一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104237520 A (43)申请公布日 2014.12.24 CN 104237520 A (21)申请号 201410524859.2 (22)申请日 2014.09.30 G01N 33/577(2006.01) G01N 33/535(2006.01) (71)申请人 博奥赛斯 （天津） 生物科技有限公司 地址 300300 天津市东丽区开发区四纬路 10 号 (72)发明人 刘萍 栾大伟 张振斌 陈露鸾 侯玉文 杨桂霞 李克锦 王东生 曾小莉 (74)专利代理机构 天津滨海科纬知识产权代理 有限公司 12211 代理人 杨慧玲 (54) 发明名称 一种丙型。

2、肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒 及其制备方法 (57) 摘要 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括 ： (1) 校准品 ： (2) 双标记酶结合物 ； (3) 阴阳性对照物 ； (4) 发 光液 ； (5) 微孔包被板， 所述发光液包括发光液 1 和发光液 2， 发光液 1 为含有 0.7g/L 鲁米诺， 0.9g/L肉桂酸， 0.2g/L4-碘苯硼酸， 0.25g/L对碘 苯酚， 25ml/L 二甲基甲酰胺， 5g/L 聚乙烯醇， 8g/L 聚乙烯吡咯烷酮， 3g/L聚乙二醇600， 4g/L乙二胺 四乙酸， 160万单位/L硫酸庆大霉素， 0.4g/L过。

3、氧 化脲， pH9.0 的 0.1mol/L 的 Tris 缓冲液 ； 发光液 2 为含有 0.1mg/ml 吖啶酯衍生物、 3g/L 聚乙二醇 600、 0.1TWEEN-20pH9.0的0.1mol/L的Tris缓 冲液。本发明还公开了试剂盒的制备方法和使用 方法。本发明的优点是反应快速， 成本低。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 104237520 A CN 104237520 A 1/1 页 2 1. 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒， 其。

4、特征在于， 所述试剂盒包括 ： (1) 双标记酶结合物 ； (2) 阴阳性对照物 ； (3) 发光液 ； 所述发光液包括发光液 1 和发光液 2， 发光液 1 为含有 0.7g/L 鲁米诺， 0.9g/L 肉桂酸， 0.2g/L4- 碘苯硼酸， 0.25g/L 对碘苯酚， 25ml/L 二甲基甲酰胺， 5g/L 聚乙烯 醇， 8g/L 聚乙烯吡咯烷酮， 3g/L 聚乙二醇 600， 4g/L 乙二胺四乙酸， 160 万单位 /L 硫酸庆大 霉素， 0.4g/L 过氧化脲， pH9.0 的 0.1mol/L 的 Tris 缓冲液 ； 发光液 2 为含有 0.1mg/ml 吖啶 酯衍生物、 3g/。

5、L 聚乙二醇 600、 0.1 TWEEN-20pH9.0 的 0.1mol/L 的 Tris 缓冲液 ； (4) 微孔包被板。 2. 根据权利要求 1 所述的一种丙型肝炎抗原抗体联合检测试剂盒， 其特征在于， 所述双标记酶结合物的制备方法是 ： 采用改良高碘酸钠氧化法， 将辣根过氧化物酶标 记到 HCV 嵌合抗原上， 采用 EDC 法将碱性磷酸酶标记到另一 HCV 单抗上， 将嵌合抗原 -HRP 按照 0.1g/ml， HCV mab-ALP 按照 0.2g/ml 稀释到含有牛血清白蛋白和 proclin300 的 酶结合物稀释液中， 作为酶工作液， 于 2 8下储存。 3. 根据权利要求 。

6、1 所述的一种丙型肝炎抗原抗体联合检测试剂盒， 其特征在于， 所述微孔包被板制备方法是 ： 将包含有 Core、 NS3、 NS4、 NS5 的嵌合抗原和 HCV 单抗用 0.02M 磷酸盐缓冲液稀释至 1 10ug/mL， 同时加入到 96 孔白色不透明塑料微孔板中， 37 包被 2 小时或 2-8包被 16 小时 ； 弃去孔内液体， 用 pH7.4PBS 缓冲液洗板， 然后加入含 0.5 BSA 的磷酸盐缓冲液封闭微孔板， 37封闭 2 小时或 2-8封闭 16 小时 ； 弃去孔内液 体， 甩干后于 37烘干 4 小时 ； 装入铝箔袋， 加入干燥剂， 封口， 贴标签， 储存于 2 8。 4。

7、. 根据权利要求 1 所述的一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒， 其特征在于， 所述阴阳性对照物分别为 ： 采用阴性混合人血清作为阴性对照， 在阴性血清中加入 HCV-1抗体作为阳性对照1， 在阴性血清中加入HCV-2抗体作为阳性对照2， 在阴性血清中加 入 HCV 抗原作为阳性对照 3。 5. 权利要求 1-4 任一权利要求所述本发明试剂盒的使用方法 ： (1) 将 50l 阴性对照和三个阳性对照及待检样品分别加入不同微孔中， 37孵育 30 分钟 ； (2) 用含有 tween20 的 Tris 盐缓冲液清洗 5 次， 拍干 ； (3) 每孔加入 50l 酶工作液， 37孵育 30 分。

8、钟 ； (4) 同第 (2) 步完成清洗后， 每孔各加入 100l 发光液 A， 孵育 5 分钟用光子计数器读 数， 所测发光值以阴性对照的 2.1 倍作为 cutoff 判定值进行 S/CO 计算 ； (5) 完成读书后同第 (2) 步完成清洗后， 每孔加入 100l 发光液 B， 孵育 10 分钟用光 子计数器读数， 所测发光值以阴性对照的 2.1 倍作为 cutoff 判定值进行 S/CO 计算 ； (6) 第 (4) 步所测 S/CO 值大于等于 1 的样本判定为抗体阳性 ； (7) 第 (5) 步所测 S/CO 值大于等于 1 的样本判定为抗原阳性 ； (8) 第 (6) 步和第 (。

9、7) 步所测 S/CO 的和为抗原抗体联合检测结果。 权 利 要 求 书 CN 104237520 A 2 1/4 页 3 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及免疫分析医学领域， 具体的， 本发明提供了一种丙型肝炎病毒 (HCV) 抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法。 背景技术 0002 丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus， HCV) 是一类单股正链核糖核酸病毒， 其具有 囊膜， 表面有刺状突起结构， 病毒颗粒变异较大， 它可以通过输血、 静脉吸毒、 密切接触等途 径传播 , 而输血和注射是我国丙型肝炎病毒重要的传播途径。丙型肝炎发。

10、展隐匿 , 临床表 现不典型 , 临床诊断、 疗效观察依赖于实验室检测结果。 0003 丙型肝炎病毒基因组含有开放阅读框架 (ORF)， 能编码氨基酸残基的病毒前体多 肽， 分别组成了丙型肝炎病毒的核心蛋白 (c)， 基质蛋白 (M)， 外壳蛋白 (E) 和另 5 种非结构 蛋白 (NS1-NS5)。丙型肝炎病毒抗体是由于人体免疫细胞对丙肝病毒感染所做出的反应而 产生的。丙型肝炎病毒感染通常是持续性的终生感染 , 丙肝抗体阳性患者的血中含有丙型 肝炎病毒， 具有传染性。病人在急性感染后的数天内， 血清中会出现病毒 RNA， 并且在产生 抗体前一直会存在几个月。但是和乙型肝炎不同， 丙肝抗体没有。

11、保护作用。因此， 丙型肝炎 病毒抗体阳性， 并不表示不会再得丙型肝炎， 只是表示病人曾经感染过或正在感染丙型肝 炎病毒而已。初次诊断丙肝， 一般来说， 必须是丙肝抗体和 HCV-RNA 均为阳性才可诊断为丙 肝， 但是丙肝病毒 HCV-RNA 阴性却不能完全排除丙肝。目前临床由于 HCV-Ag 检测方法尚不 成熟、 HCV-RNA 费用较高， HCV-Ab 检测存在 “窗口期” ， 所以 HCV-Ag 和 HCV-Ab 联合检测是临 床筛查丙肝患者的一个非常有效的方法。 0004 目前现有 HCV 抗原抗体联合检测方法有时间分辨免疫荧光分析法、 酶联免疫测定 法和化学发光免疫测定法等。 000。

12、5 时间分辨免疫荧光分析法仪器兼容性差， 价格昂贵， 操作相对繁琐， 且所涉及试剂 对生产制作及应用中的试剂、 水质与环境要求较高， 特别是富含稀土金属的环境及水质易 于产生高本底而降低敏感性。在一定程度上限制了其推广应用。 0006 酶联免疫测定法具备其操作简单、 试剂有效期长无污染、 高于胶体金的敏感性、 特 异性好、 结果可用仪器测定等特点得以推广， 但由于敏感性相对较低， 所用标记酶与底物可 定量测定范围窄， 及仪器测定范围窄等缺点， 限制了其在微量免疫定量测定中的应用。 0007 现有专利技术中， 均未给出详细的抗原抗体检测试剂盒制备方法， 尤其利用双标 记、 双底物进行检测的技术尚。

13、未见报道。 发明内容 0008 为解决现有技术中 HCV 抗原、 抗体检测的灵敏度不高、 特异性差、 不能同时检出的 问题， 本发明采用的技术方案是 ： 0009 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括 ： 0010 (1) 双标记酶结合物 ； 说 明 书 CN 104237520 A 3 2/4 页 4 0011 (2) 阴阳性对照物 ； 0012 (3) 发光液 ； 所述发光液包括发光液 1 和发光液 2， 发光液 1 为含有 0.7g/L 鲁米 诺， 0.9g/L 肉桂酸， 0.2g/L4- 碘苯硼酸， 0.25g/L 对碘苯酚， 25ml/L 二甲基甲酰。

14、胺， 5g/L 聚 乙烯醇， 8g/L 聚乙烯吡咯烷酮， 3g/L 聚乙二醇 600， 4g/L 乙二胺四乙酸， 160 万单位 /L 硫酸 庆大霉素， 0.4g/L 过氧化脲， pH9.0 的 0.1mol/L 的 Tris 缓冲液 ； 发光液 2 为含有 0.1mg/ml 吖啶酯衍生物、 3g/L 聚乙二醇 600、 0.1 TWEEN-20pH9.0 的 0.1mol/L 的 Tris 缓冲液 ； (4) 微孔包被板。 0013 进一步， 所述双标记酶结合物的制备方法是 ： 采用改良高碘酸钠氧化法， 将辣根过 氧化物酶标记到 HCV 嵌合抗原上， 采用 EDC 法将碱性磷酸酶标记到另一 。

15、HCV 单抗上， 将嵌 合抗原 -HRP 按照 0.1g/ml， HCV mab-ALP 按照 0.2g/ml 稀释到含有牛血清白蛋白和 proclin300 的酶结合物稀释液中， 作为酶工作液， 于 2 8下储存。 0014 进一步， 所述微孔包被板制备方法是 ： 将包含有 Core、 NS3、 NS4、 NS5 的嵌合抗原和 HCV单抗用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至110ug/mL， 同时加入到96孔白色不透明塑料微孔 板中， 37包被 2 小时或 2-8包被 16 小时 ； 弃去孔内液体， 用 pH7.4PBS 缓冲液洗板， 然后 加入含 0.5 BSA 的磷酸盐缓冲液封闭微孔板， 37。

16、封闭 2 小时或 2-8封闭 16 小时 ； 弃去 孔内液体， 甩干后于 37烘干 4 小时 ； 装入铝箔袋， 加入干燥剂， 封口， 贴标签， 储存于 2 8。 0015 进一步， 所述阴阳性对照物分别为 ： 采用阴性混合人血清作为阴性对照， 在阴性血 清中加入 HCV-1 抗体作为阳性对照 1， 在阴性血清中加入 HCV-2 抗体作为阳性对照 2， 在阴 性血清中加入 HCV 抗原作为阳性对照 3。 0016 本发明还公开了试剂盒的使用方法 ： 0017 (1) 将 50l 阴性对照和三个阳性对照及待检样品分别加入不同微孔中， 37孵 育 30 分钟 ； 0018 (2) 用含有 tween。

17、20 的 Tris 盐缓冲液清洗 5 次， 拍干 ； 0019 (3) 每孔加入 50l 酶工作液， 37孵育 30 分钟 ； 0020 (4) 同第 (2) 步完成清洗后， 每孔各加入 100l 发光液 A， 孵育 5 分钟用光子计数 器读数， 所测发光值以阴性对照的 2.1 倍作为 cutoff 判定值进行 S/CO 计算 ； 0021 (5) 完成读书后同第 (2) 步完成清洗后， 每孔加入 100l 发光液 B， 孵育 10 分钟 用光子计数器读数， 所测发光值以阴性对照的 2.1 倍作为 cutoff 判定值进行 S/CO 计算 ； 0022 (6) 第 (4) 步所测 S/CO 值。

18、大于等于 1 的样本判定为抗体阳性 ； 0023 (7) 第 (5) 步所测 S/CO 值大于等于 1 的样本判定为抗原阳性 ； 0024 (8) 第 (6) 步和第 (7) 步所测 S/CO 的和为抗原抗体联合检测结果。 0025 本发明提供了一种检测方法， 利用双标记、 双底物的方法进行 HCV 抗原、 抗体的检 测， 使得 “窗口期” 大为缩短， 检测特异性强， 灵敏度高。弥补了单纯检测 HCV 抗原或 HCV 抗 体的不足， 同时避免了现有技术中操作繁琐， 仪器兼容性差， 测定范围窄等缺陷。 0026 本发明的 HCV 化学发光免疫定量测定试剂盒， 采用双标记， 双底物的化学发光免 疫。

19、分析检测方法， 突破了传统单标记、 单底物的检测技术， 具有以下优点 ： 0027 (1) 相比较单独检测抗原或抗体的试剂， 本发明试剂盒可以同时得到 3 个检测结 果， 能够全部测出丙型肝炎早期、 急性感染期及 HCV 抗原抗体复合物存在期等时期体， 提高 说 明 书 CN 104237520 A 4 3/4 页 5 抗原检测的灵敏度， 降低本底， 大大缩短了 “窗口期” ， 弥补了单独检测抗原或抗体的不足 ； 相比较抗原抗体联检、 单独标记的试剂， 本发明试剂盒增强了灵敏度， 能更加有效的区分 “窗口期” 、“无症状期” 、“发病期” 等阶段， 为临床诊断治疗提供了更加准确可靠的结果， 能。

20、更 好的对患者进行治疗 ； 0028 (2) 反应快速， 可以在 30min 内出结果， 操作简便， 无污染 ； 0029 (3) 成本低， 与市场上同类产品比较， 本试剂盒性能良好， 成本低， 具有临床应用价 值。 具体实施方式 0030 实施例 1 ： 0031 试剂盒 0032 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒， 包括 ： 0033 (1) 校准品 ： 是用来做标准曲线的一组物质， 6 瓶 ； 0034 (2) 双标记酶结合物 ； 0035 (3) 阴阳性对照物 ； 0036 (4)发光液 ； 所述发光液包括发光液1和发光液2， 发光液1为含有0.7g/L鲁米诺， 0.9g/L 肉。

21、桂酸， 0.2g/L4- 碘苯硼酸， 0.25g/L 对碘苯酚， 25ml/L 二甲基甲酰胺， 5g/L 聚乙烯 醇， 0037 8g/L聚乙烯吡咯烷酮， 3g/L聚乙二醇600， 4g/L乙二胺四乙酸， 160万单位/L硫酸 庆大霉素， 0.4g/L 过氧化脲， pH9.0 的 0.1mol/L 的 Tris 缓冲液 ； 发光液 2 为含有 0.1mg/ml 吖啶酯衍生物、 3g/L 聚乙二醇 600、 0.1 TWEEN-20pH9.0 的 0.1mol/L 的 Tris 缓冲液 ； 0038 (5) 微孔包被板。 0039 实施例 2 0040 实施例 1 所述试剂盒的制备 0041 (。

22、1) 双标记酶结合物的制备方法是 ： 采用改良高碘酸钠氧化法， 将辣根过氧化 物酶标记到 HCV 嵌合抗原上， 采用 EDC 法将碱性磷酸酶标记到另一 HCV 单抗上， 将嵌合 抗原 -HRP 按照 0.1g/ml， HCV mab-ALP 按照 0.2g/ml 稀释到含有牛血清白蛋白和 proclin300 的酶结合物稀释液中， 作为酶工作液， 于 2 8下储存。 0042 (2) 阴阳性对照物分别为 ： 采用阴性混合人血清作为阴性对照， 在阴性血清中加 入 HCV-1 抗体作为阳性对照 1， 在阴性血清中加入 HCV-2 抗体作为阳性对照 2， 在阴性血清 中加入 HCV 抗原作为阳性对照。

23、 3。 0043 (3) 微孔包被板制备方法是 ： 将包含有 Core、 NS3、 NS4、 NS5 的嵌合抗原和 HCV 单抗 用 0.02M 磷酸盐缓冲液稀释至 1 10ug/mL， 同时加入到 96 孔白色不透明塑料微孔板中， 37包被 2 小时或 2-8包被 16 小时 ； 弃去孔内液体， 用 pH7.4PBS 缓冲液洗板， 然后加入 含 0.5 BSA 的磷酸盐缓冲液封闭微孔板， 37封闭 2 小时 ； 弃去孔内液体， 甩干后于 37 烘干 4 小时 ； 装入铝箔袋， 加入干燥剂， 封口， 贴标签， 储存于 2 8。 0044 实施例 3 0045 实施例 1 所述试剂盒的制备 00。

24、46 (1) 双标记酶结合物的制备方法是 ： 采用改良高碘酸钠氧化法， 将辣根过氧化 说 明 书 CN 104237520 A 5 4/4 页 6 物酶标记到 HCV 嵌合抗原上， 采用 EDC 法将碱性磷酸酶标记到另一 HCV 单抗上， 将嵌合 抗原 -HRP 按照 0.1g/ml， HCV mab-ALP 按照 0.2g/ml 稀释到含有牛血清白蛋白和 proclin300 的酶结合物稀释液中， 作为酶工作液， 于 2 8下储存。 0047 (2) 阴阳性对照物分别为 ： 采用阴性混合人血清作为阴性对照， 在阴性血清中加 入 HCV-1 抗体作为阳性对照 1， 在阴性血清中加入 HCV-2。

25、 抗体作为阳性对照 2， 在阴性血清 中加入 HCV 抗原作为阳性对照 3。 0048 (3) 微孔包被板制备方法是 ： 将包含有 Core、 NS3、 NS4、 NS5 的嵌合抗原和 HCV 单抗 用 0.02M 磷酸盐缓冲液稀释至 1 10ug/mL， 同时加入到 96 孔白色不透明塑料微孔板中， 37包被2小时或2-8包被16小时 ； 弃去孔内液体， 用pH7.4PBS缓冲液洗板， 然后加入含 0.5 BSA 的磷酸盐缓冲液封闭微孔板， 2-8封闭 16 小时 ； 弃去孔内液体， 甩干后于 37 烘干 4 小时 ； 装入铝箔袋， 加入干燥剂， 封口， 贴标签， 储存于 2 8。 0049。

26、 实施例 4 0050 实施例 1 所述试剂盒的使用方法 0051 (1) 将 50l 阴性对照和三个阳性对照及待检样品分别加入不同微孔中， 37孵 育 30 分钟 ； 0052 (2) 用含有 tween20 的 Tris 盐缓冲液清洗 5 次， 拍干 ； 0053 (3) 每孔加入 50l 酶工作液， 37孵育 30 分钟 ； 0054 (4) 同第 (2) 步完成清洗后， 每孔各加入 100l 发光液 A， 孵育 5 分钟用光子计数 器读数， 所测发光值以阴性对照的 2.1 倍作为 cutoff 判定值进行 S/CO 计算 ； 0055 (5) 完成读书后同第 (2) 步完成清洗后， 每孔加入 100l 发光液 B， 孵育 10 分钟 用光子计数器读数， 所测发光值以阴性对照的 2.1 倍作为 cutoff 判定值进行 S/CO 计算 ； 0056 (6) 第 (4) 步所测 S/CO 值大于等于 1 的样本判定为抗体阳性 ； 0057 (7) 第 (5) 步所测 S/CO 值大于等于 1 的样本判定为抗原阳性 ； 0058 (8) 第 (6) 步和第 (7) 步所测 S/CO 的和为抗原抗体联合检测结果。 说 明 书 CN 104237520 A 6 。