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1、10申请公布号CN104087678A43申请公布日20141008CN104087678A21申请号201410355303522申请日20140723C12Q1/68200601G01N33/68200601A61K45/00200601A61K48/00200601A61K39/395200601A61P25/00200601A61P9/1020060171申请人武汉大学地址430072湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学72发明人李红良郭森卢燕云郑安康李明昌74专利代理机构武汉科皓知识产权代理事务所特殊普通合伙42222代理人常海涛54发明名称VINEXIN在治疗脑卒中疾病中的应用57摘要。
2、本发明公开一种VINEXIN在治疗脑卒中疾病中的应用，属于基因的功能与应用领域。本发明以VINEXIN基因敲除小鼠为实验对象，通过大脑中动脉缺血再灌注损伤模型研究VINEXIN基因与脑卒中的关系，结果表明与野生型对照小鼠对比，VINEXIN基因敲除小鼠脑袋梗死体积明显减少，神经功能明显好转，脑袋死亡的神经元细胞数量也明显减少。从而发现VINEXIN能够促进恶化神经功能和脑卒中的作用；因此，VINEXIN可作为药物靶标筛选保护神经功能和预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物，VINEXIN的抑制剂可用于制备保护神经功能和预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图1页1。
3、9中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图1页10申请公布号CN104087678ACN104087678A1/1页21VINEXIN作为药物靶标在筛选保护神经功能的药物中的应用。2VINEXIN作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脑卒中疾病的药物中的应用。3VINEXIN的抑制剂在制备保护神经功能的药物中的应用。4一种保护神经功能的药物，其特征在于包含VINEXIN的抑制剂。5VINEXIN的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脑卒中疾病的药物中的应用。6一种预防、缓解和/或治疗脑卒中疾病的药物，其特征在于包含VINEXIN的抑制剂。7根据权利要求3或5所述的应。
4、用或权利要求4或6所述的药物，其特征在于所述的VINEXIN的抑制剂为VINEXIN基因的SIRNA、VINEXIN基因的RNA干扰载体或VINEXIN的抗体及其他能够抑制VINEXIN表达的抑制剂中的一种。权利要求书CN104087678A1/5页3VINEXIN在治疗脑卒中疾病中的应用0001技术领域0002本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种VINEXIN在治疗脑卒中疾病中的应用，具体是在制备预防、缓解和/或治疗脑卒中疾病的药物中应用。背景技术0003脑卒中疾病是全球第四大致死因素，仅次于心血管疾病、肿瘤和慢性下呼吸道疾病，也是最主要的导致终生残疾的致病因素之一。其中，约80的患。
5、者为缺血性脑卒中，主要发病原因是大脑血管阻塞或脑出血引起脑组织供血供氧不足。据预测，2005年至2050年美国用于脑卒中治疗的费用按2005年购买力评估约为1520亿美元，给经济和健康造成了巨大的负担。在中国，随着经济发展、人民生活方式转变和人口老龄化，近年来脑卒中发病率逐年升高。我国每年约有160万人死于脑卒中，死亡率为157/10万人，已经超过心血管疾病并成为最主要的致死因素和成人致残因素。与其他国家相似，缺血性脑卒中是我国最常见的脑卒中类型，约占所有脑卒中的4379。因此脑卒中是现在以及将来很长一段时间内人类必须面对的重大公共卫生问题之一。0004多数研究认为，恢复脑组织供血是治疗脑缺血。
6、最有效的方法。尽管1996年起组织纤溶酶原激活剂（TPA）即批准用于缺血性脑卒中治疗，迄今为止其仍然是美国药监局（FDA）唯一审核通过的溶栓药物。因为随时间延长出血风险增加，TPA的治疗时间窗仅为45小时；考虑到缺血性和出血性脑卒中在早期影像学不易鉴别，进一步延误了患者接受TPA治疗的机会。目前只有小于5的缺血性脑卒中患者使用TPA溶栓治疗。此外，研究发现脑组织如果长时间严重缺血缺氧，即使在后期恢复脑血流仍会对脑组织造成不可逆转的损伤，因此当前仍迫切需要研究针对缺血缺氧和（或）再灌注所致病理生理学事件的治疗策略。0005自20世纪90年代以来，研究保护神经和脑组织的治疗策略一直是脑卒中治疗的热。
7、点，这些策略不仅可以延长TPA的治疗时间窗，也可以减轻缺血再灌注诱导的脑组织损伤。神经元细胞是中枢神经系统重要的组成部分，但其高代谢率降低了对缺血缺氧环境耐受能力，因此较其他神经血管元件组分更易受到损伤。目前组织纤溶酶原激活剂（TPA）纤溶的治疗仍是缺血性脑卒中的主要治疗手段，但其仅45小时长的时间窗限制大部分患者只能接受对症治疗。研究表明，神经元保护策略可以在脑缺血损伤后较长时间内改善大脑功能，减少神经元细胞损失。凋亡是大脑缺血/再灌注过程中细胞死亡的基本机制之一，但其调控机制仍未完全阐明。因此，研究大脑缺血/再灌注时神经元细胞凋亡生存的分子机制，将有助于为神经元保护提供新的治疗策略和方法。。
8、0006VINEXIN和其结合蛋白粘着斑蛋白（VINCULIN）是组成细胞粘附的蛋白质网络的重要组成成分，VINEXIN与VINCULIN的结合直接影响粘着斑的形成，并调控细胞细胞、细胞胞外基质的粘附，并最终影响细胞的迁移、分化、分裂和凋亡等一系列重要细胞行说明书CN104087678A2/5页4为。VINEXIN包括3个亚型，VINEXIN、和，这3种亚型的蛋白都在其N端有一个SOHO（SORBINHOMOLOGY）结构域和C端的三个SH3（SRCHOMOLOGY3）结构域，分子结构都高度保守。VINEXIN在多处表达，尤其在心脏的表达水平很高。研究发现VINEXIN基因敲除的小鼠，对主动脉。
9、缩窄手术所引起的心肌肥厚反应更加敏感，这表明VINEXIN在高负荷所引起的心肌重构和衰竭反应中是一个很重要的调节蛋白（KECHEN,ETALVINEXINPROTECTSAGAINSTCARDIACHYPERTROPHYBYBLOCKINGTHEAKTDEPENDENTSIGNALLINGPATHWAYBASICRESCARDIOL,2013,108338）。到目前为止尚无文献报道有关VINEXIN在脑卒中疾病中应用的内容。发明内容0007为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的是确定VINEXIN的表达与脑卒中疾病之间的相互关系，提供一种VINEXIN作为药物靶标在筛选保护神经功能和预防。
10、、缓解和/或治疗脑卒中的药物中的应用，进而提供一种VINEXIN的抑制剂在制备保护神经功能和预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物中的应用。0008本发明的目的通过下述技术方案实现本发明以VINEXIN基因敲除小鼠为实验对象，通过小鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤造成脑卒中模型，研究VINEXIN基因与脑卒中的关系，结果表明与野生型小鼠（对照组）相比，VINEXIN基因敲除小鼠梗死体积明显降低，神经功能明显好转，死亡神经细胞数量减少。这提示VINEXIN具有恶化神经功能的作用，能加重促进脑卒中的发展，为研究预防、缓解和/或治疗脑卒中疾病的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。0009因此，VINEXIN。
11、基因可作为药物靶点，构建VINEXIN基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物；VINEXIN基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗脑卒中的目的。例如以VINEXIN为靶基因，设计可干扰VINEXIN表达的双链SIRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA干扰的方法使VINEXIN基因沉默来治疗脑卒中；还可以设计并构建VINEXIN的突变体，注射后进入细胞，竞争VINEXIN原形的作用底物，从而抑制VINEXIN的功能，起到治疗目的；此外，还可以以VINEX。
12、IN为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用VINEXIN基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制VINEXIN的分子，从而为脑卒中的治疗提供新的治疗性分子。0010针对VINEXIN的上述功能，提供VINEXIN作为药物靶标在筛选保护神经功能的药物中的应用。0011针对VINEXIN的上述功能，提供VINEXIN作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物中的应用。0012针对VINEXIN的上述功能，提供VINEXIN的抑制剂在制备保护神经功能的药物中的应用。0013针对VINEXIN的上述功能，提供VINEXIN的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物中。
13、的应用。0014一种保护神经功能的药物，包含VINEXIN的抑制剂。说明书CN104087678A3/5页50015一种预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物，包含VINEXIN的抑制剂。0016所述的VINEXIN的抑制剂优选为VINEXIN基因的SIRNA、VINEXIN基因的RNA干扰载体，VINEXIN的抗体及其他能够抑制VINEXIN表达的抑制剂中的一种。0017本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果（1）本发明发现VINEXIN的新功能，即VINEXIN能够恶化脑卒中的作用。0018（2）基于VINEXIN在恶化脑卒中疾病中的功能，其为研制预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物提供靶标。00。
14、19（3）VINEXIN的抑制剂可用于制备保护神经功能和预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物。附图说明0020图1是WT和VINEXINKO小鼠大脑缺血/再灌注损伤严重程度的评估结果图。A为TTC染色结果图，B为脑梗体积统计柱状图，C为神经功能评分统计柱状图（P005VS野生型I/R24H组，P005VS野生型I/R72H组）。0021图2是FLUOROJADEB染色检测脑组织梗死周边区神经元细胞凋亡情况测定结果图。具体实施方式0022下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。0023实验用动物及饲养实验动物选用雄性，1112周龄，体重在2530G，背景为C57B。
15、L/6的野生型小鼠（WT，购自北京华阜康生物科技有限公司，质量合格证号949431）、VINEXIN基因敲除小鼠（VINEXINKO，购自日本RIKEN公司，货号01732）。0024饲养环境所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。SRF级大小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件室温在2224之间，湿度在4070之间，明暗交替照明时间为12H，自由饮水摄食。0025实施例1小鼠脑梗死模型（I/R）获得1实验动物分组野生型小鼠及VINEXIN基因敲除小鼠，通过大脑中动脉缺血再灌注建立脑梗死模型（I/R）。随机分为2组，每组10只小鼠野生型小鼠I/R术组（WTI/。
16、R）、VINEXIN基因敲除小鼠I/R术组（KOI/R）。00262线栓法脑梗死I/R手术采用MCAO（MIDDLECEREBRALARTERYOCCLUSION，大脑中动脉闭塞）模型操作流程（1）抓取小鼠，使用3异氟烷麻醉小鼠，8硫化钠脱去颈部的鼠毛，颅顶鼠毛用手术剪迅速剪掉，3活力碘消毒颈部及颅顶皮2次，75酒精脱碘1次。0027（2）在小鼠的颅顶部位横向切口，暴露颅骨，用镊子轻轻剥离颅骨表面的结缔组织。将激光多普勒血流仪的光纤探头用生物胶固定在前囟后方2MM、左侧5MM的部位。0028（3）将小鼠仰卧固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉。
17、（ECA）和颈内动脉（ICA）。用微动脉夹暂时夹闭ICA、CCA，在说明书CN104087678A4/5页6ECA远心端结扎和剪一小口，将线栓由剪口送入ICA，当线栓进入深度在911MM左右至血流下降遇阻力停，整个过程必须维持小鼠的肛温在3705。0029（4）从线栓进入脑血管至血流下降遇阻力时开始计时，45MIN后将线栓拔出，并将ECA近心端结扎，迅速松开CCA处动脉夹。注意观察血流恢复情况，选择血流下降75以上，血流恢复达70以上的小鼠纳入实验。0030（5）缝合小鼠颈部及头部皮肤，并用活力碘消毒伤口。手术结束后，将小鼠放在温箱中，箱温维持在28，给水和饲料，分别在24H、72H取材。00。
18、31实施例2脑梗死模型（I/R）小鼠脑梗死体积测定脑缺血/再灌注损伤严重程度的评估指标主要包括大脑梗死体积和神经功能评分，这些指标均与缺血/再灌注损伤严重程度正相关。0032（1）分别在手术后24H、72H取材前进行神经功能及行为学评分；基于BERDERSON神经功能评分改进方法（9分制）0分无神经受损的症状；1分提尾时对侧前肢蜷曲，或者不能完全到达患侧前肢；2分提尾时对侧肩膀内收；3分平推向对侧推动时阻力下降；4分可自发的向各个方向运动，但在脱尾巴时只向对侧转弯；5分自发运动时转圈或只向对转；6分无自主运动，只在刺激时运动；7分无自主运动，刺激时也无运动；8分与脑缺血有关的死亡。0033（2。
19、）抓取小鼠，腹腔注射3戊巴比妥钠麻醉小鼠，取脑。0034（3）将取下的脑组织放入1MM小鼠脑模，置于20冰箱冻存。0035（4）脑组织2,3,5三苯基氯化四氮唑（2,3,5TRIPHENYLTETRAZOLIUMCHLORICEJ，TTC）染色从20冰箱取出脑组织，立即切成1MM厚的切片，共切7片。将切片立即置于10ML2TTC溶液中，37恒温孵育10MIN。正常脑组织染色后呈鲜红色，而梗死区呈苍白色。0036（5）用10中性福尔马林溶液固定脑组织切片，大体拍照。0037（6）脑梗体积计算（IMAGEPROPLUS60软件）梗死体积（对侧大脑半球体积梗死侧未梗死体积）/（对侧大脑半球体积2）1。
20、00；总梗死体积为各自7张大脑切片结果数据之和。0038TTC是脂溶性光敏感复合物，它是呼吸链中吡啶核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，呈苍白色。0039TTC染色结果如图1A和B所示，经过I/R缺血45MIN再灌注24小时后VINEXINKO小鼠梗死体积较野生型小鼠降低，且这种保护作用在I/R术后72小时仍然持续，脑组织梗死比野生型小鼠均低；而神经功能评分在I/R术后24小时、72小时均比野生型小鼠均低（图1C）。表明VINEXIN基因的缺失可减少缺血再灌注损伤引起的脑卒中小鼠的大脑梗死体积，可保护神经功能。0040实施例3脑组织。
21、梗死周边区神经元细胞凋亡情况测定说明书CN104087678A5/5页71脑组织冰冻切片制备（1）抓取小鼠，腹腔注射3戊巴比妥钠麻醉小鼠。0041（2）开胸暴露心脏，用注射针头穿刺入左心室，同时剪开右心房。0042（3）用PBS（001M，PH74）100MMHG压力灌流至肝脏变白后，用4多聚甲醛灌流15MIN。0043（4）开颅迅速取出小鼠大脑，室温4多聚甲醛后固定68H。0044（5）切除脑组织的嗅球和小脑，再延正中线将大脑分为先后两个部分，用先前的固定液再固定15MIN。0045（6）随后浸没于含30蔗糖的PBS（001M，PH74）中，4冰箱沉底过夜。0046（7）30蔗糖与OCT包埋。
22、剂按11（V/V）混合后，倒适量到包埋框中，将前一步的组织取出，在纱布上吸去液体后在该包埋框中浸泡一会儿，再将其转入到先已加入2滴OCT的另一个包埋框中，调整组织的位置，使其正好位于包埋框的正中。0047（8）将盛组织的包埋框，移入干冰中，尽量使其处于水平位，稍待一会儿后，继续加入OCT，浸没组织一定的高度，待OCT凝固后，将其储存于80的冰箱中。0048（9）用冰冻切片机的标准程序切5M的冰冻切片备用。00492FJB（FLUOROJADEB）染色（1）将冰切组织切片在烘箱中烘干1小时；（2）1NAOH80无水乙醇5MIN；（3）70无水乙醇2MIN；（4）DDH2O2MIN；（5）FLOU。
23、ROJADEB稀释液（AG310,MILLIPORE,BILLERICA,MA），室温，避光20MIN；（6）DDH2O1MIN3；（7）在烘箱中烘片510MIN；（8）二甲苯1MIN；（9）封片，拍照。0050脑组织梗死周边区神经元细胞凋亡情况测定结果见图2所示，本实施例检测了VINEXINKO小鼠和野生型小鼠I/R术后24小时脑组织梗死周边区神经元细胞凋亡情况。FLUOROJADEB细胞凋亡检测显示，VINEXINKO组小鼠的凋亡细胞数量明显比WT组小鼠少，这表明VINEXIN与神经元细胞缺血再灌注时死亡相关。这些结果表明，VINEXIN的缺失可以减少神经元细胞的凋亡。0051研究结果表明，在大脑中动脉缺血再灌注引起的损伤中，VINEXIN敲除后的小鼠梗死体积显著减少，神经功能明显好转，凋亡的神经细胞数量也明显减少，这说明VINEXIN敲除可保护神经功能，改善脑卒中；VINEXIN在脑卒中疾病模型中有着重要的恶化作用。0052上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104087678A1/1页8图1图2说明书附图CN104087678A。