一种高特异性的利巴韦林人工抗原的制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410573952.2 (22)申请日 2014.10.24 C07H 19/056(2006.01) C07H 1/00(2006.01) C07K 14/765(2006.01) C07K 14/795(2006.01) C07K 14/77(2006.01) C07K 16/44(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/543(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号江南大学食品学院 (72)发明人 匡华 彭双 胥传来 徐丽广 。

2、马伟 刘丽强 宋珊珊 吴晓玲 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32104 代理人 时旭丹 刘品超 (54) 发明名称 一种高特异性的利巴韦林人工抗原的制备方 法 (57) 摘要 一种高特异性的利巴韦林人工抗原的制备方 法， 属于生物化工技术领域。本发明包括如下步 骤 ： 利巴韦林溶解于无水 DMF 和无水吡啶的混合 液中， 加入琥珀酸酐， 在 60水浴条件下反应， 并 于酸性条件下重结晶生成利巴韦林半抗原。将半 抗原上的羧基与载体蛋白上的氨基进行偶联， 得 到完全抗原。实验结果表明， 用本发明的抗原免 疫动物得到的抗血清效价可达 81000， 检测限为 0.1。

3、ng/mL， 半抑制浓度为 1ng/mL。产生的抗体特 异性高、 灵敏度高。 本发明弥补了现有利巴韦林抗 原合成技术的空白， 得到了一种高特异性的利巴 韦林人工抗原的抗原或抗体， 具有广阔的应用前 景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104387431 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 104387431 A 1/1 页 2 1. 一种利巴韦林半抗原， 其分子结构式如式所示 （式） ， 其是由利巴韦林为原料， 在利巴韦林分子的 5- 号位羟基一端接出活性羧基，。

4、 得到单一 特异性结构的利巴韦林羧基衍生物， 该衍生物为利巴韦林半抗原。 2. 一种利巴韦林完全抗原， 其特征在于 ： 是权利要求 1 所述利巴韦林半抗原与载体蛋 白的偶联物。 3. 根据权利要求 2 所述的利巴韦林完全抗原， 其特征在于 ： 所述载体蛋白为牛血清白 蛋白 BSA、 匙孔血蓝蛋白 KLH、 血蓝蛋白 LPH、 鸡卵清白蛋白 OVA、 人血清白蛋白 HAS 中的一 种。 4. 权利要求 1 所述的利巴韦林半抗原的制备方法， 其特征在于 ： 包括如下步骤 ： 100mg 利巴韦林溶解于 5mL 无水 DMF 和 5mL 无水吡啶的混合液中， 加入 50mg 琥珀酸酐后， 60水 浴。

5、反应 12h， 最后于 pH 为 3， 0条件下重结晶生成利巴韦林半抗原。 5. 权利要求 2 所述的利巴韦林完全抗原的制备方法， 其特征在于 ： 将利巴韦林半抗原 上的羧基与载体蛋白上的氨基进行偶联， 得到利巴韦林完全抗原， 步骤如下 ： （1） 将利巴韦林半抗原， 用超纯水溶解， 与 NHS， EDC 按摩尔比为 1: 2: 2 混合， 在室温 25下搅拌反应 12h 进行活化 ； 取牛血清蛋白， 利巴韦林半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为 80:1， 用 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解， 其中溶解后的蛋白浓度大于 3mg/mL ； 将活化的利 巴韦林半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中， 室。

6、温下反应24h， 用PBS缓冲液透析2天， 期间换 水 4 次， 即得到利巴韦林完全抗原 ； 或 （2） 将利巴韦林半抗原， 用超纯水溶解， 0预冷 30min， 0下与三正丁胺 , 氯甲酸 异丁酯按摩尔比为 1: 1.5: 1.5 混合 , 0反应 1h 进行活化 ； 取牛血清蛋白， 利巴韦林半 抗原与牛血清蛋白的摩尔比为60:1， 用 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解， 0预冷30min， 其 中溶解后的蛋白浓度大于 3mg/mL ； 在 0条件下， 将活化的利巴韦林半抗原溶液慢速滴加 到蛋白溶液中， 0条件下反应 1h， 然后室温下反应 24h ； 用 PBS 缓冲液透析 2 天，。

7、 期间换水 4 次， 即得到利巴韦林完全抗原。 6. 根据权利要求 5 所述方法， 其特征在于 ： 所述载体蛋白牛血清白蛋白 BSA 被替换为 匙孔血蓝蛋白 KLH、 血蓝蛋白 LPH、 鸡卵清白蛋白 OVA、 人血清白蛋白 HAS 之一种。 7. 权利要求 2 所述利巴韦林完全抗原的应用， 其特征在于在制备利巴韦林抗体中的应 用， 免疫动物得到抗体。 8. 根据权利要求 7 所述的利巴韦林完全抗原的应用， 其特征在于 ： 所述抗体为多克隆 抗体和 / 或单克隆抗体。 9. 权利要求 8 所述抗体在检测利巴韦林中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104387431 A 2 1/5 页 3 一。

8、种高特异性的利巴韦林人工抗原的制备方法 技术领域 0001 一种高特异性的利巴韦林人工抗原的制备方法， 属于生物化工技术领域。 背景技术 0002 利巴韦林为抗病毒药物， 是广谱强效的抗病毒药物， 由于其毒副作用强， 易引起免 疫系统损伤和致畸。早在 2005 年农业部就明确规定禁止利巴韦林等抗病毒兽药的销售和 使用。 0003 2012 年底媒体曝出了 “速生鸡” 事件， 某些肉鸡养殖企业违反国家兽药管理条例， 在养殖过程中喂食利巴韦林等人用抗病毒药品， 引起了人们极大的关注。目前我国对于动 物源性食品中利巴韦林残留量检测的相关研究报道甚少， 更未制定或立项国家标准和行业 标准， 国际上也无。

9、特定限量要求及相应检测方法。 因此， 建立快速检测利巴韦林在动物组织 中残留量的方法已迫在眉睫。 0004 利巴韦林的化学结构式如式 I 所示。 0005 ( 式 I), 目前我国对利巴韦林的检测方法主要有高效液相色谱法 (HPLC)、 液质联用法 （LC/MS） 等。仪器分析方法存在样品须经多步稀释、 过滤、 提取， 制备复杂、 繁琐的缺点。尽管仪器方 法是利巴韦林检测的确证方法， 但是由于其操作繁琐， 以及长时间的样本前处理过程， 导致 检测成本高， 周期长， 无法满足大批量样本快速筛查， 以及现场快速检测的要求。 ELISA和胶 体金试纸条法属于免疫分析技术， 具有较高的灵敏度和特异性，。

10、 检测时对样本的纯度要求 不高而且操作简便， 适用于大量样本的现场快速检测。 0006 本发明的半抗原是在利巴韦林分子的 5- 号位羟基一端接出活性羧基， 得到单一 特异性结构的利巴韦林羧基衍生物， 该衍生物为利巴韦林半抗原， 将半抗原与载体蛋白偶 联最后形成完全抗原。 发明内容 0007 本发明的目的 ： 针对现有利巴韦林抗原合成技术的空白， 提供一种新型的利巴韦 林半抗原和完全抗原合成方法， 使得制备高特异性的利巴韦林单克隆抗体成为可能。 0008 本发明提供的利巴韦林半抗原化合物， 具有式所示分子结构。 说 明 书 CN 104387431 A 3 2/5 页 4 0009 本发明的技术。

11、方案 ： 合成路线及方案如下 ： 一种利巴韦林半抗原， 其分子结构式如式所示 （式） ， 利巴韦林半抗原合成反应方程式为 ： 其是由利巴韦林为原料， 在利巴韦林分子的 5- 号位羟基一端接出活性羧基， 得到单一 特异性结构的利巴韦林羧基衍生物， 该衍生物为利巴韦林半抗原。 0010 一种利巴韦林完全抗原， 是所述利巴韦林半抗原与载体蛋白的偶联物。 0011 所述载体蛋白为牛血清白蛋白 BSA、 匙孔血蓝蛋白 KLH、 血蓝蛋白 LPH、 鸡卵清白蛋 白 OVA、 人血清白蛋白 HAS 中的一种。 0012 所述的利巴韦林半抗原的制备方法， 包括如下步骤 ： 100mg 利巴韦林溶解于 5mL 。

12、无 水 DMF 和 5mL 无水吡啶的混合液中， 加入 50mg 琥珀酸酐后， 60水浴反应 12h， 最后于 pH3 酸性条件 0下重结晶生成利巴韦林半抗原。 0013 所述的利巴韦林完全抗原的制备方法， 包括如下步骤 ： （1） 将利巴韦林半抗原， 用超纯水溶解， 与 NHS， EDC 按摩尔比为 1: 2: 2 混合， 在室温 25下搅拌反应 12h 进行活化 ； 取牛血清蛋白， 利巴韦林半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为 80:1， 用 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解， 其中溶解后的蛋白浓度大于 3mg/mL ； 将活化的利 巴韦林半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中， 室温下反应24h，。

13、 用PBS缓冲液透析2天， 期间换 水 4 次， 即得到利巴韦林完全抗原 ； 或 （2） 将利巴韦林半抗原， 用超纯水溶解， 与三正丁胺 , 氯甲酸异丁酯按摩尔比为 1: 1.5: 1.5混合, 0反应1h进行活化 ； 取牛血清蛋白， 利巴韦林半抗原与牛血清蛋白的摩 尔比为60:1， 用 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解， 0预冷30min， 其中溶解后的蛋白浓度大 于 3mg/mL ； 在 0条件下， 将活化的利巴韦林半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中， 0条件 说 明 书 CN 104387431 A 4 3/5 页 5 下反应 1h， 然后室温下反应 24h ； 用 PBS 缓冲液透析。

14、 2 天， 期间换水 4 次， 即得到利巴韦林完 全抗原。 0014 所述利巴韦林完全抗原的制备方法， 所述载体蛋白牛血清白蛋白 BSA 被替换为匙 孔血蓝蛋白 KLH、 血蓝蛋白 LPH、 鸡卵清白蛋白 OVA、 人血清白蛋白 HAS 之一种。 0015 所述利巴韦林完全抗原的应用， 在制备利巴韦林抗体中的应用， 免疫动物得到抗 体。 0016 所述抗体为多克隆抗体和 / 或单克隆抗体。 0017 所述抗体在检测利巴韦林中的应用。 0018 得到的利巴韦林完全抗原， 将利巴韦林完全抗原透析， 然后进行丙烯酰胺凝胶电 泳鉴定 （图 1） 。 0019 所述的载体蛋白为 ： 牛血清白蛋白 BSA。

15、、 阳离子化的牛血清白蛋白 cBSA、 匙孔血蓝 蛋白 KLH、 血蓝蛋白 LPH、 鸡卵清白蛋白 OVA、 人血清白蛋白 HSA。 0020 上述利巴韦林半抗原或完全抗原化合物在制备利巴韦林抗体中的应用也属于本 发明的保护范围。 0021 上述利巴韦林完全抗原化合物免疫动物得到的抗体也属于本发明的保护范围， 所 述抗体为多克隆抗体和单克隆抗体。 0022 上述利巴韦林半抗原或完全抗原化合物或抗体在检测利巴韦林中的应用也属于 本发明保护的范围。 0023 本发明的有益效果 ： 本发明是全新的利巴韦林完全抗原合成方法， 完全抗原呈现出的特异性的利巴韦林抗 原决定簇， 使得筛选出高特异性的利巴韦林。

16、单克隆抗体成为可能。 0024 实验结果表明， 用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达 81000， 检测限为 0.1ng/mL， 半抑制浓度为1ng/mL。 产生的抗体特异性高、 灵敏度高。 本发明的抗原或抗体可 用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法， 从而用于快速检测食品中的利 巴韦林的残留。 附图说明 0025 图 1、 利巴韦林完全抗原电泳图。 具体实施方式 0026 下述实施例中所使用的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 0027 下述实施例中所使用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0028 实施例 1 利巴韦林半抗原的制备 利巴韦林。

17、 100mg， 溶解于 5mL 无水 DMF 和 5mL 无水吡啶， 加入 50mg 琥珀酸酐， 60回流 反应 12h， 并于 pH 约为 3， 0条件下重结晶后生成利巴韦林半抗原。静置重结晶， 得到白色 沉淀， 离心烘干得利巴韦林半抗原。 0029 实施例 2、 利巴韦林完全抗原的制备 取 10mg 利巴韦林半抗原， 加入 2mL 超纯水溶解， 再分别加入 NHS， EDC（半抗原、 NHS、 EDC 的摩尔比为 1: 2: 2） ， 室温下， 混匀， 在室温 25下反应 12h 进行活化。取 25mg 牛血 说 明 书 CN 104387431 A 5 4/5 页 6 清蛋白 （半抗原与。

18、牛血清蛋白的摩尔比为 80:1） ， 加入 5mL 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液。将 活化的利巴韦林半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中， 室温下反应 24h。用 PBS 缓冲液透析 2 天， 期间换水 4 次， 即得到利巴韦林完全抗原。 0030 实施例 3、 利巴韦林完全抗原的制备 取9mg利巴韦林半抗原， 加入2mL超纯水溶解， 0预冷30min。 0下， 分别加入三正丁 胺 , 氯甲酸异丁酯 （半抗原、 三正丁胺、 氯甲酸异丁酯的摩尔比为 1: 1.5: 1.5） , 0反应 1h。 取30mg 牛血清蛋白 （半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为60:1） ， 加入5mL 0.1M pH9.6。

19、 碳 酸盐缓冲液， 0预冷 30min。在 0条件下， 将活化的半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中， 0条件下反应 1h， 然后室温下反应 24h。用 PBS 缓冲液透析 2 天， 期间换水 4 次， 即得到利 巴韦林完全抗原。 0031 实施例 4、 利巴韦林抗血清的制备 以实施例 3 制得的抗原为免疫原， 选用 6-8 周龄， 雌性 BALB/C 小鼠为免疫动物， 采用弗 氏佐剂进行免疫， 免疫小鼠5只。 弗氏佐剂免疫方法为 ： 首免取适量免疫原与等体积弗氏完 全佐剂混合， 乳化好后经颈背部皮下多点注射免疫， 每间隔 3 周加强免疫一次。 0032 实施例 5、 利巴韦林抗血清的测定 一、 采。

20、用间接 ELISA 方法检测血清效价， 具体操作步骤如下 ： 1) 包被 ： 将实施例 3 中的抗原用 0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从 10g/mL 开始倍比稀 释， 100L/ 孔， 37反应 2h。 0033 2) 洗涤 ： 将板内溶液倾去， 甩干， 并用洗涤液洗涤 3 次， 每次 3min。 0034 3) 封闭 ： 拍干后， 加入 200L / 孔封闭液， 37反应 2h。洗涤后烘干备用。 0035 4) 加样 ： 将抗血清从 1:1000 开始倍比稀释， 并加入到各稀释度的包被孔中， 100L / 孔， 37反应 1h ； 充分洗涤后， 加入 1:3000 稀释的 HRP- 。

21、羊抗鼠 IgG， 100L / 孔， 37反应 1h。 0036 5) 显色 ： 将酶标板取出， 充分洗涤后， 每孔加入 100ul 的 TMB 显色液， 37避光反 应 15min。 0037 6) 终止和测定 ： 每孔加入 100L 终止液以终止反应， 然后用酶标仪测定各孔的 OD450值。 0038 7) 结果判读 ： 以 OD450值大于或等于阴性对照孔的 2.1 倍 （即 P/N 2.1） 所对应的 血清最高稀释倍数即为血清的 ELISA 效价。 0039 二、 最低检测限、 半数抑制以及特异性的检测 具体操作步骤如下 ： 1)用上述的间接ELISA方阵滴定法确定包被原和抗体的工作浓。

22、度， 以OD450值在1.5左 右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。 0040 2) 包被 ： 将包被原用包被缓冲液稀释至最适工作浓度， 100L / 孔， 37反应 2h。 0041 3) 洗涤和封闭 ： 方法操作同上述间接 ELISA 法。 0042 4) 配利巴韦林标准溶液 ： 将利巴韦林标准品用 0.01mol/L， pH7.4 的 PBS 溶液配制 成 5mg/mL 的母液， 然后， 在加样前， 再用 0.01mol/L， pH7.4 的 PBS 溶液倍比稀释成需要浓 度。 0043 5)加样 ： 每孔加入50L倍比稀释的利巴韦林各浓度标准品， 然后再加入50L /孔 说 明 。

23、书 CN 104387431 A 6 5/5 页 7 最适稀释倍数的抗血清， 37反应 1h。充分洗涤后， 加入 1:3000 稀释的 HRP- 羊抗鼠 IgG， 100L / 孔， 37反应 1h。 0044 6) 显色反应 ： 将酶标板取出， 充分洗涤后， 每孔加入 100L 的 TMB 显色液， 37避 光反应 15min。 0045 7）终止和测定 ： 每孔加入 100L 终止液以终止反应， 然后用酶标仪测定各孔的 OD450值。 0046 8） 数据处理 ： 以利巴韦林各浓度的对数为横坐标， 以利巴韦林各浓度对应的 OD 值 为纵坐标， 绘制标准曲线， 计算半数抑制浓度 （IC50， 即 OD450值从零标准溶液对应的 A0 下降 到 50% 时所对应的标准品浓度） ， 从而判定抗血清对利巴韦林是否具有特异性。 0047 结果显示， 四免后， 小鼠抗血清效价可达81000， 检测限为0.1ng/mL， 利巴韦林 IC50 为 1ng/mL。 说 明 书 CN 104387431 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 104387431 A 8 。