CAGAAGCGTGCCATCAGAATA-3’；
087RT-r：5’-AGCCTTCTACGCCAGCAAAT-3’；
内参基因为玉米actin 1基因(GenBank accession no.J01238)，其引物如下，预期扩增片段143bp。
Mac 1RT-f：5’-TTCCTAGCAGCATGAAGGTTAAA-3’；
Mac 1RT-r：5’-CGGACCAGTTTCGTCATACTCT-3’.
2.4Real-time PCR
以下所有操作必须戴一次性塑料手套，以避免污染EP管外壁而影响荧光的探测。cDNA和引物最好都稀释后再加，以尽量减少取样误差。每个样品和基因重复3次。
冰上在一个200μl的EP管中加入以下组分(总体积25μl)：
2×SYBR Premix Ex TaqTM 12.5μl
1∶15稀释的cDNA 6.5μL
1∶12稀释的087RT-f/r(10μM) 6μL
按以下程序进行扩增(采用大连宝生物工程公司提供的Real-timePCR试剂盒SYBRPremix Ex TaqTM反应条件)：95℃40s；95℃5s，60℃20s(40个循环)；95℃60s；55℃60s；55℃10s(每个循环增加0.5℃，80个循环)。
2.5Real-time PCR数据分析
Real-time PCR数据用relative expression software tool(REST)软件进行分析(2-ΔΔCt法)。用REST软件分析Real-time PCR数据的具体操作：
1)打开REST软件；
2)在手册的introduction页的粉红色区域输入目标基因(ZmALDH22A1)和内参基因(actin 1)名字；
3)在PCR efficiency页输入内参基因和目标基因用于做标准曲线(PCR效率)的Ct值数据以计算它们各自的PCR效率。如采用2-ΔΔCt法，基因的PCR效率近似为1，此步可省略；
4)在CP input+randomization test页按提示输入内参基因和目标基因的Ct值数据，点击“run Pair Wise Fixed reallocation Randomisation Test”键(红色)，计算处理样品与对照样品中目标基因归一后的表达比率、P值和标准误差；
5)在CP input+randomization test页调出表达率和P值数据，在CP variation页调出标准误差数据；
6)在excel软件中做出柱状图(详见excel软件说明)即完成数据分析。
3、结果
Real-time PCR数据分析结果显示ZmALDH22A1在根、茎、幼叶、成熟叶、花粉、花丝和幼胚中均有表达，见图1A。在根中，胁迫处理样中ZmALDH22A1的表达量相对未处理样中ZmALDH22A1的表达量均有显著性升高。其中，250mM NaCl处理样中ZmALDH22A1表达量为未处理样中ZmALDH22A1表达量的1.59倍(p＜0.01)；脱水处理样中ZmALDH22A1表达量为未处理样中ZmALDH22A1表达量的1.32倍(p＜0.05)；100μM ABA处理样中ZmALDH22A1表达量为未处理样中ZmALDH22A1表达量的2.86倍(p＜0.01)，见图1B。
实施例3：提高植物抗逆性的基因在烟草中的表达及抗逆性试验
1、材料
1.1试剂与材料
常规试剂与实施例1相同。
用于转基因的农杆菌菌株为EHA105，购自Clontech公司；转化用烟草品种为‘红花大金元’，由中国科学院成都分院生物研究所提供；植物表达载体为pHB，由上海植物生理研究所提供。
1.2培养基与溶液
YEB培养基：酵母提取物1g/L，牛肉膏5g/L，蛋白陈5g/L，蔗糖5g/L，MgS04.7H2O 0.5g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。
YEP培养基：酵母提取物10g/L，蛋白陈10g/L，NaCl 5g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。
常规用组织培养基：
2、方法
2.1ZmALDH22A1基因植物过量表达重组载体的构建
用于植物过量表达载体构建的ZmALDH22A1基因引物如下：
087-f5：CGGAAGCTTAGAGCAGGTGTCGGTGTCATG(HindIII)
087-r5：TTTGGATCCTGGGGAATGGGGAGGTTTAC(BamHI)
按以下程序进行扩增：94℃5min(预变性)；94℃40s(变性)，58℃30s(复性)，72℃40s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(终延伸)。
高保真PCR产物经电泳回收后用HindIII和BamHI双酶切，然后与用相同限制酶酶切的pHB载体连接(连接位点：HindIII和BamHI)，获含ZmALDH22A1基因的过量表达重组载体，命名为pHB-087。
2.2农杆菌感受态细胞的制备
1)挑取农杆菌单菌落于2ml的YEB液体培养基(含Rif 50μg/ml)中，28℃振荡培养过夜；
2)取过夜培养液500μl转接于50ml YEB(含Rif50μg/ml)液体培养基中，28℃振荡培养至OD600＝0.5；
3)4℃5000rpm离心5min收集菌体，加10ml 0.15M的NaCl溶液悬浮菌体，冰浴10min；
4)4℃5000rpm离心5min收集菌体，用1ml预冷的20mM CaCl2溶液悬浮菌体，冰浴10min；
5)制备好的细胞立即使用，或分装成200μl/管，液氮中速冻1min，置-70℃保存备用。
2.3农杆菌的转化
1)取200μl感受态细胞，冰上解冻；
2)加1μg构建好的pHB-087重组载体，轻弹混匀，冰浴30min；
3)液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入1ml YEB培养基，28℃慢速振荡培养4h；
4)将培养物涂布于含50μg/ml Kan和50μg/ml Rif的YEB平板上，28℃培养约48h。
2.4农杆菌阳性克隆的鉴定
挑取平板上长出的单菌落，接种于含50μg/ml Kan和50μg/ml Rif的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。
2.5农杆菌介导法转化烟草
2.5.1烟草无菌苗的准备
将烟草成熟种子用70％酒精漂洗1min；然后浸泡于活性氯含量2～4％的次氯酸钠溶液中，振荡15～20min；用无菌水洗涤4～5次，用灭菌滤纸吸干多余的水分，接种于MS基本培养基上。25℃暗培养5d，然后光照(16h光照/8h暗)培养至长出无菌苗。无菌苗可以通过组织培养快速繁殖并保存。
2.5.2转化用农杆菌菌液的制备
挑取农杆菌阳性克隆于YEB(或YEP)液体培养基(含50mg/L Rif和50mg/L Kan)，28℃、180rpm培养至OD600＝0.6～0.8。取菌液，按1～2％的比例，转入新鲜的无抗生素的液体培养基中，加100～500μM的AS(可加可不加)，28℃、180rpm培养约6h至OD600＝0.2～0.5即可用于转化。
2.5.3转化与培养
取烟草无菌苗，将叶片剪成约0.5cm×0.5cm大小的小块，于上述农杆菌菌液中浸泡5min。
取出烟草叶片，于无菌滤纸上吸干；转入MS培养基(含2.0mg/L 6-BA和0.5mg/LIAA)，共培养2～3d。
从共培养基上取出烟草叶片，于无菌滤纸上吸去多余的菌体，然后转入MS培养基(含2.0mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、50mg/L hyg和200mg/L Tim)，25℃光照(16h光照/8h暗)筛选分化培养。筛选2代，每代2周。
将筛选培养4周后的烟草幼芽转入1/2MS培养基(含50mg/L hyg和100mg/L Tim)进行生根培养。生根后的烟草植株移入花盆栽培。
2.6转基因植株的鉴定
2.6.1烟草基因组DNA的提取
1)将烟草叶片在研钵中用液氮研磨，每0.1g植物材料加600μL预热至90℃的2×CTAB缓冲液。轻轻混匀，65℃放置60min。
2)待混合物冷至室温后，加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻颠倒离心管几次混匀，室温10000rpm离心5min。
3)取上清，加0.7倍体积的异丙醇，混匀，室温放置15min沉淀DNA。
4)室温13000rpm离心10min。70％乙醇洗涤沉淀一次。
5)空气干燥5～10min，沉淀溶于50μl灭菌水。
6)取5μl基因组DNA电泳检测检测质量。
2.6.2基因组DNAPCR检测
为了确定ZmALDH22A1基因已经整合到阳性筛选烟草植株的基因组，我们以烟草基因组DNA为模板，对ZmALDH22A1基因全长cDNA和潮霉素基因片段进行了PCR扩增。ZmALDH22A1基因特异引物为087-f5和087-r5，潮霉素基因特异引物为：
Hyg-f：5′-TCGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3′；
Hyg-r：5′-GCGTCTGCTGCTCCATACAAG-3′
按以下程序进行扩增：94℃5min(预变性)；94℃40s(变性)，56℃30s(复性)，72℃40s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(终延伸)。
2.6.3RT-PCR检测
为进一步确定ZmALDH22A1基因已经整合到阳性筛选烟草植株的基因组并表达，我们以烟草叶片cDNA为模板，对ZmALDH22A1基因进行了PCR扩增，引物为087RNAi-f1和087RNAi-r1。
2.6.4潮霉素抗性实验
随机挑取三株经上述RT-PCR检测确定的烟草转基因植株(命名为ZmALDH22A1-Overexpression1、2、3，简称为转基因植株1、2、3)，将其第一代(T1)种子和野生型烟草种子(各200颗左右)表面消毒后置于含50mg/L潮霉素的MS平板上，25℃16h光照/8h暗培养。记录其发芽率和成苗率。
2.7转基因植株ZmALDH22A1基因表达量分析实验
提取烟草转基因植株转基因植株1、转基因植株2和转基因植株3和野生型烟草对照植株叶片的RNA，反转合成cDNA。以cDNA为模板，以烟草GAPDH基因(GenBankaccession no.AJ133422)为内参基因，用real-time RT-PCR方法对ZmALDH22A1mRNA进行定ZmALDH22A1基因real time RT-PCR引物为087RT-f和087RT-r(见实施例2)；
烟草GAPDH基因real time RT-PCR引物为：(预期片段大小133bp)
NgapRT-f：5’-CTCAACATTGTTTCAA ATGCTAGCT-3’
NgapRT-r：5’-CAGTTTTCTGTGTGGCTGTGATG-3’
2.8转基因和野生型幼苗于MS培养基上的抗逆性实验
将野生型烟草种子和转基因烟草的第一代(T1)种子表面消毒后置于含有不同浓度的NaCl(0mM、50mM、100mM和250mM)、甘露醇(0mM、150mM、300mM和500mM)、脱落酸(ABA)(0μM、0.5μM、1μM和2μM)的MS平板上(每皿放50颗种子)，于组培室25℃、16h光照/8h暗培养。每天统计萌芽率。待平板上转基因烟草和野生型烟草幼苗有足够差异时照相，测量根长和鲜重(测10株幼苗的平均值，重复三次测量)。
2.9丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量的测定
1)取植物叶片0.2g，液氮磨碎；加2ml 0.1％TCA(三氯乙酸)溶液，震荡混匀，置于冰上。
2)匀浆于4℃13,000rpm离心10min，上清液为样品提取液。
3)取上清液0.5ml(对照加0.5ml 0.1％TCA溶液)，加1ml含0.5％(w/v)TBA(硫代巴比妥酸)的20％TCA溶液，混匀后于沸水浴30min。
4)迅速冰浴冷却，4℃13,000rpm离心10min。取上清液测A532和A600。
5)按以下公式计算MDA含量：
MDA含量(nmol/g)＝155-1×(A532-A600)×稀释倍数÷植物组织鲜重(g)
2.10转基因和野生型植株土壤抗旱性实验
将转基因烟草的第一代(T1)种子表面消毒后置于含50mg/L潮霉素的MS平板上，野生型烟草种子表面消毒后置于MS平板上。25℃16h光照/8h暗培养。4周后，取大小相近的幼苗移栽至土中(蛭石∶营养土∶普通土＝1∶1∶1)，每两天浇一次水，每周浇一次1/8MS培养液。4周后，一部分幼苗停止浇水，另一部分正常浇水以作对照，直到差异明显，拍照，测MDA含量。
3、结果
3.1转基因植株的鉴定
3.1.1转基因烟草阳性筛选植株RT-PCR鉴定结果
在转基因植株中随机挑取9株进行RT-PCR分析，结果在6株中扩出预期大小的产物，如图2所示。
3.1.2转基因以及野生型种子在MS平板上潮霉素抗性实验结果
在含潮霉素的MS平板上，野生型烟草以及转基因烟草种子都能萌芽。但是，野生型烟草种子萌芽后却不能成苗；而转基因烟草种子不仅萌芽，且绝大部分成苗，转基因植株1、转基因植株2和转基因植株3的成苗率分别为77％、80％和78％，如图3所示。这再一次证明了转基因植株1、转基因植株2和转基因植株3确实是ZmALDH22A1转基因产物。
3.2转基因和野生型烟草幼苗的抗逆性
从图4可以看出，在含NaCl(100mM)、甘露醇(300mM)、ABA(0.5μM)的MS平板上，三株烟草转基因系的幼苗比野生型幼苗长得更好，表明转基因系的抗逆性优于野生型。
在不同浓度NaCl的MS平板上，转基因和野生型幼苗的鲜重、根长、MDA值见下表：
从表中可以看出：
1)鲜重：50mM NaCl处理后，野生型降为对照组的68.8％；转基因植株1降为对照组的68.9％；转基因植株2降为对照组的77.4％；转基因植株3降为对照组的74.8％。100mM NaCl处理后，野生型降为对照组的36.8％；转基因植株1降为对照组的38.4％；转基因植株2降为对照组的40％；转基因植株3降为对照组的39.9％。250mM NaCl处理后，野生型降为对照组的3.3％；转基因植株1降为对照组的14.3％；转基因植株2降为对照组的31.4％；转基因植株3降为对照组的31.5％。由此可见，在50mM和100mMNaCl处理条件下，转基因和野生型幼苗的鲜重之间的区别很小。但在250mM NaCl处理条件下，转基因幼苗的鲜重明显高于野生型幼苗的鲜重，尤其是ZmALDH22A1表达量较高的转基因系转基因植株2和转基因植株3。
2)根长：50mMNaCl处理后，野生型降为对照组的92.1％；转基因植株1降为对照组的91.3％；转基因植株2为对照组的96.0％；转基因植株3降为对照组的96.0％。100mM NaCl处理后，野生型降为对照组的86.1％；转基因植株1降为对照组的91.0％；转基因植株2降为对照组的95.4％；转基因植株3降为对照组的90.4％。250mM NaCl处理后，野生型降为对照组的2.5％；转基因植株1降为对照组的4.3％；转基因植株2降为对照组的7.8％；转基因植株3降为对照组的8.5％。可以看到，在低浓度(50mM)NaCl处理条件下，转基因和野生型幼苗的根长之间的区别很小。但在250mM NaCl处理条件下，转基因幼苗的根长明显大于野生型幼苗的根长，尤其是ZmALDH22A1表达量较高的转基因系转基因植株2和转基因植株3。结果与鲜重测量结果类似。
3)MDA含量：各种浓度NaCl处理条件下，相对对照组而言，转基因和野生型的MDA含量都升高了，但转基因的MDA含量较野生型而言升高的值都明显要小。50mMNaCl处理后，野生型升为对照组的169.7％；转基因植株1升为对照组的147.8％；转基因植株2升为对照组的115.0％；转基因植株3升为对照组的131.9％。100mM NaCl处理后，野生型升为对照组的204.9％；转基因植株1升为对照组的182.8％；转基因植株2升为对照组的122.0％；转基因植株3升为对照组的147.6％。250mM NaCl处理后，野生型升为对照组的249.1％；转基因植株1升为对照组的225.3％；转基因植株2升为对照组的135.6％；转基因植株3升为对照组的166.5％。转基因系转基因植株2和转基因植株3在任何浓度NaCl条件下，MDA量的升高值均明显低于野生型。转基因植株1和野生型之间的差异并不明显。
实验结果表明，在高浓度NaCl胁迫条件下，转基因幼苗明显较野生型幼苗生长地更好，并且在NaCl的耐受和转基因株系中ZmALDH22A1的表达量有很好的相关性。
3.3转基因和野生型烟草的抗旱性
实验结果见图5，从图中可以看出，在停止浇水后第18天，野生型植株明显萎焉，转基因植株1植株表型近似野生型，但转基因植株2和转基因植株3植株没有任何萎焉的迹象。实验结果表明，转基因烟草植株比野生型烟草植株更耐干旱。
【序列表】
<110>四川大学
<120>一种提高植物抗逆性的基因及其应用
<160>2
<170>PatentIn Version 3.2
<210>1
<211>1896
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>mRNA
<222>(1).....(1896)
<223>提高植物抗逆性的基因
<400>1
cggaagctta gagcaggtgt cggtgtcatg gccttctggt ggccgctgct ggtgctcgcc 60
gccgcatacg cgctctgtcg cctgctcctc ttcctcatcc cgcccaccgt cccatccatc 120
gacgtcgacg cctccgacgt gttggtcaag gaggacagct tcatctacat accgagaagg 180
ggtaaatcaa ctcagactga caaggtccaa tgctatgaac cagcgaccat gaaatacttg 240
gggtacttcc cagtggtgac tcctgatgag gtcaaggaac atgttgcaca atccaggaaa 300
gctcaaagga tatgggcaaa aagcaacttc aagcaaaggc gccagtttct tcgaattctt 360
ctcaagtata tacttgaaca tcaggatctc atatgcgagg tatcatctcg ggacactgga 421
aagactatgg ttgatgcttc attaggagag ataatgacca cctgtgagaa gattacctgg 480
cttttggatg agggcgagaa gtggctgaaa cctgaataca gatctactgg gagatcaatg 540
ctgcataaga gagcaaaagt tgagttttac cctcttggag tgatcggtgc gattgtatct 600
tggaattatc ccttccataa tgtttttaat ccagtgctag cagcagtatt ctccggtaat 660
gcagcagtta taaaggtctc agaacatgcg acttggtcgg gctgctttta ttttcgtatt 720
atacaagcag ctctttcagc tgttggtgca cctgagaatc tggtgcacat aataactggt 780
tttgcggaaa caggccaagc tcttgtatca tcagtagaca aaataatatt tgtgggatca 840
ccaggtgttg gaaaaatgat catgaaaagg gcgtcggaga ctctaatacc tgtaactctg 900
gagcttggtg gcaaagattc atttattgtg tgtgaagatg tagatttacc cagtgttgtt 960
caagttgcta ctagagctgc tctgcaatct agtgggcaga attgcgctgg tgctgaaaga 1020
ttttatgttc acgatgacat ctattctgcc tttgtttcac agatagtgaa gacagtcaaa 1080
tctataagtg ttgggccccc attatcaggc agatatgaca tgggtgcaat ctgtatgatt 1140
gagcactctg agaaacttca gaatcttgtt aatgatgctc tagacaaagg tgccgaaatt 1200
gctgtcagag ggagctttgg caatcttggt gaagatgcag ttgatcaatt tttcccacca 1260
actgtcctgg tgaatgttga tcacacaatg aaaattatgc aagaagagac atttggacct 1320
attataccaa tcatgaaatt cagttctgat gaagaggcta tcaaacttgc aaacgactca 1380
aaatatggtc ttggctgtgc tgttttttct ggcaaccaga agcgtgccat cagaatagcg 1440
tcccagttac actgtggggt agcagcaatc aatgattttg cttcaagtta catgtgccag 1500
tctttgccat tcggtggtgt taaagacagc ggattcggga gatttgctgg cgtagaaggc 1560
ttgcgagctt gctgccttgt gaagtctgtt gtagaagata gattgtggcc atatattaga 1620
acagtgatcc cgaagcctat ccagtatccc gtctcagagc atggatttga gttccagcag 1680
ttgcttgtgg agactctgta tggctatagc gtgtgggaca ggttgcggtc ccttgtgaat 1740
cttataaaga tggttaccga gcagaattct gccccggctt caaatgcgac cacgaagaaa 1800
aggcgatgag acgaatgccc ggggggttca ttgaatctgt ttatggtaag tctgatctct 1860
ggacgctgta aacctcccca ttccccagga tccaaa 1896
<210>2
<211>593
<212>PRT
<213>玉米(Zea mays)
<223>提高植物抗逆性的多肽
<400>2
MET Ala Phe Trp Trp Pro Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Tyr Ala
1 5 10 15
Leu Cys Arg Leu Leu Leu Phe Leu Ile Pro Pro Thr Val Pro Ser
20 25 30
Ile Asp Val Asp Ala Ser Asp Val Leu Val Lys Glu Asp Ser Phe
35 40 45
Ile Tyr Ile Pro Arg Arg Gly Lys Ser Thr Gln Thr Asp Lys Val
50 55 60
Gln Cys Tyr Glu Pro Ala Thr MET Lys Tyr Leu Gly Tyr Phe Pro
65 70 75
Val Val Thr Pro Asp Glu Val Lys Glu His Val Ala Gln Ser Arg
80 85 90
Lys Ala Gln Arg Ile Trp Ala Lys Ser Asn Phe Lys Gln Arg Arg
95 100 105
Gln Phe Leu Arg Ile Leu Leu Lys Tyr Ile Leu Glu His Gln Asp
110 115 120
Leu Ile Cys Glu Val Ser Ser Arg Asp Thr Gly Lys Thr MET Val
125 130 135
Asp Ala Ser Leu Gly Glu Ile MET Thr Thr Cys Glu Lys Ile Thr
140 145 150
Trp Leu Leu Asp Glu Gly Glu Lys Trp Leu Lys Pro Glu Tyr Arg
155 160 165
Ser Thr Gly Arg Ser MET Leu His Lys Arg Ala Lys Val Glu Phe
170 175 180
Tyr Pro Leu Gly Val Ile Gly Ala Ile Val Ser Trp Asn Tyr Pro
185 190 195
Phe His Asn Val Phe Asn Pro Val Leu Ala Ala Val Phe Ser Gly
200 205 210
Asn Ala Ala Val Ile Lys Val Ser Glu His Ala Thr Trp Ser Gly
215 220 225
Cys Phe Tyr Phe Arg Ile Ile Gln Ala Ala Leu Ser Ala Val Gly
230 235 240
Ala Pro Glu Asn Leu Val His Ile Ile Thr Gly Phe Ala Glu Thr
245 250 255
Gly Gln Ala Leu Val Ser Ser Val Asp Lys Ile Ile Phe Val Gly
260 265 270
Ser Pro Gly Val Gly Lys MET Ile MET Lys Arg Ala Ser Glu Thr
275 280 285
Leu Ile Pro Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asp Ser Phe Ile
290 295 300
Val Cys Glu Asp Val Asp Leu Pro Ser Val Val Gln Val Ala Thr
305 310 315
Arg Ala Ala Leu Gln Ser Ser Gly Gln Asn Cys Ala Gly Ala Glu
320 325 330
Arg Phe Tyr Val His Asp Asp Ile Tyr Ser Ala Phe Val Ser Gln
335 340 345
Ile Val Lys Thr Val Lys Ser Ile Ser Val Gly Pro Pro Leu Ser
350 355 360
Gly Arg Tyr Asp MET Gly Ala Ile Cys MET Ile Glu His Ser Glu
365 370 375
Lys Leu Gln Asn Leu Val Asn Asp Ala Leu Asp Lys Gly Ala Glu
380 385 390
Ile Ala Val Arg Gly Ser Phe Gly Asn Leu Gly Glu Asp Ala Val
395 400 405
Asp Gln Phe Phe Pro Pro Thr Val Leu Val Asn Val Asp His Thr
410 415 420
MET Lys Ile MET Gln Glu Glu Thr Phe Gly Pro Ile Ile Pro Ile
425 430 435
MET Lys Phe Ser Ser Asp Glu Glu Ala Ile Lys Leu Ala Asn Asp
440 445 450
Ser Lys Tyr Gly Leu Gly Cys Ala Val Phe Ser Gly Asn Gln Lys
455 460 465
Arg Ala Ile Arg Ile Ala Ser Gln Leu His Cys Gly Val Ala Ala
470 475 480
Ile Asn Asp Phe Ala Ser Ser Tyr MET Cys Gln Ser Leu Pro Phe
485 490 495
Gly Gly Val Lys Asp Ser Gly Phe Gly Arg Phe Ala Gly Val Glu
500 505 510
Gly Leu Arg Ala Cys Cys Leu Val Lys Ser Val Val Glu Asp Arg
515 520 525
Leu Trp Pro Tyr Ile Arg Thr Val Ile Pro Lys Pro Ile Gln Tyr
530 535 540
Pro Val Ser Glu His Gly Phe Glu Phe Gln Gln Leu Leu Val Glu
545 550 555
Thr Leu Tyr Gly Tyr Ser Val Trp Asp Arg Leu Arg Ser Leu Val
560 565 570
Asn Leu Ile Lys MET Val Thr Glu Gln Asn Ser Ala Pro Ala Ser
575 580 585
Asn Ala Thr Thr Lys Lys Arg Arg
590