表面离子共振技术检测新城疫病毒的非诊断性方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104316691 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104316691 A (21)申请号 201410649818.6 (22)申请日 2014.11.14 G01N 33/577(2006.01) G01N 21/552(2014.01) (71)申请人 山东出入境检验检疫局检验检疫技 术中心 地址 266002 山东省青岛市市南区瞿塘峡路 70 号 (72)发明人 孙涛 曹丙蕾 王群 徐彪 郑小龙 房保海 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 褚庆森 (54) 发明名称 表面离子共振技术检测新城疫病毒的非诊断 性方。

2、法 (57) 摘要 本发明公开了一种表面离子共振技术检测新 城疫病毒的非诊断性方法， 包括下列步骤 ：（1） 鼠 抗抗体的偶联 ： 鼠抗抗体与表面离子共振系统中 的生物传感器芯片偶联 ；（2） 新城疫单克隆抗体 的捕获及捕获浓度的确定 ；（3） 样品的检测 ： 将待 测样品流过表面离子共振系统中的生物传感器芯 片的流池， 测定混合物流过芯片之前和之后相应 流池的信号差值， 根据上述信号差值确定所述病 毒是否存在及其含量。本发明的检测方法在检测 其他禽源病毒时无阳性响应信号， 特异性强 ； 对 新城疫病毒重组蛋白的检测极限达 0.3125nmol/ L， 灵敏度高。 (51)Int.Cl. 权利。

3、要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104316691 A CN 104316691 A 1/1 页 2 1. 表面离子共振技术检测新城疫病毒的非诊断性方法， 其特征在于， 包括下列步骤 ： （1） 鼠抗抗体的偶联 ： 鼠抗抗体与表面离子共振系统中的生物传感器芯片偶联 ； （2） 新城疫单克隆抗体的捕获及捕获浓度的确定 ； （3） 样品的检测 ： 将待测样品流过表面离子共振系统中的生物传感器芯片的流池， 测定 混合物流过芯片之前和之后相应流池的信号差值， 根据上。

4、述信号差值确定所述病毒是否存 在及其含量。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 具体包括下列步骤 ： （1） 鼠抗抗体的偶联 ： （a）样 品 无 需 预 处 理， 利 用 HBS 作 为 缓 冲 液， 设 定 偶 联 引 导 模 式 ： 在 Surface Preparation 窗 口 中， 同 时 选 择 Immobilisation 和 芯 片 Sensor Chip: CM5 及 Amine Coupling 方法， 同时设置不偶联鼠抗抗体的空白参比通道 ； （b） 将所有试剂平衡到室温 20-25， 设定加样流速为 10L/min ； （c） 以 inject 方式。

5、进样， 顺次用 110LNHS/EDC 混合液活化芯片表面， 再加入过量的鼠 抗抗体偶联在活化后的芯片表面上， 偶联完毕后用60L Ethanolamine HCl封闭， 使过量的 反应基团失活 ； （d）分析偶联效果 ： 通过在开始注射鼠抗抗体前放置一个基线报道点， 并在注射 Ethanolamine HCl 结束后放置第二个报道点， 如信号差在 1000-5000RU 之间， 则结合鼠抗 的水平良好 ； （2） 新城疫单克隆抗体的捕获及适当捕获浓度的确定 ： （a） 将 0.10.5g/ml 的含新城疫单克隆抗体的腹水样品和 1001000nM 的新城疫重组 蛋白抗原， 经 0.22m 的。

6、微孔过滤备用 ； （b） 在配体通道上进样 10L 单抗腹水样品， 然后同时在空白参比通道和配体通道上进 样 3min 抗原， 解离 5min， 设定流速为 10L/min ； （c） 控制捕获单抗后抗原检测的 RU 信号差值处在 3050RU 之间， 以此确定为合适的 单抗捕获浓度， 后续的样品检测均以此捕获浓度的单抗进样 ； 最后用 pH3.0 的缓冲液 10mM Glycine HCl 进行再生， 去除新城疫单克隆抗体 ； （3） 样品的检测 （a） 待检抗原经 0.22m 的微孔过滤备用 ； （b） 在相应的预要捕获新城疫单克隆抗体的配体通道上进样， 设定流速为 10L/min， 进 。

7、样 10L 确定好浓度的新城疫单克隆抗体 ； （c） 分别注射 25L 的 HBS 缓冲液作为阴性对照和待检抗原， 顺次进样与新城疫单克隆 抗体结合， 并限定 120s 解离时间， 最后用 pH3.0 的缓冲液 10mM Glycine HCl 进行再生 ； （d） 通过在开始注射新城疫单克隆抗体后放置一个基线报道点， 并在注射待检样品后 放置第二个报道点， 阴性对照无任何差值， 阳性样品信号有差值， 以此确定有新城疫病毒的 存在。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于， 生物传感器芯片为 CM5 芯片。 权 利 要 求 书 CN 104316691 A 2 1/4 页 3。

8、 表面离子共振技术检测新城疫病毒的非诊断性方法 技术领域 0001 本发明涉及一种表面离子共振技术检测新城疫病毒的非诊断性方法， 属于生物技 术检测领域。 背景技术 0002 新城疫 (Newcastle disease， ND) 是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus， NDV) 引起的一种严重威胁我国的规模化养禽场的烈性传染病， 一般可分为强毒力型、 中毒 力型及弱毒力型， 是动物产品国际贸易中重点检查的对象。目前用于监控 NDV 的常用方法 免疫学方法如血凝与血凝抑制试验， ELISA， 免疫组化和免疫荧光等。但均不能实时监测生 物大分子之间的相互作用， 动态观。

9、察大分子之间结合与解离的平衡关系 , 较为准确地测定 分子间相互作用的亲和力。目前已成为筛选各类抗体建立免疫学反应的瓶颈和关键。同时 传统的免疫血清学诊断方法大多需要标记各类抗体， 无法在大规模推广应用前实现对抗体 或参考抗原的筛选工作， 因而需要研究一种相对廉价， 并能够对新城疫病毒的血清学诊断 方法在建立推广之前进行高通量快速筛选、 准确鉴别的集成化诊断技术。 0003 表面等离子体共振技术 (SPR) 是利用在金属膜 / 液面界面， 由光的全反射引起的 物理光学现象来分析分子间相互作用的技术。 SPR仪由自动采样机械手、 高分辨率的CCD照 相仪和上面布有一个或多个流池的镀金或镀银SPR。

10、生物传感器芯片构成。 SPR技术在检测、 分析生物分子间的相互作用等方面得到广泛的应用。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是 ： 提供一种利用表面等离子体共振技术来检测新城 疫病毒的方法， 同时， 所述的方法也可快速筛选一株适配的新城疫单克隆抗体。 0005 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是 ： 表面离子共振技术检测新城疫 病毒的非诊断性方法， 包括下列步骤 ： 0006 (1) 鼠抗抗体的偶联 ： 鼠抗抗体与表面离子共振系统中的生物传感器芯片偶联 ； 0007 (2) 新城疫单克隆抗体的捕获及捕获浓度的确定 ； 0008 (3) 样品的检测 ： 将待测样品流过表面离子。

11、共振系统中的生物传感器芯片的流 池， 测定混合物流过芯片之前和之后相应流池的信号差值， 根据上述信号差值确定所述病 毒是否存在及其含量。 0009 具体的， 上述步骤具体为 ： 0010 鼠抗抗体与表面离子共振系统中的生物传感器芯片偶联的具体步骤为 ： 在室温 20-25 摄氏度条件下， 将试剂放在样品架上， 设定加样流速为 10L/min， 以 inject 方式进 样， 顺次用 110LNHS/EDC 混合液活化芯片表面， 再加入过量的鼠抗抗体偶联在活化后的 芯片表面上， 偶联完毕后用60L Ethanolamine HCl封闭， 使过量的反应基团失活 ； 分析偶 联效果时， 通过在开始注。

12、射鼠抗抗体前放置一个基线报道点， 并在注射 Ethanolamine HCl 结束后放置第二个报道点， 如信号差在 1000-5000RU 之间， 则结合鼠抗的水平良好。通常芯 说 明 书 CN 104316691 A 3 2/4 页 4 片偶联抗体后可进行 100 次左右的结合及再生实验。 0011 新城疫单克隆抗体与鼠抗抗体结合的具体步骤为 ： 准备 0.1 0.5g/ml 的含新 城疫单克隆抗体的腹水样品和 100 1000nM 的新城疫重组蛋白抗原， 经 0.22m 的微孔过 滤备用。在配体通道上进样 10L 单抗腹水样品。然后同时在空白参比通道和配体通道上 进样 3min 抗原， 解。

13、离 5min， 设定流速为 10L/min。为最大限度降低背景值， 应控制捕获 单抗后抗原检测的 RU 信号差值处在 30 50RU 的合理区间， 以此确定为合适的单抗捕获 浓度， 后续的样品检测均以此捕获浓度的单抗进样。最后用 pH3.0 的缓冲液 10mM Glycine HCl 进行再生。 0012 检测样品的具体步骤为 ： 待检抗原经 0.22m 的微孔过滤备用。设定流速为 10L/min， 在相应的的配体通道上进样 10L 确定好浓度的新城疫单抗。分别注射 25L 的 HBS 缓冲液 ( 作为阴性对照 ) 和待检抗原， 顺次进样与单抗结合， 并限定 120s 解离时间， 最后用 pH。

14、3.0 的缓冲液 10mM Glycine HCl 进行再生。通过在开始注射单抗后放置一个基 线报道点， 并在注射待检样品后放置第二个报道点。 阴性对照无任何差值， 阳性样品信号有 差值， 以此确定有新城疫病毒的存在。 0013 本发明的有益效果是 ： 能够很快捷地发现鼠抗抗体与单抗分子间能否发生结合。 通过直接捕获杂交瘤上清、 腹水抗体， 在 5 10 分钟内即可快速筛选一株适配的单克隆抗 体， 运行成本更低， 芯片亦可反复使用， 这为大面积推广所筛选的抗体在其他免疫学实验中 的应用提供了重要的参考数据。 0014 本发明的检测方法在检测其他禽源病毒时无阳性响应信号， 特异性强 ； 对新城疫。

15、 病毒重组蛋白的检测极限达 0.3125nmol/L， 灵敏度高。 具体实施方式 0015 图 1 是本发明的特异性实验结果。 0016 具体实施方式 0017 实施例 1 0018 表面离子共振技术检测新城疫病毒的非诊断性方法， 包括下列步骤 ： 0019 1. 鼠抗抗体的偶联 0020 (1) 样品无需预处理， 利用 HBS 作为缓冲分析 buffer， 偶联鼠抗抗体固定于 CM5 芯 片。设定偶联引导模式 ： 在 Surface Preparation 窗口中， 同时选择 Immobilisation 和芯 片 Sensor Chip:CM5 及 Amine Coupling 方法， 同。

16、时设置不偶联鼠抗的空白参比通道。 0021 (2) 将所有试剂平衡到室温 20-25， 设定加样流速为 10L/min。 0022 (3)以inject方式进样， 顺次用110LNHS/EDC混合液活化芯片表面， 再加入过量 的鼠抗抗体偶联在活化后的芯片表面上， 偶联完毕后用 60L Ethanolamine HCl 封闭， 使 过量的反应基团失活 ； 0023 (4) 分析偶联效果时， 通过在开始注射鼠抗抗体前放置一个基线报道点， 并在注射 Ethanolamine HCl结束后放置第二个报道点， 如信号差在1000-5000RU， 则结合鼠抗的水平 良好。通常芯片偶联抗体后可进行 100 。

17、次左右的结合及再生实验。 0024 2. 单克隆抗体的捕获及适当捕获浓度的确定 0025 因每次检测均需要作预实验， 故每次捕获单克隆抗体均需要确定合适的捕获浓 说 明 书 CN 104316691 A 4 3/4 页 5 度。 0026 (1)准备0.10.5g/ml的含新城疫单克隆抗体的腹水样品和1001000nM的 新城疫重组蛋白抗原， 经 0.22m 的微孔过滤备用。 0027 (2) 在配体通道上进样 10L 单抗腹水样品。然后同时在空白参比通道和配体通 道上进样 3min 抗原， 解离 5min， 设定流速为 10L/min， 0028 (3)为最大限度降低背景值， 应控制捕获单抗。

18、后抗原检测的RU信号差值处在30 50RU 的合理区间， 以此确定为合适的单抗捕获浓度， 后续的样品检测均以此捕获浓度的单 抗进样。最后用 pH3.0 的缓冲液 10mM Glycine HCl 进行再生， 去除新城疫单抗。 0029 3. 样品的检测 0030 (1) 待检抗原经 0.22m 的微孔过滤备用。 0031 (2) 在相应的预要捕获新城疫单抗的配体通道上进样， 设定流速为 10L/min， 进 样 10L 确定好浓度的新城疫单抗。 0032 (3)分别注射25L的HBS缓冲液(作为阴性对照)和待检抗原， 顺次进样与单抗 结合， 并限定 120s 解离时间， 最后用 pH3.0 的。

19、缓冲液 10mM Glycine HCl 进行再生。 0033 (4) 通过在开始注射单抗后放置一个基线报道点， 并在注射待检样品后放置第二 个报道点。阴性对照无任何差值， 阳性样品信号有差值， 以此确定有新城疫病毒的存在。 0034 实施例 2 特异性试验 0035 在 SPR 芯片表面分析不同毒株的抗原， 将新城疫病毒 (NDV)、 传染性支气管炎病毒 (IBV)、 传染性法氏囊炎病毒 (IBDV)、 禽白血病 (ALV)、 鸭病毒性肝炎 (DVH)、 鸭病毒性肠炎 (DEV) 的病原材料， 尿囊液及细胞培养液经 0.22um 的微孔滤膜过滤上样处理， 均无特异的 显著的结合反应， 在SP。

20、R分析图谱中未出现与上述亚型一致的特征峰图。 SPR的特异性实验 结果见图 1( 纵轴为仪器的 RU 响应值 )。 0036 实施例 3 单克隆抗体的动力学分析及灵敏性测试 0037 将筛选得到的三株单抗按浓度依次倍比稀释成 250、 125、 62.5、 31.25、 15.625 至 7.8125nmol/L 并依次进样获取该单抗的结合和解离常数 KD 值 ( 如表 1)， 并由公式测得结 合速率与解离速率， 便于筛选免疫反应效果更好的单抗。并由公式测得结合速率与解离速 率， 便于筛选免疫反应效果更好的单抗。由公式(A 为溶液中的待分析 物由流动系统控制， AB 的浓度可由仪器直接检测响应信号 RU 得到， B 为偶联在传感芯片上 的分子， 相当于最大结合反应理论值 Rmax) 由此推导得出 0038 0039 表 1 三株单抗的动力学数据 0040 说 明 书 CN 104316691 A 5 4/4 页 6 0041 同时捕获 KD 值最小的单抗， 固定抗原上样浓度 ( 依次梯度倍比稀释成 5nmol/L、 2.5nmol/L、 1.25nmol/L、 0.625nmol/L、 0.3125nmol/L， 依次进样不同浓度的抗原进行灵敏 性分析。 说 明 书 CN 104316691 A 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 104316691 A 7 。