一种荧光探针及其制备方法、牛奶中土霉素的检测方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410764252.1 (22)申请日 2014.12.12 C09K 11/65(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 安徽师范大学 地址 241000 安徽省芜湖市弋江区花津南路 安徽师范大学 (72)发明人 安旭婷 朱昌青 (74)专利代理机构 芜湖安汇知识产权代理有限 公司 34107 代理人 朱圣荣 (54) 发明名称 一种荧光探针及其制备方法、 牛奶中土霉素 的检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种荧光探针及其制备方法、 牛奶中土霉素的检测方法， 荧光探针， 由以单宁酸 为碳源合成。

2、的表面酚羟基化的碳点与 Fe3+溶液中 的 Fe3+结合组成。通过分别检测加入盐酸土霉素 标准溶液前后荧光探针的荧光强度， 根据加入盐 酸土霉素标准溶液前后荧光探针的荧光强度比值 和盐酸土霉素的浓度建立线性公式， 再在相同条 件下检测加入牛奶前后探针的荧光强度， 根据线 性公式计算出牛奶中土霉素的具体含量。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104449696 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104449696 A 1/1 页 2 1. 一种荧光探针， 其特征在。

3、于， 所述荧光探针由以单宁酸为碳源合成的表面酚羟基化 的碳点与 Fe3+溶液中的 Fe3+结合组成。 2. 权利要求 1 所述的荧光探针的制备方法， 包括以下步骤 ： (1) 将单宁酸溶解在蒸馏水中， 加热至 180反应 2h， 冷却后， 透析除杂， 真空干燥， 得 到黑色粉末状碳点， 溶于二次蒸馏水， 获得碳点溶液 ； (2) 向 pH 为 7 的柠檬酸 -NaHPO4缓冲溶液中加入碳点溶液和 Fe3+溶液， 制备得到荧光 探针。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)中碳点在制备得到的荧光探 针体系中浓度为 0.50.02mg/mL。 4.根据权利要求2所述的制备方法。

4、， 其特征在于， 步骤(2)中所用Fe3+溶液中含有Fe3+ 的浓度为 10-4M。 5.根据权利要求2或3所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)制备碳点溶液的具体步 骤为 ： 称取 0.1035g 单宁酸， 加 40mL 蒸馏水溶解， 转移到聚四氟乙烯反应釜内衬中并装好钢 套 , 于烘箱中逐渐加热到 180并恒温 2h, 自然冷却至室温， 用切割分子量为 2000 的透析 袋于二次水中透析1天除去杂质， 透析后的碳点溶液在12000r/min的转速下离心15min， 除 去聚集的大颗粒， 收集滤液， 最后于真空干燥箱中干燥 48h, 即得到黑色粉末状碳点 , 称重 并溶于二次水中 , 即。

5、得质量浓度的碳点溶液。 6.根据权利要求2或4所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)制备荧光探针的具体步 骤为 : 在5mL干净的具塞试管中依次加入300L pH为7的柠檬酸-NaHPO4缓冲溶液， 200L 上述合成的碳点溶液， 10-4M 的 Fe3+溶液 350L， 定容至 5ml, 制备得到荧光探针， 碳点在该 体系中浓度为 0.50.02mg/mL。 7. 一种牛奶中土霉素的检测方法， 包括以下步骤 ： 平行取荧光探针若干份， 加入 pH 值为 7.0 的柠檬酸 -NaHPO4缓冲溶液， 再加入不同浓 度的盐酸土霉素标准溶液， 分别检测加入盐酸土霉素标准溶液前后荧光探针的荧光强度。

6、， 根据加入土霉素前后体系的发射峰处荧光强度的增加值与未加土霉素时体系的发射峰处 荧光强度的比值和盐酸土霉素的浓度建立线性公式 ； 在相同条件下检测加入牛奶前后探针 的荧光强度， 根据线性公式计算出牛奶中土霉素的具体含量。 权 利 要 求 书 CN 104449696 A 2 1/4 页 3 一种荧光探针及其制备方法、 牛奶中土霉素的检测方法 技术领域 0001 本发明属于化学检测领域， 具体涉及一种荧光探针及其制备方法、 牛奶中土霉素 的检测方法。 背景技术 0002 土霉素， 一种四环素类抗生素， 是一种广谱抗菌素。 它对多种细菌和芽孢杆菌有抗 菌作用， 用来治疗上呼吸道感染、 胃肠道感染。

7、、 支原体感染和衣原体感染疾病等。 0003 给农场动物饲喂土霉素能预防相关疾病， 如对猪的副伤寒、 附红细胞体、 炭疽病、 喘气病、 痢疾、 猪肺疫疗效显著， 对雏禽痢疾、 衣原体病有很好的疗效， 还可以用来缓解应激 反应、 提高产蛋量、 促进幼禽增重等。水产业应用其治疗鱼类弧病菌、 脱磷病、 烂鳃病、 鳗鱼 受德化氏病、 鳟鱼疮病、 鳗赤鳍病等。但过量的土霉素可以导致其在动物食品中的大量积 累 , 包括肉类和牛奶。这种积累可能会对人体健康产生危害。 0004 传统方法中， 色谱法和电泳法， 包括色谱质谱连用法、 高效液相色谱法、 液相色谱 一串联质谱法等已经用来探测土霉素。 但是， 这些方。

8、法都需要复杂而昂贵的仪器， 专业的技 术， 而且实验步骤复杂而耗时。 此外， 光学分析法， 包括分光光度法、 光纤荧光法和化学发光 法等， 由于操作简单而且成本廉价， 也用来探测土霉素。但是， 这种方法样品提取步骤复杂 而且实验所用部分试剂有毒。 发明内容 0005 为解决上述技术问题， 本发明提供一种荧光探针及其制备方法、 牛奶中土霉素的 检测方法。利用荧光碳点检测克服了传统检测方法的成本高、 实验步骤复杂而耗时以及实 验所用部分试剂有毒等缺点， 具有灵敏度高、 选择性和稳定性好、 检测成本低、 方法操作和 样品处理简单等优点。 0006 为了实现上述目的， 本发明采用的技术方案如下 ： 0。

9、007 一种荧光探针， 由以单宁酸为碳源合成的表面酚羟基化的碳点与 Fe3+溶液中的 Fe3+结合组成。 0008 一种荧光探针的制备方法， 包括以下步骤 ： 0009 (1) 将单宁酸溶解在蒸馏水中， 加热至 180反应 2h， 冷却后， 透析除杂， 真空干 燥， 得到黑色粉末状碳点， 溶于二次蒸馏水， 获得碳点溶液 ； 0010 (2) 向 pH 为 7 的柠檬酸 -NaHPO4缓冲溶液中加入碳点溶液和 Fe3+溶液， 制备得到 荧光探针。 0011 步骤 (2) 中碳点在制备得到的荧光探针体系中浓度为 0.50.02mg/mL ； 0012 步骤 (2) 中所用 Fe3+溶液中含有 Fe。

10、3+的浓度为 10-4M。 0013 步骤 (1) 制备碳点溶液的具体步骤为 ： 0014 称取 0.1035g 单宁酸， 加 40mL 蒸馏水溶解， 转移到聚四氟乙烯反应釜内衬中并装 好钢套 , 于烘箱中逐渐加热到 180并恒温 2h, 自然冷却至室温， 用切割分子量为 2000 说 明 书 CN 104449696 A 3 2/4 页 4 的透析袋于二次水中透析 1 天除去杂质， 透析后的碳点溶液在 12000r/min 的转速下离心 15min， 除去聚集的大颗粒， 收集滤液， 最后于真空干燥箱中干燥 48h, 即得到黑色粉末状碳 点 , 称重并溶于二次水中 , 即得质量浓度的碳点溶液 。

11、； 0015 步骤 (2) 制备荧光探针的具体步骤为 : 0016 在 5mL 干净的具塞试管中依次加入 300L pH 为 7 的柠檬酸 -NaHPO4缓冲溶液， 200L 上述合成的碳点溶液， 10-4M 的 Fe3+溶液 350L， 定容至 5ml, 制备得到荧光探针， 碳 点在该体系中浓度为 0.50.02mg/mL。 0017 一种牛奶中土霉素的检测方法， 包括以下步骤 ： 0018 平行取上述荧光探针若干份， 加入 pH 值为 7.0 的柠檬酸 -NaHPO4缓冲溶液， 再加 入不同浓度的盐酸土霉素标准溶液， 分别检测加入盐酸土霉素标准溶液前后荧光探针的荧 光强度， 根据加入土霉素。

12、前后体系的发射峰处荧光强度的增加值与未加土霉素时体系的发 射峰处荧光强度的比值和盐酸土霉素的浓度建立线性公式 ； 在相同条件下检测加入牛奶前 后探针的荧光强度， 根据线性公式计算出牛奶中土霉素的具体含量。 0019 由于碳点性质受 pH 值变化影响较大， 本发明使用的碳点在 pH 为 7 的条件下具有 很好的荧光性能， 且 pH 为 7 时 Fe3+对 CDs 的猝灭效率也最好， 而土霉素在中性条件下具有 很强的络合作用。所以利用缓冲液调节 pH 值为 7 最为合适。碳点发射峰位置的选择决定 了检测体系是否具有灵敏的荧光强度变化， 为了实现对土霉素浓度的灵敏响应， 将碳点的 激发波长设定在 4。

13、40nm。 0020 本发明方法线性范围为 0-3.5mol/L， 检测限为 2.2810-8M， 回收率介于 92.5 到 103.0之间。 0021 本发明涉及的方法具有高的灵敏度、 选择性和稳定性， 且检测成本低 ； 方法操作和 样品处理简单， 整个检测过程只需要二十分钟 ； 利用线性公式还可以很好的对牛奶中土霉 素的含量进行定量检测。 附图说明 0022 图 1 为不同浓度的土霉素对 CDs/Fe3+体系的荧光回升作用 ； 0023 图 2 为土霉素 (3M)、 寡聚糖 (165M)、 强力霉素 (180M)、 四环素 (105M) 青 霉素、 链霉素、 红霉素、 氯霉素 (300M)。

14、 对 CNP/Fe3+体系的干扰情况 ； 0024 图 3 为土霉素 (3M)， VA、 VD3、 VD2、 VB1、 VC、 VB2、 VB6、 Choline(1.5mM) 对 CNP/Fe3+ 体系的干扰情况 ； 0025 图 4 荧光的回升效率与土霉素浓度之间的线性关系 ； 0026 图 5 碳点的 XPS 谱图 ； 0027 图 6 碳点的 C1s 谱图 ； 0028 图 7 碳点的 O1s 谱图 ； 0029 图 8 碳点的红外吸收光谱。 具体实施方式 0030 实施例 1 0031 一种荧光探针， 由以单宁酸为碳源合成的表面酚羟基化的碳点与 Fe3+溶液中的 说 明 书 CN 1。

15、04449696 A 4 3/4 页 5 Fe3+结合组成。 0032 一种荧光探针的制备方法， 包括以下步骤 ： 0033 (1)、 用电子天平称取 0.1035g 单宁酸， 加 40mL 蒸馏水溶解， 并将上述溶液转移到 聚四氟乙烯反应釜内衬中并装好钢套 , 于烘箱中逐渐加热到 180并恒温 2h, 自然冷却至 室温。最后将反应好的溶液用切割分子量为 2000 的透析袋于二次水中透析 1 天除去杂质。 透析后的碳点溶液在 12000r/min 的转速下离心 15min， 除去聚集的大颗粒， 收集滤液， 最后 于真空干燥箱中干燥 48h, 即得到黑色粉末状碳点 , 称重并溶于 10ml 二次。

16、蒸馏水中 , 即得 质量浓度的碳点溶液 ； 0034 (2)、 在 5mL 干净的具塞试管中依次加入 300L pH 为 7 的柠檬酸 -NaHPO4缓冲溶 液， 200L上述合成的碳点溶液， 10-4M的Fe3+溶液350L， 定容至5ml,制备得到荧光探针， 碳点在该体系中浓度为 0.5mg/mL。 0035 对碳点的表面组成和元素分析做了XPS表征(如图5。 碳点的XPS光谱在282.2eV and 533.9eV处的俩个峰， 分别是C1s and O1s产生的。 C1s谱(如图6显示284.4eV,285.9eV 和 288.5eV 三个峰， 分别是由 C C(45.55 ),C-O(。

17、38.89 ) 和 C O(15.55 ) 产生 的。O1s谱 ( 如图 7 显示 531.3eV 和 532.7eV 俩个峰， 分别是由 C O(15.4 ) 和 C-OH/ C-O-C(84.6 ) 产生的。 0036 利用红外吸收光谱确定了碳点表面的官能团， 如图 8。3300cm-1和 1050cm-1处的 吸收峰是 -OH 的伸缩振动的特征吸收， 证明碳点表面有大量的羟基。1400cm-1处的吸收峰 是 -COOH 的对称伸缩振动的吸收。还观测到 -C O 的伸缩振动在 1700cm-1处的特征吸收 峰， 和 C-OH 的伸缩振动在 1200cm-1处的吸收峰。 0037 一种牛奶中。

18、土霉素的检测方法， 在 5mL 干净的具塞试管中取上述荧光探针， 加入 pH 值为 7.0 的缓冲溶液， 再加入不同浓度的盐酸土霉素标准溶液 (0 到 3.5M)， 分别检测 加入盐酸土霉素标准溶液前后荧光探针的荧光强度， 根据加入土霉素前后体系的发射峰处 荧光强度的增加值与未加土霉素时体系的发射峰处荧光强度的比值和盐酸土霉素的浓度 建立线性公式， 建立的线性公式如下 ： y 0.0003+0.2635x(R2 0.9968)， 其中 y 为加入土 霉素前后体系的荧光强度的增加值与未加土霉素时体系的荧光强度的比值， 即 F/F0， x 为 盐酸土霉素的浓度 c。 0038 在 5mL 干净的具。

19、塞试管中依次加入 300L pH 为 7 的 citric acid-NaHPO4缓冲 溶液， 200L CDs， 7M Fe3+， 然后再加入一定量的经处理好的牛奶样品， 用二次水稀释、 摇 匀。二十分钟后， 进行荧光信号检测， 激发波长设置为 440nm。根据线性公式计算出牛奶中 土霉素的具体含量。 0039 根据相关文献报导， 牛奶中土霉素的含量在 0.1M 左右。本发明的实验样品为超 市随机购买的几种新鲜牛奶。 0040 说 明 书 CN 104449696 A 5 4/4 页 6 0041 从本发明的实验结果看， 测得的几种牛奶样品中土霉素的含量均在 0.1M 左右， 与相关文献报导。

20、一致， 且回收率介于 92.5到 103.0之间， 表明本发明的方法具有一定 的实用性和重现性。 0042 综上所述， 本发明涉及的方法具有灵敏度高、 选择性和稳定性好、 检测成本低、 方 法操作和样品处理简单等优点。在牛奶中土霉素的检测中有很大的应用价值。 说 明 书 CN 104449696 A 6 1/4 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104449696 A 7 2/4 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104449696 A 8 3/4 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 104449696 A 9 4/4 页 10 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 104449696 A 10 。