广东崖豆藤的组培育苗方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410798739.1 (22)申请日 2014.12.18 A01H 4/00(2006.01) A01G 1/00(2006.01) (71)申请人曾雷地址 510520 广东省广州市天河区广汕一路 233 号申请人谢鉴能 (72)发明人曾雷谢鉴能温依娇 (74)专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司 44245 代理人苏运贞 (54) 发明名称广东崖豆藤的组培育苗方法 (57) 摘要本发明公开一种广东崖豆藤的组培育苗方法。本发明的方法包括种子消毒与催芽、选萌发的无菌胚轴为外植体、不定芽增殖、。

2、生根培养、炼苗和移栽，获得广东崖豆藤种苗。其中，继代增殖培养基的组成为 MS 培养基 +6-BA 0.3 0.5mg/ L+TDZ 0.06 0.1mg/L+NAA 0.15 0.3mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉胶 5.8g/L， pH 值 5.5 5.8。利用本发明的方法培育广东崖豆藤种苗具有遗传稳定性好、繁殖速度快、育苗周期短、成本低廉、操作简便的特征；且实验设施要求不高，操作过程简单，实现了规模化繁殖广东崖豆藤种苗，结果稳定可靠。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书5页。

3、附图9页 (10)申请公布号 CN 104429971 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104429971 A 1/1 页 2 1.一种广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 种子消毒与催芽：选择均匀饱满的广东崖豆藤 (Millettia fordii Dunn) 种子，先用自来水冲洗，再在无菌室消毒后，进行催芽； (2) 选择外植体：选择步骤 (1) 催芽后萌发的无菌胚轴为外植体； (3) 不定芽增殖：将步骤 (2) 的外植体接种于继代增殖培养基上，进行增殖培养，获得不定芽； (4) 生根培养：将步骤 (3) 获。

4、得的不定芽，接种于生根培养基上诱导生根，获得生根苗； (5) 炼苗和移栽：将步骤 (4) 获得的生根苗，炼苗后移栽，获得广东崖豆藤种苗；步骤 (3) 中所述的继代增殖培养基的组成为 MS 培养基 +6-BA 0.3 0.5mg/L+TDZ 0.06 0.1mg/L+NAA 0.15 0.3mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉胶 5.8g/L， pH 值 5.5 5.8。 2.根据权利要求 1 所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于：步骤 (1) 中所述的消毒的条件为用体积分数 75酒精消毒 8 15min，用无菌水冲洗 2 3 次；再用 1g/L 氯化汞消毒。

5、 4 8min，用无菌水冲洗 4 6 次。 3.根据权利要求 1 所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于：步骤 (1) 中所述的催芽的条件为将消毒后的种子接种到无菌的湿润纱布或 MS 培养基中，催芽 20 30 天，温度 20 25，光照时间 12h/d、光照强度 2,000 3,000lux。 4.根据权利要求 1 所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于：步骤 (3) 中所述的培养的条件为温度 24 30，培养 24 30 天、相对湿度 60 70、光照时间 12h/d、光照强度 2,000 3,000lux。 5.根据权利要求 1 所述的广东崖豆藤的。

6、组培育苗方法，其特征在于：步骤(4)中所述的生根培养基的组成为1/2MS培养基+IBA 0.30.4mg/L+蔗糖15g/ L+ 卡拉胶 5.8g/L， pH 值 5.5 5.8。 6.根据权利要求 1 所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于：步骤(4)中所述的诱导生根的条件为温度2832，相对湿度7590，光照条件为接种后先暗培养 5 天、随后用自然散射光培养 25 30 天，光照时间 12h/d。 7.根据权利要求 1 所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于：步骤 (5) 中所述的炼苗的条件为将生根苗转入薄膜大棚后，炼苗 25 30 天。 8.根据权利。

7、要求 1 所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于：步骤 (5) 中所述的移栽的条件为炼苗后移栽至黄心土中，覆盖薄膜，加盖遮阳网，移栽 7 10 天后，喷施质量百分比 0.1的杀菌药一次， 30 40 天后掀去薄膜和遮阳网。权利要求书 CN 104429971 A 2 1/5 页 3 广东崖豆藤的组培育苗方法技术领域 0001 本发明属于应用生物学、农业生物技术领域，特别涉及一种广东崖豆藤的组培育苗方法。背景技术 0002 广东崖豆藤(Millettia fordii Dunn)产于广东、广西，生于海拔500米左右的山谷疏林中。藤本；羽状复叶；。

8、总状花序通常腋生；荚果线形；种子褐色，卵形，长约 7 毫米，宽约 6 毫米，光滑；花期 9 10 月，果期 11 月。 0003 民间认为广东崖豆藤具有润肺止咳、健脾补虚、壮阳补肾等功效。因此，在广西梧州地区和广州帽峰山一带，盛行用广东崖豆藤的根与猪骨配伍煲汤。由于人工无序采挖，导致野外资源日渐减少，市场价格逐年升高。广州市大有玉铉农业发展有限公司为缓解市场的紧缺需求，决定建立广东崖豆藤的规模化人工种植基地。但因广东崖豆藤目前仍属野生状态，种子来源极少，扦插繁殖速度慢，急需解决种苗的供应问题。 0004 植物的组织培养快繁技术具有占用空间小。

9、，不受地区、季节限制，投资少，经济效益高等优势，通过无菌操作，在人工控制条件下短时间大量繁殖目标植物，获得再生的完整植株。迫切需要研究开发广东崖豆藤的组织培养技术，通过组培技术实现广东崖豆藤种苗的规模化繁殖，解决广东崖豆藤种子少、制约生产发展的难题。发明内容 0005 为了克服现有繁殖技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种广东崖豆藤的组培育苗方法。利用该方法培育广东崖豆藤种苗具有遗传稳定性好、繁殖速度快、育苗周期短、成本低廉、操作简便的特征；且实现了规模化繁殖广东崖豆藤种苗，结果稳定可靠。 0006 本发明的目的通过下述技术方案实现：一。

10、种广东崖豆藤的组培育苗方法，包括种子消毒与催芽、不定芽增殖、生根培养和试管苗移栽步骤：将均匀饱满的广东崖豆藤种子用体积浓度为 75的酒精和 1g/L 的氯化汞消毒后，播入无菌的湿润纱布或 MS 培养基中；以萌芽种子的胚轴为外植体，在 MS+6BA+TDZ+NAA 培养基上进行不定芽分化、增殖，在 1/2MS+IBA 培养基上进行生根培养，生根苗炼苗后移栽，形成完成的植株再生体系。 0007 所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，包括如下步骤： 0008 (1) 种子消毒与催芽：选择均匀饱满的广东崖豆藤 (Millettia fordii Dunn) 种子，。

11、先用自来水冲洗，再在无菌室消毒后，进行催芽； 0009 (2) 选择外植体：选择步骤 (1) 催芽后萌发的无菌胚轴为外植体； 0010 (3) 不定芽增殖：将步骤 (2) 的外植体接种于继代增殖培养基上，进行增殖培养，获得不定芽； 0011 (4) 生根培养：将步骤 (3) 获得的不定芽，接种于生根培养基上诱导生根，获得生根苗； 0012 (5) 炼苗和移栽：将步骤 (4) 获得的生根苗，炼苗后移栽，获得广东崖豆藤种苗。说明书 CN 104429971 A 3 2/5 页 4 0013 步骤 (1) 中所述的消毒的条件优选为用 75 (v/v) 。

12、酒精消毒 8 15min，用无菌水冲洗 2 3 次；再用 1g/L 氯化汞消毒 4 8min，用无菌水冲洗 4 6 次； 0014 步骤 (1) 中所述的催芽的条件优选为将消毒后的种子接种到无菌的湿润纱布或 MS 培养基中，催芽 20 30 天，温度 20 25，光照时间 12h/d、光照强度 2,000 3,000lux ； 0015 步骤 (3) 中所述的继代增殖培养基的组成优选为 MS 培养基 +6-BA 0.3 0.5mg/ L+TDZ 0.060.1mg/L+NAA 0.150.3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶5.8g/L， pH值5.55.8 ；所述的6-。

13、BA指6-苄基腺嘌呤；所述的NAA，指a-萘乙酸；所述的TDZ指噻重氮苯基脲，商品名噻苯隆(Thidiazuron， N-Phenyl-N -1,2,3-thiadiazol-5-ylurea， N-苯基-N-1,2,3-噻二唑 -5- 脲， TDZ) ； 0016 步骤 (3) 中所述的培养的条件优选为温度 24 30，培养 24 30 天、相对湿度 60 70、光照时间 12h/d、光照强度 2,000 3,000lux ； 0017 步骤 (4) 中所述的生根培养基的组成优选为 1/2MS 培养基 +IBA 0.3 0.4mg/L+ 蔗糖 15g/L+ 卡拉胶 5。

14、.8g/L， pH 值 5.5 5.8 ；所述的 IBA，指吲哚丁酸；所述的 1/2MS 培养基是指 MS 培养基的大量元素减半； 0018 步骤(4)中所述的诱导生根的条件优选为温度2832，相对湿度7590，光照条件为接种后先暗培养 5 天、随后用自然散射光培养 25 30 天，光照时间 12h/d ； 0019 步骤 (5) 中所述的炼苗的条件优选为将生根苗转入薄膜大棚后，炼苗 25 30 天； 0020 步骤 (5) 中所述的移栽的条件优选为炼苗后移栽至黄心土中，覆盖薄膜，加盖遮阳网，移栽 7 10 天后，喷施 0.1 (m/m) 的杀菌药一次， 30。

15、 40 天后掀去薄膜和遮阳网； 0021 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： 0022 (1)通过本发明的方法获得的种苗遗传性状好，结果稳定可靠。本发明采用的材料为优良种子，依据植物细胞的全能性，每个种子繁育的后代遗传性非常一致，能够保持原有品种的优良性状。 0023 (2) 实验设施要求不高，操作过程简单。采用本发明培育广东崖豆藤种苗，所需的仪器和药品均为组培常规设备和常用药品，所涉及的外植体选择与消毒、不定芽增殖、生根培养和试管苗移栽等操作过程，一般人员经过培训均可达到技术要求，一般的组培厂均能依照本发明开展广东崖豆藤的组培生产。 0024 (。

16、3) 本发明的方法具有繁殖速度快、育苗周期短、成本低廉的特点。 0025 (4)繁殖系数高，可规模化生产广东崖豆藤种苗。本发明的广东崖豆藤组培育苗技术，是在人工控制条件下的进行生产，受自然环境中影响较小；只需截取种子胚轴作为繁殖材料， 25天增殖一次，增殖倍数达到4.2， 30天可完成生根培养，生根率达到60以上；利用本发明可以周年开展、工厂化大量繁殖广东崖豆藤种苗。附图说明 0026 图 1 是实施例 1 中接种到继代增殖培养基 10 天后不定芽增殖的示意图。 0027 图 2 是实施例 1 中接种到继代增殖培养基 25 天后不定芽增殖的示意图。 0028 。

17、图 3 是实施例 1 中接种到生根培养基 20 天后生根苗的示意图。 0029 图 4 是实施例 1 中接种到生根培养基 30 天后生根苗的示意图。说明书 CN 104429971 A 4 3/5 页 5 0030 图 5 是实施例 1 中移栽以黄心土为基质的育苗袋中 15 天后生根苗的示意图。 0031 图 6 是实施例 1 中移栽以黄心土为基质的育苗袋中 30 天后生根苗的示意图。 0032 图 7 是实施例 2 中接种到继代增殖培养基 13 天后不定芽增殖的示意图。 0033 图 8 是实施例 2 中接种到继代增殖培养基 28 天后不定芽增殖的示意图。 0034 图 9 是实施例。

18、2 中接种到生根培养基 20 天后生根苗的示意图。 0035 图 10 是实施例 2 中接种到生根培养基 30 天后生根苗的示意图。 0036 图 11 是实施例 2 中移栽以黄心土为基质的育苗袋中 10 天后生根苗的示意图。 0037 图 12 是实施例 2 中移栽以黄心土为基质的育苗袋中 25 天后生根苗的示意图。 0038 图 13 是实施例 3 中接种到继代增殖培养基 15 天后不定芽增殖的示意图。 0039 图 14 是实施例 3 中接种到继代增殖培养基 25 天后不定芽增殖的示意图。 0040 图 15 是实施例 3 中接种到生根培养基 15 天后生根苗的示意图。 0041 图 1。

19、6 是实施例 3 中接种到生根培养基 30 天后生根苗的示意图。 0042 图 17 是实施例 3 中移栽以黄心土为基质的育苗袋中 12 天后生根苗的示意图。 0043 图 18 是实施例 3 中移栽以黄心土为基质的育苗袋中 30 天后生根苗的示意图。具体实施方式 0044 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 0045 实施例 1 0046 (1) 种子消毒与催芽：广东崖豆藤 (Millettia fordii Dunn) 种子购自广州市大有玉铉农业发展有限公司；挑选成熟、饱满、均匀的种子，用自来水仔细清洗表皮后，放置于超净工。

20、作台上；在消毒瓶中倒入 75的酒精，左右晃动，消毒 8min，用无菌水冲洗 2 次；再倒入 1g/L 的氯化汞消毒 4min，最后用无菌水冲洗 4 次；放置在无菌的湿润纱布中，用纱布把种子覆盖。消毒后种子的无污染率可达 70.6。 0047 (2)选择外植体：种子接种15天后，开始萌芽； 30天时，萌芽长至3cm高，挑选无污染的健壮的萌芽条，切掉胚根和子叶后，取胚轴作为外植体。总发芽率达 85.0。 0048 (3) 不定芽增殖：将步骤 (2) 获得的外植体接种于继代增殖培养基 (MS 培养基 +6-BA 0.3mg/L+TDZ 0.1mg/L+。

21、NAA 0.15mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉胶 5.8g/L， pH 值 5.5) 上，进行增殖培养，获得不定芽；培养条件：温度 24、相对湿度 60、光照时间 12h/d、光强强度3,000lux，每25天将增殖的不定芽转接一次，试验结果见图1和图2 ；继代增殖倍数可达 3.2。 0049 (4) 生根培养：将步骤 (3) 获得的不定芽，在超净工作台上切成 2 2.5cm 长，接种于生根培养基 (1/2MS 培养基 +IBA 0.3mg/L+ 蔗糖 15g/L+ 卡拉胶 5.8g/L， pH 值 5.5) 上培养，获得生根苗；培养条件：。

22、温度 28、相对湿度 75、光照条件为接种后先暗培养 5 天、随后用自然散射光培养 25 天，光照时间 12h/d，试验结果见图 3 和图 4 ；生根率达 62。 0050 (5) 炼苗和移栽：将步骤 (4) 获得的生根苗转入薄膜大棚后，炼苗 30 天、待根系长至 1 2cm 后，取出瓶苗，洗掉培养基后移栽至黄心土中，覆盖薄膜，加盖遮阳网，移栽 7 天后，喷0.1(m/m)的杀菌药一次， 30天后掀去薄膜和遮阳网，获得广东崖豆藤种苗，用苗圃的常规方法进行管理，试验结果见图 5 和图 6。说明书 CN 104429971 A 5 4/5 页 6 。

23、0051 实施例 2 0052 (1) 种子消毒与催芽：广东崖豆藤 (Millettia fordii Dunn) 种子购自广州市大有玉铉农业发展有限公司；挑选成熟、饱满、均匀的种子，用自来水仔细清洗表皮后，放置于超净工作台上；在消毒瓶中倒入 75的酒精，左右晃动，消毒 12min，用无菌水冲洗 2 次；再倒入 1g/L 的氯化汞消毒 6min，最后用无菌水冲洗 4 次；放置在无菌的湿润纱布中，用纱布把种子覆盖。消毒后种子的无污染率可达 73。 0053 (2)选择外植体：种子接种15天后，开始萌芽； 30天时，萌芽长至3cm高，挑选无。

24、污染的健壮的萌芽条，切掉胚根和子叶后，取胚轴作为外植体。总发芽率达 85.2。 0054 (3) 不定芽增殖：将步骤 (2) 获得的外植体接种于继代增殖培养基 (MS 培养基 +6-BA 0.4mg/L+TDZ 0.08mg/L+NAA 0.2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉胶 5.8g/L， pH 值 5.6) 上，进行增殖培养，获得不定芽；培养条件：温度 28、相对湿度 65、光照时间 12h/d、光强强度2,500lux，每25天将增殖的不定芽转接一次，试验结果见图7和图8 ；继代增殖倍数可达 3.8。 0055 (4) 生根培养：将步骤 (3。

25、) 获得的不定芽，接种于生根培养基 (1/2MS 培养基 +IBA 0.35mg/L+ 蔗糖 15g/L+ 卡拉胶 5.8g/L， pH 值 5.7) 上培养，获得生根苗；培养条件：温度 30、相对湿度 80、光照条件为接种后先暗培养 5 天、随后用自然散射光培养 25 天，光照时间 12h/d，试验结果见图 9 和图 10 ；生根率达 64。 0056 (5) 炼苗和移栽：将步骤 (4) 获得的生根苗转入薄膜大棚后，炼苗 30 天、待根系长至 1 2cm 后，取出瓶苗，洗掉培养基后移栽至黄心土中，覆盖薄膜，加盖遮阳网，移栽 8 天后，喷0.1。

26、(m/m)的杀菌药一次， 35天后掀去薄膜和遮阳网，获得广东崖豆藤种苗，用苗圃的常规方法进行管理，试验结果见图 11 和图 12。 0057 实施例 3 0058 (1) 种子消毒与催芽：广东崖豆藤 (Millettia fordii Dunn) 种子购自广州市大有玉铉农业发展有限公司；挑选成熟、饱满、均匀的种子，用自来水仔细清洗表皮后，放置于超净工作台上；在消毒瓶中倒入 75的酒精，左右晃动，消毒 15min，用无菌水冲洗 2 次；再倒入 1g/L 的氯化汞消毒 8min，最后用无菌水冲洗 4 次；放置在无菌的湿润纱布中，用纱布把种子覆盖。

27、。消毒后种子的无污染率可达 90。 0059 (2)选择外植体：种子接种15天后，开始萌芽； 30天时，萌芽长至3cm高，挑选无污染的健壮的萌芽条，切掉胚根和子叶后，取胚轴作为外植体。总发芽率达 86。 0060 (3) 不定芽增殖：将步骤 (2) 获得的外植体接种于继代增殖培养基 (MS 培养基 +6-BA 0.5mg/L+TDZ 0.1mg/L+NAA 0.3mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉胶 5.8g/L， pH 值 5.8) 上，进行增殖培养，获得不定芽；培养条件：温度 30、相对湿度 70、光照时间 12h/d、光强强度 2,000lux。

28、，每 25 天将增殖的不定芽转接一次，试验结果见图 13 和图 14 ；继代增殖倍数可达 4.2。 0061 (4) 生根培养：将步骤 (3) 获得的不定芽，接种于生根培养基 (1/2MS 培养基 +IBA 0.4mg/L+ 蔗糖 15g/L+ 卡拉胶 5.8g/L， pH 值 5.8) 上培养，获得生根苗；培养条件：温度 32、相对湿度 90、光照条件为接种后先暗培养 5 天、随后用自然散射光培养 25 天，光照时间 12h/d，试验结果见图 15 和图 16 ；生根率达 64.6。 0062 (5) 炼苗和移栽：将步骤 (4) 获得的生根苗转入薄膜大。

29、棚后，炼苗 30 天、待根系长说明书 CN 104429971 A 6 5/5 页 7 至 1 2cm 后，取出瓶苗，洗掉培养基后移栽至黄心土中，覆盖薄膜，加盖遮阳网，移栽 10 天后，喷0.1(m/m)的杀菌药一次， 40天后掀去薄膜和遮阳网，获得广东崖豆藤种苗，用苗圃的常规方法进行管理，试验结果见图 17 和图 18。 0063 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。说明。

30、书 CN 104429971 A 7 1/9 页 8 图 1 图 2 说明书附图 CN 104429971 A 8 2/9 页 9 图 3 图 4 说明书附图 CN 104429971 A 9 3/9 页 10 图 5 图 6 说明书附图 CN 104429971 A 10 4/9 页 11 图 7 图 8 说明书附图 CN 104429971 A 11 5/9 页 12 图 9 图 10 说明书附图 CN 104429971 A 12 6/9 页 13 图 11 图 12 说明书附图 CN 104429971 A 13 7/9 页 14 图 13 图 14 说明书附图 CN 104429971 A 14 8/9 页 15 图 15 图 16 说明书附图 CN 104429971 A 15 9/9 页 16 图 17 图 18 说明书附图 CN 104429971 A 16 。

摘要
申请专利号：	CN201410798739.1	申请日：	2014.12.18
公开号：	CN104429971A	公开日：	2015.03.25
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|专利申请权的转移IPC(主分类):A01H 4/00登记生效日:20161026变更事项:申请人变更前权利人:曾雷变更后权利人:广州市鲸力生物科技有限公司变更事项:地址变更前权利人:510520 广东省广州市天河区广汕一路233号变更后权利人:511365 广东省广州市增城区中新镇合益村苦木冚变更事项:申请人变更前权利人:谢鉴能\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A01H4/00申请日:20141218\|\|\|公开
IPC分类号：	A01H4/00; A01G1/00	主分类号：	A01H4/00
申请人：	曾雷; 谢鉴能
发明人：	曾雷; 谢鉴能; 温依娇
地址：	510520广东省广州市天河区广汕一路233号
优先权：
专利代理机构：	广州市华学知识产权代理有限公司44245	代理人：	苏运贞
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内容摘要

本发明公开一种广东崖豆藤的组培育苗方法。本发明的方法包括种子消毒与催芽、选萌发的无菌胚轴为外植体、不定芽增殖、生根培养、炼苗和移栽，获得广东崖豆藤种苗。其中，继代增殖培养基的组成为MS培养基+6-BA 0.3～0.5mg/L+TDZ 0.06～0.1mg/L+NAA 0.15～0.3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶5.8g/L，pH值5.5～5.8。利用本发明的方法培育广东崖豆藤种苗具有遗传稳定性好、繁殖速度快、育苗周期短、成本低廉、操作简便的特征；且实验设施要求不高，操作过程简单，实现了规模化繁殖广东崖豆藤种苗，结果稳定可靠。

权利要求书

权利要求书
1.  一种广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)种子消毒与催芽：选择均匀饱满的广东崖豆藤(Millettia fordii Dunn)种子，先用自来水冲洗，再在无菌室消毒后，进行催芽；
(2)选择外植体：选择步骤(1)催芽后萌发的无菌胚轴为外植体；
(3)不定芽增殖：将步骤(2)的外植体接种于继代增殖培养基上，进行增殖培养，获得不定芽；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的不定芽，接种于生根培养基上诱导生根，获得生根苗；
(5)炼苗和移栽：将步骤(4)获得的生根苗，炼苗后移栽，获得广东崖豆藤种苗；
步骤(3)中所述的继代增殖培养基的组成为MS培养基+6-BA 0.3～0.5mg/L+TDZ 0.06～0.1mg/L+NAA 0.15～0.3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶5.8g/L，pH值5.5～5.8。

2.  根据权利要求1所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的消毒的条件为用体积分数75％酒精消毒8～15min，用无菌水冲洗2～3次；再用1g/L氯化汞消毒4～8min，用无菌水冲洗4～6次。

3.  根据权利要求1所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的催芽的条件为将消毒后的种子接种到无菌的湿润纱布或MS培养基中，催芽20～30天，温度20～25℃，光照时间12h/d、光照强度2,000～3,000lux。

4.  根据权利要求1所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的培养的条件为温度24～30℃，培养24～30天、相对湿度60％～70％、光照时间12h/d、光照强度2,000～3,000lux。

5.  根据权利要求1所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的生根培养基的组成为1/2MS培养基+IBA 0.3～0.4mg/L+蔗糖15g/L+卡拉胶5.8g/L，pH值5.5～5.8。

6.  根据权利要求1所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的诱导生根的条件为温度28～32℃，相对湿度75％～90％，光照条件为接种后先暗培养5天、随后用自然散射光培养25～30天，光照时间12h/d。

7.  根据权利要求1所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的炼苗的条件为将生根苗转入薄膜大棚后，炼苗25～30天。

8.  根据权利要求1所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的移栽的条件为炼苗后移栽至黄心土中，覆盖薄膜，加盖遮阳网，移栽7～10天后，喷施质量百分比0.1％的杀菌药一次，30～40天后掀去薄膜和遮阳网。

说明书

说明书广东崖豆藤的组培育苗方法
技术领域
本发明属于应用生物学、农业生物技术领域，特别涉及一种广东崖豆藤的组培育苗方法。
背景技术
广东崖豆藤(Millettia fordii Dunn)产于广东、广西，生于海拔500米左右的山谷疏林中。藤本；羽状复叶；总状花序通常腋生；荚果线形；种子褐色，卵形，长约7毫米，宽约6毫米，光滑；花期9～10月，果期11月。
民间认为广东崖豆藤具有润肺止咳、健脾补虚、壮阳补肾等功效。因此，在广西梧州地区和广州帽峰山一带，盛行用广东崖豆藤的根与猪骨配伍煲汤。由于人工无序采挖，导致野外资源日渐减少，市场价格逐年升高。广州市大有玉铉农业发展有限公司为缓解市场的紧缺需求，决定建立广东崖豆藤的规模化人工种植基地。但因广东崖豆藤目前仍属野生状态，种子来源极少，扦插繁殖速度慢，急需解决种苗的供应问题。
植物的组织培养快繁技术具有占用空间小，不受地区、季节限制，投资少，经济效益高等优势，通过无菌操作，在人工控制条件下短时间大量繁殖目标植物，获得再生的完整植株。迫切需要研究开发广东崖豆藤的组织培养技术，通过组培技术实现广东崖豆藤种苗的规模化繁殖，解决广东崖豆藤种子少、制约生产发展的难题。
发明内容
为了克服现有繁殖技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种广东崖豆藤的组培育苗方法。利用该方法培育广东崖豆藤种苗具有遗传稳定性好、繁殖速度快、育苗周期短、成本低廉、操作简便的特征；且实现了规模化繁殖广东崖豆藤种苗，结果稳定可靠。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种广东崖豆藤的组培育苗方法，包括种子消毒与催芽、不定芽增殖、生根培养和试管苗移栽步骤：将均匀饱满的广东崖豆藤种子用体积浓度为75％的酒精和1g/L的氯化汞消毒后，播入无菌的湿润纱布或MS培养基中；以萌芽种子的胚轴为外植体，在MS+6BA+TDZ+NAA培养基上进行不定芽分化、增殖，在1/2MS+IBA培养基上进行生根培养，生根苗炼苗后移栽，形成完成的植株再生体系。
所述的广东崖豆藤的组培育苗方法，包括如下步骤：
(1)种子消毒与催芽：选择均匀饱满的广东崖豆藤(Millettia fordii Dunn)种子，先用自来水冲洗，再在无菌室消毒后，进行催芽；
(2)选择外植体：选择步骤(1)催芽后萌发的无菌胚轴为外植体；
(3)不定芽增殖：将步骤(2)的外植体接种于继代增殖培养基上，进行增殖培养，获得不定芽；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的不定芽，接种于生根培养基上诱导生根，获得生根苗；
(5)炼苗和移栽：将步骤(4)获得的生根苗，炼苗后移栽，获得广东崖豆藤种苗。
步骤(1)中所述的消毒的条件优选为用75％(v/v)酒精消毒8～15min，用无菌水冲洗2～3次；再用1g/L氯化汞消毒4～8min，用无菌水冲洗4～6次；
步骤(1)中所述的催芽的条件优选为将消毒后的种子接种到无菌的湿润纱布或MS培养基中，催芽20～30天，温度20～25℃，光照时间12h/d、光照强度2,000～3,000lux；
步骤(3)中所述的继代增殖培养基的组成优选为MS培养基+6-BA 0.3～0.5mg/L+TDZ 0.06～0.1mg/L+NAA 0.15～0.3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶5.8g/L，pH值5.5～5.8；所述的6-BA指6-苄基腺嘌呤；所述的NAA，指a-萘乙酸；所述的TDZ指噻重氮苯基脲，商品名噻苯隆(Thidiazuron，N-Phenyl-N’-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea，N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲，TDZ)；
步骤(3)中所述的培养的条件优选为温度24～30℃，培养24～30天、相对湿度60％～70％、光照时间12h/d、光照强度2,000～3,000lux；
步骤(4)中所述的生根培养基的组成优选为1/2MS培养基+IBA 0.3～0.4mg/L+蔗糖15g/L+卡拉胶5.8g/L，pH值5.5～5.8；所述的IBA，指吲哚丁酸；所述的1/2MS培养基是指MS培养基的大量元素减半；
步骤(4)中所述的诱导生根的条件优选为温度28～32℃，相对湿度75％～90％，光照条件为接种后先暗培养5天、随后用自然散射光培养25～30天，光照时间12h/d；
步骤(5)中所述的炼苗的条件优选为将生根苗转入薄膜大棚后，炼苗25～ 30天；
步骤(5)中所述的移栽的条件优选为炼苗后移栽至黄心土中，覆盖薄膜，加盖遮阳网，移栽7～10天后，喷施0.1％(m/m)的杀菌药一次，30～40天后掀去薄膜和遮阳网；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)通过本发明的方法获得的种苗遗传性状好，结果稳定可靠。本发明采用的材料为优良种子，依据植物细胞的全能性，每个种子繁育的后代遗传性非常一致，能够保持原有品种的优良性状。
(2)实验设施要求不高，操作过程简单。采用本发明培育广东崖豆藤种苗，所需的仪器和药品均为组培常规设备和常用药品，所涉及的外植体选择与消毒、不定芽增殖、生根培养和试管苗移栽等操作过程，一般人员经过培训均可达到技术要求，一般的组培厂均能依照本发明开展广东崖豆藤的组培生产。
(3)本发明的方法具有繁殖速度快、育苗周期短、成本低廉的特点。
(4)繁殖系数高，可规模化生产广东崖豆藤种苗。本发明的广东崖豆藤组培育苗技术，是在人工控制条件下的进行生产，受自然环境中影响较小；只需截取种子胚轴作为繁殖材料，25天增殖一次，增殖倍数达到4.2，30天可完成生根培养，生根率达到60％以上；利用本发明可以周年开展、工厂化大量繁殖广东崖豆藤种苗。
附图说明
图1是实施例1中接种到继代增殖培养基10天后不定芽增殖的示意图。
图2是实施例1中接种到继代增殖培养基25天后不定芽增殖的示意图。
图3是实施例1中接种到生根培养基20天后生根苗的示意图。
图4是实施例1中接种到生根培养基30天后生根苗的示意图。
图5是实施例1中移栽以黄心土为基质的育苗袋中15天后生根苗的示意图。
图6是实施例1中移栽以黄心土为基质的育苗袋中30天后生根苗的示意图。
图7是实施例2中接种到继代增殖培养基13天后不定芽增殖的示意图。
图8是实施例2中接种到继代增殖培养基28天后不定芽增殖的示意图。
图9是实施例2中接种到生根培养基20天后生根苗的示意图。
图10是实施例2中接种到生根培养基30天后生根苗的示意图。
图11是实施例2中移栽以黄心土为基质的育苗袋中10天后生根苗的示意图。
图12是实施例2中移栽以黄心土为基质的育苗袋中25天后生根苗的示意图。
图13是实施例3中接种到继代增殖培养基15天后不定芽增殖的示意图。
图14是实施例3中接种到继代增殖培养基25天后不定芽增殖的示意图。
图15是实施例3中接种到生根培养基15天后生根苗的示意图。
图16是实施例3中接种到生根培养基30天后生根苗的示意图。
图17是实施例3中移栽以黄心土为基质的育苗袋中12天后生根苗的示意图。
图18是实施例3中移栽以黄心土为基质的育苗袋中30天后生根苗的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)种子消毒与催芽：广东崖豆藤(Millettia fordii Dunn)种子购自广州市大有玉铉农业发展有限公司；挑选成熟、饱满、均匀的种子，用自来水仔细清洗表皮后，放置于超净工作台上；在消毒瓶中倒入75％的酒精，左右晃动，消毒8min，用无菌水冲洗2次；再倒入1g/L的氯化汞消毒4min，最后用无菌水冲洗4次；放置在无菌的湿润纱布中，用纱布把种子覆盖。消毒后种子的无污染率可达70.6％。
(2)选择外植体：种子接种15天后，开始萌芽；30天时，萌芽长至3cm高，挑选无污染的健壮的萌芽条，切掉胚根和子叶后，取胚轴作为外植体。总发芽率达85.0％。
(3)不定芽增殖：将步骤(2)获得的外植体接种于继代增殖培养基(MS培养基+6-BA 0.3mg/L+TDZ 0.1mg/L+NAA 0.15mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶5.8g/L，pH值5.5)上，进行增殖培养，获得不定芽；培养条件：温度24℃、相对湿度60％、光照时间12h/d、光强强度3,000lux，每25天将增殖的不定芽转接一次，试验结果见图1和图2；继代增殖倍数可达3.2。
(4)生根培养：将步骤(3)获得的不定芽，在超净工作台上切成2～2.5cm长，接种于生根培养基(1/2MS培养基+IBA 0.3mg/L+蔗糖15g/L+卡拉胶 5.8g/L，pH值5.5)上培养，获得生根苗；培养条件：温度28℃、相对湿度75％、光照条件为接种后先暗培养5天、随后用自然散射光培养25天，光照时间12h/d，试验结果见图3和图4；生根率达62％。
(5)炼苗和移栽：将步骤(4)获得的生根苗转入薄膜大棚后，炼苗30天、待根系长至1～2cm后，取出瓶苗，洗掉培养基后移栽至黄心土中，覆盖薄膜，加盖遮阳网，移栽7天后，喷0.1％(m/m)的杀菌药一次，30天后掀去薄膜和遮阳网，获得广东崖豆藤种苗，用苗圃的常规方法进行管理，试验结果见图5和图6。
实施例2
(1)种子消毒与催芽：广东崖豆藤(Millettia fordii Dunn)种子购自广州市大有玉铉农业发展有限公司；挑选成熟、饱满、均匀的种子，用自来水仔细清洗表皮后，放置于超净工作台上；在消毒瓶中倒入75％的酒精，左右晃动，消毒12min，用无菌水冲洗2次；再倒入1g/L的氯化汞消毒6min，最后用无菌水冲洗4次；放置在无菌的湿润纱布中，用纱布把种子覆盖。消毒后种子的无污染率可达73％。
(2)选择外植体：种子接种15天后，开始萌芽；30天时，萌芽长至3cm高，挑选无污染的健壮的萌芽条，切掉胚根和子叶后，取胚轴作为外植体。总发芽率达85.2％。
(3)不定芽增殖：将步骤(2)获得的外植体接种于继代增殖培养基(MS培养基+6-BA 0.4mg/L+TDZ 0.08mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶5.8g/L，pH值5.6)上，进行增殖培养，获得不定芽；培养条件：温度28℃、相对湿度65％、光照时间12h/d、光强强度2,500lux，每25天将增殖的不定芽转接一次，试验结果见图7和图8；继代增殖倍数可达3.8。
(4)生根培养：将步骤(3)获得的不定芽，接种于生根培养基(1/2MS培养基+IBA 0.35mg/L+蔗糖15g/L+卡拉胶5.8g/L，pH值5.7)上培养，获得生根苗；培养条件：温度30℃、相对湿度80％、光照条件为接种后先暗培养5天、随后用自然散射光培养25天，光照时间12h/d，试验结果见图9和图10；生根率达64％。
(5)炼苗和移栽：将步骤(4)获得的生根苗转入薄膜大棚后，炼苗30天、待根系长至1～2cm后，取出瓶苗，洗掉培养基后移栽至黄心土中，覆盖薄膜，加盖遮阳网，移栽8天后，喷0.1％(m/m)的杀菌药一次，35天后掀去薄膜和遮阳网，获得广东崖豆藤种苗，用苗圃的常规方法进行管理，试验结果见图11和图12。
实施例3
(1)种子消毒与催芽：广东崖豆藤(Millettia fordii Dunn)种子购自广州市大有玉铉农业发展有限公司；挑选成熟、饱满、均匀的种子，用自来水仔细清洗表皮后，放置于超净工作台上；在消毒瓶中倒入75％的酒精，左右晃动，消毒15min，用无菌水冲洗2次；再倒入1g/L的氯化汞消毒8min，最后用无菌水冲洗4次；放置在无菌的湿润纱布中，用纱布把种子覆盖。消毒后种子的无污染率可达90％。
(2)选择外植体：种子接种15天后，开始萌芽；30天时，萌芽长至3cm高，挑选无污染的健壮的萌芽条，切掉胚根和子叶后，取胚轴作为外植体。总发芽率达86％。
(3)不定芽增殖：将步骤(2)获得的外植体接种于继代增殖培养基(MS培养基+6-BA 0.5mg/L+TDZ 0.1mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶5.8g/L，pH值5.8)上，进行增殖培养，获得不定芽；培养条件：温度30℃、相对湿度70％、光照时间12h/d、光强强度2,000lux，每25天将增殖的不定芽转接一次，试验结果见图13和图14；继代增殖倍数可达4.2。
(4)生根培养：将步骤(3)获得的不定芽，接种于生根培养基(1/2MS培养基+IBA 0.4mg/L+蔗糖15g/L+卡拉胶5.8g/L，pH值5.8)上培养，获得生根苗；培养条件：温度32℃、相对湿度90％、光照条件为接种后先暗培养5天、随后用自然散射光培养25天，光照时间12h/d，试验结果见图15和图16；生根率达64.6％。
(5)炼苗和移栽：将步骤(4)获得的生根苗转入薄膜大棚后，炼苗30天、待根系长至1～2cm后，取出瓶苗，洗掉培养基后移栽至黄心土中，覆盖薄膜，加盖遮阳网，移栽10天后，喷0.1％(m/m)的杀菌药一次，40天后掀去薄膜和遮阳网，获得广东崖豆藤种苗，用苗圃的常规方法进行管理，试验结果见图17和图18。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。