一种利用抗核基质蛋白22抗体快速检测膀胱癌的免疫层析试纸及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104330565 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104330565 A (21)申请号 201410574169.8 (22)申请日 2014.10.24 G01N 33/574(2006.01) (71)申请人 浙江东方基因生物制品有限公司 地址 313000 浙江省湖州市安吉县经济开发 区健康医药产业园吉二路 (72)发明人 张华 方效良 (74)专利代理机构 湖州金卫知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 33232 代理人 裴金华 (54) 发明名称 一种利用抗核基质蛋白 22 抗体快速检测膀 胱癌的免疫层析试纸及其制备方法 (57) 。

2、摘要 本发明属于体外诊断技术领域， 尤其涉及一 种利用抗核基质蛋白 22 抗体快速检测膀胱癌的 免疫层析试纸， 包括样品垫 1、 结合垫 2、 硝酸纤维 素膜 3、 吸水纸 4 和底板 5 ； 硝酸纤维素膜 3 在所 述底板 5 的中部， 在所述硝酸纤维素膜 3 沿底板 的一端依次为结合垫 2、 样品垫 1， 在所述硝酸纤 维素膜3沿底板的另一端为吸水纸4 ； 硝酸纤维素 膜3包含包被有抗核基质蛋白22抗体的检测区和 包被有抗 IgG 抗体的质控区 ； 检测区设有检测线 （T)， 质控区设有质控线 （C) ； 结合垫2上包被有胶 体金标记的抗核基质蛋白 22 抗体或乳胶标记的 抗核基质蛋白 2。

3、2 抗体或胶体硒标记的抗核基质 蛋白22抗体。 本发明具有使用简便、 无创， 可作为 膀胱癌的临床辅助诊断及病情的检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104330565 A CN 104330565 A 1/1 页 2 1. 一种利用抗核基质蛋白 22 抗体快速检测膀胱癌的免疫层析试纸， 其特征在于， 所述 试纸包括样品垫 (1)、 结合垫 (2)、 硝酸纤维素膜 (3)、 吸水纸 (4) 和底板 (5) ； 所述硝酸纤维素膜。

4、 (3) 在所述底板 （5） 的中部， 在所述硝酸纤维素膜 (3) 沿底板的一 端依次为结合垫 （2） 、 样品垫 （1） ， 在所述硝酸纤维素膜 (3) 沿底板的另一端为吸水纸 （4） ， 且每相邻两者之间部分叠合 ； 所述硝酸纤维素膜 （3） 包含包被有抗核基质蛋白 22 抗体的检测区和包被有抗 IgG 抗 体的质控区 ； 所述硝酸纤维素膜 （3） 靠近吸水纸 （4） 一端为质控区， 另一端为检测区 ； 所述 检测区设有检测线 （T） ， 所述质控区设有质控线 （C） ； 所述的结合垫 （2） 上包被有胶体金标记的抗核基质蛋白 22 抗体或乳胶标记的抗核基 质蛋白 22 抗体或胶体硒标记的。

5、抗核基质蛋白 22 抗体。 2.如权利要求1所述的利用抗核基质蛋白22抗体快速检测膀胱癌的免疫层析试纸， 其 特征在于， 样品垫为亲水性微孔结构材料。 3.如权利要求2所述的利用抗核基质蛋白22抗体快速检测膀胱癌的免疫层析试纸， 其 特征在于， 所述亲水性微孔结构材料为无纺布或玻璃纤维。 4.如权利要求1所述的利用抗核基质蛋白22抗体快速检测膀胱癌的免疫层析试纸， 其 特征在于， 质控区设有一个质控线 (C)。 5.如权利要求1所述的利用抗核基质蛋白22抗体快速检测膀胱癌的免疫层析试纸， 其 特征在于， 所述抗核基质蛋白 22 抗体的宿主为 ： 鼠、 羊、 兔、 鸡或马。 6.如权利要求1所述。

6、的利用抗核基质蛋白22抗体快速检测膀胱癌的免疫层析试纸， 其 特征在于， 试纸宽度为 2mm-6mm。 7.如权利要求1所述的利用抗核基质蛋白22抗体快速检测膀胱癌的免疫层析试纸， 其 特征在于， 所述试纸的检测限不高于 10IU/ml 核基质蛋白 22。 8. 一种权利要求 1 所述试纸的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1） 准备好样品垫、 结合垫、 硝酸纤维素膜和吸水纸 ； 2） 用碱性溶液将胶体金溶液 pH 调至至 7.0-10.0， 混合抗核基质蛋白 22 抗体与胶体金 溶液， 然后加入蛋白保护剂， 即得到稳定的金标抗体 ； 3） 采用高速冷冻离心的方法对步骤 1） 所得金。

7、标抗体进行纯化， 并用胶体金悬浮液进行 复溶 ； 4） 将步骤 3） 所得金标抗体喷点到结合垫上， 干燥后既得金标抗体结合垫 ； 5） 在硝酸纤维素膜的一侧喷点抗核基质蛋白 22 抗体作为检测线 （T） ， 在硝酸纤维素膜 另一侧喷点抗 IgG 抗体作为质控线 （C） ， 得到喷点后的硝基纤维素膜 ； 6） 顺次将样品垫、 金标抗体结合垫、 喷点后的硝酸纤维素膜和吸水纸相互搭接在底板 上， 并用切刀机切割成所需宽度的试纸条。 9.一种权利要求1所述试纸的制备方法， 其特征在于， 所述胶体金溶液的制备方法为: 将 100ml 0.01% 的 HAuCl4水溶液加热至沸腾， 在剧烈搅拌下迅速加入 。

8、0.5-10ml 的柠檬酸 三纳溶液， 保持沸腾状态反应 3-30min 后停止加热， 然后冷却。 10. 一种权利要求 1 所述试纸在体液检测中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104330565 A 2 1/4 页 3 一种利用抗核基质蛋白 22 抗体快速检测膀胱癌的免疫层 析试纸及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于体外诊断技术领域， 尤其是涉及一种利用抗核基质蛋白 22（NMP22） 抗 体快速检测膀胱癌的免疫层析试纸。 0002 背景技术 0003 膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤， 90% 以上为移行细胞癌， 膀胱移行细胞癌 （transitional cell carcin。

9、oma of bladder） 是泌尿系统最常见的恶性肿瘤， 多发生于 50-70 岁之间。其中 80% 以上为表浅肿瘤， 有 10%-20% 发展为浸润性膀胱癌。这种疾病死亡 率高， 及早地发现、 诊断对治疗和预后有重要作用。 有资料表明在疾病早期诊断出的患者的 5 年存活率大于 90%， 而在晚期诊断出的患者其 5 年存活率仅约为 15%-30%。目前对膀胱癌 诊断和术后复查主要靠膀胱镜和尿细胞学检查， 前者虽准确， 但是一种侵入性检查， 操作复 杂、 费时费力、 费用高额， 且给病人带来很大痛苦， 使得很多病人对此方法有抵触情绪， 同时 难以发现原位癌或扁平癌 ； 尿细胞学检查虽无创， 。

10、且特异性较好， 但敏感性低， 对于分期较 低、 分化较好的肿瘤， 其敏感性仅为 30% 或更低， 而且受诊断医师主观因素的影响较大。膀 胱镜和尿细胞学检查的局限性限制了对膀胱癌诊断的应用， 故寻找一种简便、 无创且能早 期诊断膀胱癌的实验方法具有很大意义。 0004 发明内容 0005 为了克服现有技术的不足， 本发明提供一种利用抗核基质蛋白 22（NMP22） 抗体快 速检测膀胱癌的免疫层析试纸及其制备方法以及在体液检测中的应用。 0006 本发明的目的之一是提供一种利用抗核基质蛋白 22 抗体快速检测膀胱癌的免疫 层析试纸， 所述试纸包括样品垫、 结合垫、 硝酸纤维素膜、 吸水纸和底板 ；。

11、 所述硝酸纤维素膜在所述底板的中部， 在所述硝酸纤维素膜沿底板的一端依次为结合 垫、 样品垫， 在所述硝酸纤维素膜沿底板的另一端为吸水纸， 且每相邻两者之间部分叠合 ； 所述硝酸纤维素膜包含包被有抗核基质蛋白 22 抗体的检测区和包被有抗 IgG 抗体的 质控区 ； 所述硝酸纤维素膜靠近吸水纸一端为质控区， 另一端为检测区 ； 所述检测区设有 检测线 （T)， 所述质控区设有质控线 （C) ； 所述的结合垫上包被有胶体金标记的抗核基质蛋白 22 抗体或乳胶标记的抗核基质蛋 白 22 抗体或胶体硒标记的抗核基质蛋白 22 抗体。 0007 优选， 所述样品垫为亲水性微孔结构材料。 0008 优选。

12、， 所述亲水性微孔结构材料为无纺布或玻璃纤维。 0009 优选， 所述硝酸纤维素膜上包含一个质控线 （C)。 0010 优选， 所述抗核基质蛋白 22 抗体的宿主为 ： 鼠、 羊、 兔、 鸡或马。 说 明 书 CN 104330565 A 3 2/4 页 4 0011 优选， 试纸宽度为 2mm-6mm。 0012 优选， 所述试纸的检测限不高于 10IU/ml 核基质蛋白 22。 0013 本发明的目的之二是提供一种利用抗核基质蛋白 22 抗体快速检测膀胱癌的免疫 层析试纸的制备方法， 包括以下步骤 : 1） 准备好样品垫、 结合垫、 硝酸纤维素膜和吸水纸 ； 2） 用碱性溶液将胶体金溶液 。

13、pH 调至至 7.0-10.0， 混合抗核基质蛋白 22 抗体与胶体金 溶液， 然后加入蛋白保护剂， 即得到稳定的金标抗体。 0014 3） 采用高速冷冻离心的方法对步骤 1） 所得金标抗体进行纯化， 并用胶体金悬浮液 进行复溶。 0015 4） 将步骤 2） 所得金标抗体喷点到结合垫上， 干燥后既得金标抗体结合垫。 0016 5） 在硝酸纤维素膜的一侧喷点抗核基质蛋白 22 抗体作为检测线 (T)， 在硝酸纤维 素膜另一侧喷点抗 IgG 抗体作为质控线 （C)， 得到喷点后的硝酸纤维素膜。 0017 6） 顺次将样品垫、 金标抗体结合垫、 喷点后的硝酸纤维素膜和吸水纸相互搭接在 底板上， 并。

14、用切刀机切割成所需宽度的试纸条。 0018 优选， 所述胶体金溶液的制备方法为 : 将 100ml 0.01% 的 HAuCl4水溶液加热至沸 腾， 在剧烈搅拌下迅速加入 0.5-10ml 的柠檬酸三纳溶液， 保持沸腾状态反应 3-30min 后停 止加热， 然后冷却。 0019 本发明的目的之三是提供一种利用抗核基质蛋白 22 抗体快速检测膀胱癌的免疫 层析试纸在体液检测中的应用， 即将待检体液标本滴于所述的试纸样品垫一方， 通过抗原 和抗体间特异性免疫反应， 使胶体金或胶体硒或乳胶聚集而显色， 从而实现结果的判断。 体 液主要包括血样、 尿样或唾液， 优选为尿样。 0020 本发明的有益技。

15、术效果 : 1、 核基质蛋白 22（NMP22） 是一种新的膀胱癌肿瘤标志物， 检测其在人体液中的 NMP22 含量对于膀胱癌的早期诊断及术后复发具有较大意义， 本发明首次将抗核基质蛋白 22 抗 体应用于胶体金或胶体硒或乳胶作为显色指示剂的免疫层析技术设计， 通过胶体金或胶体 硒或乳胶试纸能快速检测出NMP22含量大于10IU/ml的样本， 20秒内可以得到检测结果， 所 得结果快速直观， 可作为膀胱癌的临床辅助诊断及病情的检测。 0021 2、 本发明利用抗核基质蛋白 22 抗体的免疫层析技术， 只需患者的少量体液 （血 样、 尿样或唾液） ， 即将待检标本滴于所述的试纸样品垫一方， 通过。

16、抗原和抗体间特异性免 疫反应， 使胶体金或胶体硒或乳胶聚集而显色， 从而实现结果的判断， 不需要任何仪器设 备， 故本发明操作简便、 无创。 0022 附图说明 0023 图 1 为本发明的结构示意图 ； 图 2 为本发明硝酸纤维膜的结构示意图 ； 图 3 为本发明的检测结果判断示意图 附图标记 ： 1- 样品垫 ； 2- 结合垫 ； 3- 硝酸纤维素膜 ； 4- 吸水纸 ； 5- 底板 说 明 书 CN 104330565 A 4 3/4 页 5 具体实施方式 0024 下面结合具体实施为例， 进一步阐述本发明， 应注意， 这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。 0025 实。

17、施例 1 结合附图 1、 2 ： 利用抗核基质蛋白 22（NMP22） 抗体快速检测膀胱癌的免疫层析试纸， 所述试纸包括样品垫 1、 结合垫 2、 硝酸纤维素膜 3、 吸水纸 4 和底板 5 ； 所述硝酸纤维素膜 3 在所述底板 5 的中部， 在所述硝酸纤维素膜 3 沿底板的一端依次为结合垫 2、 样品垫 1， 在所 述硝酸纤维素膜 3 沿底板的另一端为吸水纸 4， 且每相邻两者之间部分叠合 ； 所述硝酸纤维 素膜3包含包被有抗核基质蛋白22抗体的检测区和包被有抗IgG抗体的质控区 ； 所述硝酸 纤维素膜 3 靠近吸水纸 4 一端为质控区， 另一端为检测区 ； 所述检测区设有检测线 （T)， 。

18、所 述质控区设有质控线 （C) ； 所述的结合垫 2 上包被有胶体金标记的抗核基质蛋白 22 抗体或 乳胶标记的抗核基质蛋白 22 抗体或胶体硒标记的抗核基质蛋白 22 抗体。 0026 以下实施例 2-3 为利用抗核基质蛋白 22 抗体快速检测膀胱癌的免疫层析试纸的 制备方法 实施例 2 1） 准备好样品垫、 结合垫、 硝酸纤维素膜和吸水纸 ； 2） 胶体金溶液的制备 ： 将 100ml 0.01% 的 HAuCl4水溶液加热至沸腾， 在剧烈搅拌下迅 速加入 10ml 的柠檬酸三纳溶液， 保持沸腾状态反应 30min 后停止加热， 冷却后即得胶体金 溶液。 0027 3） 用碱性溶液将步骤 。

19、1） 所得的胶体金溶液 pH 调至至 7.0， 混合抗核基质蛋白 22 抗体与胶体金溶液使他们结合， 然后加入蛋白保护剂， 即得到稳定的金标抗体。 0028 4） 采用高速冷冻离心的方法对得到的稳定金标抗体进行纯化， 并用一定体积的胶 体金悬浮液进行复溶。 0029 5） 将金标抗体喷点到结合垫上， 干燥后既得金标抗体结合垫。 0030 6） 在硝酸纤维素膜的一侧喷点抗宿主为鼠的核基质蛋白 22 抗体作为一条检测线 （T） ， 在硝酸纤维素膜另一侧喷点抗 IgG 抗体作为一条质控线 （C)， 得到喷点后的硝酸纤维 素膜 ； 7） 顺次将无纺布样品垫、 金标抗体结合垫、 喷点后的硝酸纤维素膜和吸。

20、水纸相互搭接 在底板上， 并用切刀机切割成宽为 6mm 的试纸条。 0031 实施例 3 1） 准备好样品垫、 结合垫、 硝酸纤维素膜和吸水纸 ； 2） 胶体金溶液的制备 ： 将 100ml 0.01% 的 HAuCl4水溶液加热至沸腾， 在剧烈搅拌下迅 速加入 0.5ml 的柠檬酸三纳溶液， 保持沸腾状态反应 3min 后停止加热， 冷却后即得胶体金 溶液。 0032 3） 用碱性溶液将步骤 1） 所得的胶体金溶液 pH 调至至 10.0， 混合宿主为鼠的抗 核基质蛋白 22 抗体与胶体金溶液使他们结合， 然后加入蛋白保护剂， 即得到稳定的金标抗 体。 0033 4） 采用高速冷冻离心的方法。

21、对得到的稳定金标抗体进行纯化， 并用一定体积的胶 说 明 书 CN 104330565 A 5 4/4 页 6 体金悬浮液进行复溶。 0034 5） 将金标抗体喷点到结合垫上， 干燥后既得金标抗体结合垫。 0035 6） 在硝酸纤维素膜的一侧喷点宿主为马的抗核基质蛋白 22 抗体作为一条检测线 （T） ， 在硝酸纤维素膜另一侧喷点抗 IgG 抗体作为一条质控线 （C)， 得到喷点后的硝酸纤维 素膜。 0036 7） 顺次将玻璃纤维样品垫、 金标抗体结合垫、 喷点后的硝酸纤维素膜和吸水纸相 互搭接在底板上， 并用切刀机切割成宽为 2mm 的试纸条。 0037 实施例 2 和实施例 3 步骤 2）。

22、 中宿主， 也可以为、 羊、 兔、 鸡或马 ； 样品垫可以为常用 的亲水性微孔结构类材料。结合垫上的抗体也可以为乳胶标记的抗核基质蛋白 22 抗体或 胶体硒标记的抗核基质蛋白 22 抗体。 0038 试纸检测方法 ： 1、 取 50ul-100 ul 的待检样品 ( 血样、 尿样或唾液 ) 加在试纸的样品垫 ； 2、 在 20min 内观察结果， 30min 后判读结果无效。 0039 检测结果的判断 ： 结合附图 3 ： 1、 阳性 ： 在试纸条的检测线 (T) 和质控线 （C) 位置上各出现一条紫红色条带 ； 2、 阴性 ： 仅在试纸条的质控线 （C) 上出现一条紫红色条带 ； 3、 无效 ： 在试纸条的质控线 （C) 上未出现紫红色条带。 说 明 书 CN 104330565 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104330565 A 7 。