针对NGAL表位的纳米抗体及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410734730.4 (22)申请日 2014.12.04 C07K 16/18(2006.01) C12N 15/13(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/574(2006.01) (71)申请人 东南大学 地址 211189 江苏省南京市玄武区四牌楼 2 号 (72)发明人 万亚坤 母亚雯 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 沈振涛 (54) 发明名称 针对 NGAL 表位的纳米抗体及其应用 (57) 摘要 本发明提供的一种针对中性粒细胞明胶。

2、酶相 关脂质运载蛋白的纳米抗体 VHH 链， 包括框架区 和互补决定区。 还提供了一种针对NGAL的纳米抗 体， 它包括上述纳米抗体VHH链。 还提供了上述纳 米抗体的应用。本发明提供的纳米抗体是一种针 对中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗原表位 的纳米抗体， 该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效 表达， 可应用于急性肾损伤以及恶性肿瘤早期的 检测及诊断研究。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表30页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104479015 A (43)申请公布日 2015.04.01 CN 1044。

3、79015 A 1/1 页 2 1.一种针对中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的纳米抗体 VHH 链， 包括框架区和互 补决定区， 其特征在于 ： 所述框架区有 4 个， 分别为 FR1 至 FR4 ； 其中， FR1 的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.5 至 SEQ ID NO.8 中的一种， FR2 的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.9 至 SEQ ID NO.12 中的一种 ； FR3 的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.13 至 SEQ ID NO.16 中的一种 ； FR4 的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.17 至 SEQ ID NO.20 中的一种 ； 所述互补决定区。

4、有 3 个， 分别为 CDR1 至 CDR3 ； 其中， CDR1 的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.21 至 SEQ ID NO.24 中的一种 ； CDR2 的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.25 至 SEQ ID NO.28 中的一种 ； CDR3 的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.29 至 SEQ ID NO.32 中的一种。 2.一种针对 NGAL 的纳米抗体， 它包括权利要求 1 所述的纳米抗体 VHH 链。 3.根据权利要求 2 所述的一种针对 NGAL 的纳米抗体， 其特征在于 ： 包括 NGAL#1、 NGAL#2、 NGAL#3 和 NGAL#4 ； 所述 NG。

5、AL#1 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示 ； NGAL#2 的氨基 酸序列如 SEQ ID NO.2 所示， NGAL#3 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.3 所示， NGAL#4 的氨基酸 序列如 SEQ ID NO.4 所示。 4.一种 DNA 分子， 其编码权利要求 2 或 3 任一项所述的针对 NGAL 的纳米抗体。 5.一种核酸分子， 其包括框架区和可变区， 其核苷酸序列选自SEQ ID NO.33至SEQ ID NO.36 中的一种。 6.一种宿主细胞， 其包含权利要求2或3任一项所述的针对NGAL的纳米抗体的表达载 体。 7.权利要求 2 或 3 任一项所述的针。

6、对 NGAL 的纳米抗体在制备早期肾损伤检测试剂盒 中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104479015 A 2 1/4 页 3 针对 NGAL 表位的纳米抗体及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 特别涉及一种针对 NGAL 表位的纳米抗体及其应用。 背景技术 0002 NGAL 蛋白质是在包括肾小管在内的一些组织器官的中性粒细胞和上皮细胞中表 达的小分子分泌性蛋白。 是Lipocalin蛋白家族新成员之一， 由一条含197个氨基酸残基的 肽链构成， 全长 5869bp， 其分子量小 (25KDa) 且不易降解， 因此易于从血清或尿液中检出。 最近的研究表明， NGAL 。

7、是诊断急性肾损伤最有效的生物学标志之一。正常情况下， NGAL 蛋 白质水平维持一个较低的水平 ； 当肾脏在受到毒性物质侵害或发生缺血性损伤刺激时， 肾 小管上皮细胞分泌 NGAL 水平在 2 小时内迅速显著升高， 并释放到尿液和血浆中， 因此被作 为早期敏感的肾损伤生物标志物。 另外NGAL基因在多种恶性肿瘤中如 ： 乳腺癌、 食管癌、 肝 癌、 胰腺癌等多种恶性肿瘤中异常表达， 与癌细胞的转移也密切相关， 可能在恶性肿瘤的早 期诊断等方面存在着潜在的应用价值。 研究表明， NGAL可能参与了多种生命活动的过程， 包 括胚胎发育、 细胞分化、 炎症免疫反应、 细胞凋亡、 信号转导、 脂质代谢。

8、、 肿瘤的发生发展等。 目前市场常见的 NGAL 检测方法， 有些是 ELISA 试剂盒， 需要板式或管式固定包被抗原或抗 体， 但是有一定的局限性， 对 NGAL 蛋白的检测不够灵敏， 且由于单克隆抗体本身对反应环 境的要求较高， 也限制了很多更优化的化学检测方法的实施。 0003 纳米抗体技术， 是在传统抗体制备的基础上， 运用分子生物学技术融合纳米粒 子概念进行的抗体工程革命， 从而研发出的最新、 最小的抗体分子。普通的抗体蛋白由 两条重链和两条轻链组成， 而 1993 年， Hamers-Casterman 等报道从骆驼血液中发现的 新型抗体天然缺失轻链 , 只有两条重链， 即重链抗体。

9、 (HCAbs)。重链抗体 (heavy chain antibody， hcAb) 又 称 纳 米 抗 体 (Nanobody) 或 单 域 抗 体 (single domain antibody， sdAb)， 是一种新型的抗体形式， 以其分子量小、 稳定性强、 可溶性好、 易表达、 产量高、 免疫 原性低、 耐高温、 耐酸钾等多种优势闻名。它具有独特的重链可变区 (VHH)， 一个铰链区 和两个恒定区 (CH2 和 CH3)， 而纳米抗体缺乏轻链。因此， 纳米抗体仅靠 3 个互补决定区 (complementarity-determining region， CDR) 就具备了特异的抗原。

10、结合能力和高亲合力， 而普通抗体则需要 6 个 CDRs。这些 “重链抗体” 能像正常抗体一样与抗原等靶标紧紧结合， 但不像单链抗体那样相互黏连聚集成块。其晶体结构直径 215nm、 长 4nm， 分子量只有普通 抗体的 1/10， 化学性质很灵活， 稳定性好， 可溶性高， 表达容易、 容易获得且容易偶联其他分 子， 并具有独特的识别构造表位， 可作为疾病诊断和肿瘤诊断的工具， 有广阔的应用前景。 发明内容 0004 发明目的 ： 为了克服上述现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种针对 NGAL 表位的纳米抗体及其应用。 0005 技术方案 ： 本发明提供的一种针对中性粒细胞明胶酶相关脂质。

11、运载蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin NGAL)的纳米抗体VHH链， 包括框架区和 说 明 书 CN 104479015 A 3 2/4 页 4 互补决定区 ： 0006 其中， 所述框架区有 4 个， 分别为 FR1 至 FR4 ； 其中， FR1 的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.5 至 SEQ ID NO.8 中的一种， FR2 的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.9 至 SEQ ID NO.12 中的 一种 ； FR3 的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.13 至 SEQ ID NO.16 中的一种 ； FR4 的氨基。

12、酸序列 选自 SEQ ID NO.17 至 SEQ ID NO.20 中的一种 ； 0007 其中， 所述互补决定区有 3 个， 分别为 CDR1 至 CDR3 ； 其中， CDR1 的氨基酸序列选 自 SEQ ID NO.21 至 SEQ ID NO.24 中的一种 ； CDR2 的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.25 至 SEQ ID NO.28 中的一种 ； CDR3 的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.29 至 SEQ ID NO.32 中的一种。 0008 本发明还提供了一种针对 NGAL 的纳米抗体， 它包括权利要求 1 所述的纳米抗体 VHH 链。 0009 优选地， 所述。

13、针对 NGAL 的纳米抗体， 包括 NGAL#1、 NGAL#2、 NGAL#3 和 NGAL#4 ； 所 述 NGAL#1 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示 ； NGAL#2 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 所示， NGAL#3 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.3 所示， NGAL#4 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.4 所示。 0010 本发明还提供了一种 DNA 分子， 其编码权利要求 2 或 3 任一项所述的针对 NGAL 的 纳米抗体。 0011 本发明还提供了一种核酸分子， 其包括框架区和可变区， 其核苷酸序列选自 SEQ ID NO.33 至 SEQ 。

14、ID NO.36 中的一种。 0012 本发明还提供了一种宿主细胞， 其包含上述针对 NGAL 的纳米抗体的表达载体。 0013 本发明还提供了上述针对 NGAL 的纳米抗体在制备早期肾损伤检测试剂盒中的应 用。 0014 有益效果 ： 本发明提供的纳米抗体是一种针对中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋 白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin， NGAL)抗原表位的纳米抗体(也称单 域抗体片段， single domain antibody fragment)， 该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表 达， 可应用于急性肾损伤以及恶性肿瘤早期的诊断研究。 。

15、0015 本发明首先表达人源 NGAL 抗原， 然后将其偶联在酶标板上， 展示该蛋白的正确空 间结构， 以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库 ( 骆驼重链抗体噬 菌体展示基因库 )， 筛选得到 NGAL 特异性的纳米抗体基因， 将此基因转至大肠杆菌中， 从而 建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。 0016 本发明的重点是针对 NGAL 特异的纳米抗体， 它的特异性主要存在于互补决定区 也就是CDR区的序列 ； 由于这几种NGAL的纳米抗体的多样性， 也就是NGAL不同纳米抗体之 间的区别也在于互补决定区 (CDR 区 )。同时， 本发明经过大量试验获得了框架区的序列。 。

16、附图说明 0017 图1为NGAL抗原纯化SDS-聚丙烯凝胶电泳图， 从左到右各蛋白带分别是 ： 第一条 为蛋白分子标准， 第二条为纯化后的 NGAL 蛋白质。 0018 图 2 为纳米抗体的 DNA 电泳图， 从左到右凝胶孔的 DNA 条带分别是 ： 第一道为 200bp 的分子标记， 其余孔道为 PCR 产物， PCR 产物带约为 500bp。 0019 图 3 为表达的 NGAL 的纳米抗体， 经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的 SDS-PAGE 的 电泳图。 说 明 书 CN 104479015 A 4 3/4 页 5 具体实施方式 0020 实施例 1 0021 针对中性粒细胞明胶酶相关。

17、脂质运载蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin NGAL) 纳米抗体文库的构建， 包括以下步骤 ： 0022 (1) 将 1mg NGAL 与弗氏佐剂等体积混合， 免疫一只新疆单峰驼， 每周一次， 共免疫 7 次， 刺激 B 细胞表达抗原特异性的纳米抗体 ； 0023 (2)7 次免疫后， 提取 100mL 骆驼外周血淋巴细胞并提取总 RNA ； 0024 (3) 反转录合成 cDNA 并利用巢式 PCR 经过两次扩增得到 VHH 片段， 第一次 PCR 引 物 ： 上游引物 ： GTC CTG GCT GCT CTT CTA CAA GG。

18、C， 下游引物 ： GGT ACG TGC TGT TGA ACT GTT CC ； 第二次 PCR 以第一次 PCR 产物为模板， 上游引物 ： GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGR GGA GG， 下游引物 ： GGA CTA GTG CGG CCG CTG GAG ACG GTG ACC TGG GT ； 0025 (4) 利用限制性内切酶 PstI 及 NotI 酶切 20ug pMECS 载体及 10ug VHH 并连接两 个片段 ； 0026 (5) 将连接产物转化至电转感受态细胞 TG1 中， 构建 NGAL 纳米抗体文库并测定库 容， 库容大小为 1.。

19、15108。 0027 实施例 2 0028 NGAL 纳米抗体筛选过程 ： 0029 (1)将溶解在100mM NaHCO3(pH8.2)中的20ug NGAL偶联在NUNC酶标板上， 4 放置过夜 ； 0030 (2) 第二天加入 100uL 0.1酪蛋白， 室温封闭 2h ； 0031 (3) 加入 100uL 噬菌体 (51011tfu 免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库 )， 室温作 用 1h ； 0032 (4) 用 0.05 PBS+Tween-20 洗 5 遍， 以洗掉不结合的噬菌体 ； 0033 (5)用100mM TEA(triethylamine)解离与NGAL特异性结合的噬。

20、菌体， 感染处于对 数生长期的大肠杆菌 TG1， 37培养 1h， 产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选， 相同筛选过 程重复 3-4 轮， 逐步得到富集。 0034 实施例 3 0035 用噬菌体的酶联免疫方法 (ELISA) 筛选特异性单个阳性克隆 ： 0036 (1)经过3-4轮筛选， 从含有噬菌体的细胞培养平板中， 挑选96个单菌落并接种于 24 孔细胞培养板中， 生长至对数期后， 加 1mM IPTG， 28培养过夜 ； 0037 (2) 利用渗透法获得粗提抗体， 并将抗体转移到经抗原包被的 ELISA 板中， 室温放 置 1h ； 0038 (3)用PBST洗去未结合的抗体， 加入mo。

21、use anti-HA tag antibody， 室温放置1h ； 0039 (4) 用 PBST 洗 去 未 结 合 的 抗 体， 加 入 anti-mouse alkaline phosphatase conjugate， 室温放置 1h ； 0040 (5)用PBST洗去未结合的抗体， 加入显色液， 于ELISA仪上， 在405nm波长， 读取吸 光值 ； 0041 (6) 当样品孔 OD 值大于对照孔 OD 值 2 倍以上时， 判为阳性克隆 ； 说 明 书 CN 104479015 A 5 4/4 页 6 0042 (7) 纯化阳性克隆的质粒并进行测序验证。 0043 依据各个克隆株。

22、的基因序列， 把 CDR1， CDR2， CDR3 序列相同的株视为同一克隆株， 其序列不同的株视为不同克隆株。 0044 实施例 4 0045 纳米抗体在大肠杆菌中表达、 纯化 ： 0046 (1) 将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌 WK6 中， 并将其 涂布在含有氨苄青霉素和葡萄糖的 LA+GLU 板上， 37培养过夜 ； 0047 (2) 挑选单菌落接种在 5mL LA 培养液中， 37摇床培养过夜 ； 0048 (3) 接种 1mL 的过夜菌种至 330mL TB 培养液中， 37摇床培养， 培养到 OD 值达到 0.6-1 时， 加入 1M IPTG， 28诱导过。

23、夜 ； 0049 (4) 离心， 收菌 ； 0050 (5) 利用渗透法， 获得抗体粗提液 ； 0051 (6) 经镍柱离子亲和层析可制备纯度较高的蛋白。 0052 实施例 5 0053 NGAL 纳米抗体温度耐受性检测 0054 (1) 将 NGAL 蛋白质的纳米抗体放到不同温度条件下 ： 25 24h， 30 24h， 37 24h， 45 24h， 75 10min， 75 1h， 95 10min， 95 1h 放置 ； 0055 (2) 将 NGAL 蛋白经碳酸盐透析后包被在酶标板上， 同时做空白孔对照 ( 只包被 NaHCO3) ； 0056 (3) 将不同处理的 NGAL 纳米抗。

24、体分别转移到经抗原包被的 ELISA 板中， 在室温下 放置 1 小时 ； 0057 (4) 用 PBST 洗去未结合的抗体， 加入一抗 mouse anti-HA tag antibody( 抗鼠抗 HA 抗体， 购自北京康为世纪生物科技有限公司 )， 在室温下放置 1 小时 ； 0058 (5) 用 PBST 洗去未结合的抗体， 加入二抗 anti-mouse alkaline phosphatase conjugate( 山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体， 购自艾美捷科技有限公司 )， 在室温下放置 1 小时 ； 0059 (6) 用 PBST 洗去未结合的抗体， 加入碱性磷酸酶显色液， 于。

25、 ELISA 仪上， 在 405nm 波长， 读取吸收值。结果见表 1， 结果显示 ： NGAL 的纳米抗体有较好的温度耐受性。 0060 表 1 0061 0062 而 NGAL 纳米抗体耐高温的特性也为我们之后结合光电化学免疫传感器进行高特 异性和高灵敏度的检测提供了可能。 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出 ： 对于 本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和 润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 104479015 A 6 1/30 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 104479015 A 7 。

26、2/30 页 8 0003 序 列 表 CN 104479015 A 8 3/30 页 9 0004 序 列 表 CN 104479015 A 9 4/30 页 10 0005 序 列 表 CN 104479015 A 10 5/30 页 11 0006 序 列 表 CN 104479015 A 11 6/30 页 12 0007 序 列 表 CN 104479015 A 12 7/30 页 13 0008 序 列 表 CN 104479015 A 13 8/30 页 14 0009 序 列 表 CN 104479015 A 14 9/30 页 15 0010 序 列 表 CN 1044790。

27、15 A 15 10/30 页 16 0011 序 列 表 CN 104479015 A 16 11/30 页 17 0012 序 列 表 CN 104479015 A 17 12/30 页 18 0013 序 列 表 CN 104479015 A 18 13/30 页 19 0014 序 列 表 CN 104479015 A 19 14/30 页 20 0015 序 列 表 CN 104479015 A 20 15/30 页 21 0016 序 列 表 CN 104479015 A 21 16/30 页 22 0017 序 列 表 CN 104479015 A 22 17/30 页 23 0。

28、018 序 列 表 CN 104479015 A 23 18/30 页 24 0019 序 列 表 CN 104479015 A 24 19/30 页 25 0020 序 列 表 CN 104479015 A 25 20/30 页 26 0021 序 列 表 CN 104479015 A 26 21/30 页 27 0022 序 列 表 CN 104479015 A 27 22/30 页 28 0023 序 列 表 CN 104479015 A 28 23/30 页 29 0024 序 列 表 CN 104479015 A 29 24/30 页 30 0025 序 列 表 CN 1044790。

29、15 A 30 25/30 页 31 0026 序 列 表 CN 104479015 A 31 26/30 页 32 0027 序 列 表 CN 104479015 A 32 27/30 页 33 0028 序 列 表 CN 104479015 A 33 28/30 页 34 0029 序 列 表 CN 104479015 A 34 29/30 页 35 0030 序 列 表 CN 104479015 A 35 30/30 页 36 序 列 表 CN 104479015 A 36 1/2 页 37 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104479015 A 37 2/2 页 38 图 3 说 明 书 附 图 CN 104479015 A 38 。