一种鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体、制备方法及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104017077 A (43)申请公布日 2014.09.03 CN 104017077 A (21)申请号 201410246788.4 (22)申请日 2014.05.30 C07K 16/18(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/577(2006.01) (71)申请人 中国动物卫生与流行病学中心 地址 266032 山东省青岛市南京路 369 号 (72)发明人 吴晓东 张永强 赵永刚 李金明 王志亮 (54) 发明名称 一种鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体、 制备 方法及应用 (57) 摘要 本发明涉及一种鉴别不同物种朊蛋。

2、白单克隆 抗体、 制备方法及应用， 用以进行朊蛋白研究 ； 该 具体过程为 ： 步骤 a， 准备用于免疫和筛选的朊蛋 白抗原 ； 步骤 b， 骨髓瘤细胞 SP2/0 的准备 ； 步骤 c， 动物免疫与细胞融合 ； 步骤 d， 阳性杂交瘤细胞 的筛选与腹水单抗制备 ； 步骤 e， 单抗成份鉴定 ； 步骤 f， 单抗应用。本发明中， 制备的单抗只与羊 脑组织中的 PrPC(Ov-PrPC) 反应， 不与牛脑组织 中的 PrPC(Bo-PrPC) 反应， 能够对不同物种朊蛋 白进行鉴别。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专。

3、利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 104017077 A CN 104017077 A 1/1 页 2 1. 一种鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体的制备方法， 其特征在于， 该具体过程为 ： 步骤 a， 准备用于免疫和筛选的朊蛋白抗原 ； 步骤 b， 骨髓瘤细胞 SP2/0 的准备 ； 步骤 c， 动物免疫与细胞融合 ； 步骤 d， 阳性杂交瘤细胞的筛选与腹水单抗制备 ； 步骤 e， 单抗成份鉴定。 2. 根据权利要求 1 所述的鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体的制备方法， 其特征在于， 在上述步骤 a 中， 重组表达牛和羊 PrPC 核心片段， 以羊 PrPC 核心片段作。

4、为用于免疫的朊蛋 白抗原 ； 以牛和羊 PrPC 核心片段作为筛选包被抗原。 3. 根据权利要求 2 所述的鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体的制备方法， 其特征在于， 在上述步骤 b 中， 细胞融合前一周复苏冻存于液氮中的 SP2/0， 在 20小牛血清 HT 培养基 和 5 CO2培养箱中培养， 每天观察生长状况， 融合前调整至对数生长期。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体的制备方法， 其特征在 于， 在上述步骤 c 中， 将步骤 a 中制备的羊朊蛋白抗原与等量弗氏完全佐剂充分乳化后， 在 其腹部皮下多点注射6周龄PrP基因敲除小鼠， 20g/只 ； 2周后腹部。

5、皮下多点注射相同剂 量弗氏不完全佐剂充分乳化的朊蛋白抗原 ； 14d 后腹腔追加注射 5g 朊蛋白抗原， 3d 后无 菌取脾脏进行细胞融合。 5. 根据权利要求 4 所述的所述的鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体的制备方法， 其特征 在于， 在上述步骤 d 中， 采用间接 ELISA 方法对长有杂交瘤细胞的孔进行筛选， 以纯化的重 组牛和羊 PrPC 核心片段为包被抗原分别包板 ； 检测羊 PrPC 核心片段为阳性同时牛 PrPC 核心片段为阴性的孔， 进行 24 孔板扩大培 养 ； 检测仍符合上述条件的孔， 采用有限稀释法进行 2 次亚克隆 ； 取形态良好， 生长旺盛的 单克隆细胞 6 孔板扩大培。

6、养， 一部分用于液氮冻存， 另一部分用于单抗腹水的生产 ； 取青壮 年 Balb/c 小鼠， 制备腹水单抗。 6. 根据权利要求 4 所述的鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体的制备方法， 其特征在于， 在上述步骤 e 中， 比较牛、 羊 PrPC 核心片段氨基酸序列， 找出两者存在差异的位置， 以此位 置为中心， 人工合成 10 肽， 以 16g/mL 分别溶于 CBS(pH9.6)， 每孔加入 100L 溶液， 37 孵育 2h， 5脱脂乳 4封闭过夜 ； 包被好的 ELISA 板与所得单抗进行标准 ELISA 反应， 检测所得单抗的特异性抗原结合 位点， 所述单克隆抗体的抗原结合位点为羊朊蛋白 。

7、208 位的异亮氨酸， 该位点羊朊蛋白为 异亮氨酸， 牛为甲硫氨酸 ； 比较不同物种该位点的氨基酸， 确定所得单抗与哪些物种 PrPC 核心片段能够结合， 与哪些物种 PrPC 核心片段不结合。 7. 一种鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体， 其特征在于， 所述单克隆抗体的抗原结合位 点为羊朊蛋白 208 位的异亮氨酸， 该位点羊朊蛋白为异亮氨酸， 牛为甲硫氨酸， 该单抗只与 羊 PrPC 反应， 不与牛 PrPC 反应。 8. 一种鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体的应用， 其特征在于， 取健康牛、 羊脑组织匀 浆、 离心处理后， 进行SDS-PAGE电泳并转印至PVDF膜 ； 5脱脂奶4封闭过夜， T。

8、BST洗涤5 次， 3min/ 次 ； 加入腹水单抗 1.5h， TBST 洗涤 10 次， 3min/ 次 ； 加入生物素标记二抗 1h， TBST 洗涤 6 次， 3min/ 次， 采用化学发光法进行 X 底片曝光。 权 利 要 求 书 CN 104017077 A 2 1/3 页 3 一种鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体、 制备方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及基因检测领域， 尤其涉及一种鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体、 制备 方法及应用。 背景技术 0002 传染性海绵状脑病(Transmissible Spongiform Encephalopathies， TSE)， 又称朊 毒。

9、体病， 是感染人和动物中枢神经系统的一类慢性、 退化性、 致死性疾病。引起 TSE 的蛋白 质称为朊蛋白 (Prion)， 分为细胞型 (PrPC) 和致病型 (PrPSc)。 0003 TSE 是由于 PrPC 转变成 PrPSc 所致。该病除了可以在物种内传播外， 目前已知羊 痒病病原PrPSc可诱导牛的PrPC转变为PrPSc， 引起疯牛病 ； 牛的PrPSc可以诱导人的PrPC 转变为PrPSc， 引起人的新型克雅氏症， 但是该病的跨物种传播以及PrPC和PrPSc之间的转 变机制并不清楚， 朊蛋白的特异性单抗在该病的研究中发挥了重要的作用。例如， Brun 等 制备的单抗 2A11 。

10、能检测到 IHC 中 PK 酶 (Protease K) 消化后的 PrP27-30， 但检测不到未经 PK 酶消化的 PrPSc 和正常牛脑切片中的 PrPC， 揭示了 2A11 的结合位点位于 PrPSc 和 PrPC 内部， 经 PK 酶消化后暴露在了 PrPSc 表面， 该发现对于朊蛋白高级结构的研究具有促进作 用。 0004 本发明创作者利用发明的方法制备了一株能鉴别牛羊朊蛋白的单克隆抗体并进 行了应用。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体、 制备方法及应用， 用以进行研究朊蛋白研究。 0006 为实现上述目的， 本发明提供一种鉴别不同物种朊蛋白。

11、单克隆抗体的制备方法， 该具体过程为 ： 0007 步骤 a， 准备用于免疫和筛选的朊蛋白抗原 ； 0008 步骤 b， 骨髓瘤细胞 SP2/0 的准备 ； 0009 步骤 c， 动物免疫与细胞融合 ； 0010 步骤 d， 阳性杂交瘤细胞的筛选与腹水单抗制备 ； 0011 步骤 e， 单抗成份鉴定 ； 0012 步骤 f， 单抗应用。 0013 进一步， 在上述步骤 a 中， 重组表达牛和羊 PrPC 核心片段， 以羊 PrPC 核心片段作 为用于免疫的朊蛋白抗原。以牛和羊 PrPC 核心片段作为筛选包被抗原。 0014 进一步， 在上述步骤 b 中， 细胞融合前一周复苏冻存于液氮中的 SP。

12、2/0， 在 20小 牛血清 HT 培养基和 5 CO2培养箱中培养， 每天观察生长状况， 融合前调整至对数生长期。 0015 进一步， 在上述步骤c中， 将步骤a中制备的羊朊蛋白抗原与等量弗氏完全佐剂充 分乳化后， 在其腹部皮下多点注射 6 周龄 PrP 基因敲除小鼠， 20g/ 只 ； 2 周后腹部皮下多 说 明 书 CN 104017077 A 3 2/3 页 4 点注射相同剂量弗氏不完全佐剂充分乳化的朊蛋白抗原 ； 14d 后腹腔追加注射 5g 朊蛋白 抗原， 3d 后无菌取脾脏进行细胞融合。 0016 进一步， 在上述步骤 d 中， 采用间接 ELISA 方法对长有杂交瘤细胞的孔进行。

13、筛选， 以纯化的重组牛和羊 PrPC 核心片段为包被抗原分别包板 ； 0017 检测羊 PrPC 核心片段为阳性同时牛 PrPC 核心片段为阴性的孔， 进行 24 孔板扩大 培养 ； 检测仍符合上述条件的孔， 采用有限稀释法进行 2 次亚克隆 ； 取形态良好， 生长旺盛 的单克隆细胞 6 孔板扩大培养， 一部分用于液氮冻存， 另一部分用于单抗腹水的生产 ； 取青 壮年 Balb/c 小鼠， 制备腹水单抗。 0018 进一步， 在上述步骤 e 中， 比较牛、 羊 PrPC 核心片段氨基酸序列， 找出两者存在差 异的位置， 以此位置为中心， 人工合成 10 肽， 以 16g/mL 分别溶于 CBS。

14、(pH9.6)， 每孔加入 100L 溶液， 37孵育 2h， 5脱脂乳 4封闭过夜 ； 0019 包被好的 ELISA 板与所得单抗进行标准 ELISA 反应， 检测所得单抗的特异性抗原 结合位点， 所述单克隆抗体的抗原结合位点为羊朊蛋白 208 位的异亮氨酸， 该位点羊朊蛋 白为异亮氨酸， 牛为甲硫氨酸 ； 比较不同物种该位点的氨基酸， 确定所得单抗与哪些物种 PrPC 核心片段能够结合， 与哪些物种 PrPC 核心片段不结合。 0020 本发明还提供一种鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体， 所述单克隆抗体的抗原结合 位点为羊朊蛋白 208 位的异亮氨酸， 该位点羊朊蛋白为异亮氨酸， 牛为甲硫氨。

15、酸， 该单抗只 与羊 PrPC 反应， 不与牛 PrPC 反应。 0021 本发明还提供一种鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体的应用， 取健康牛、 羊脑组织 匀浆、 离心处理后， 进行 SDS-PAGE 电泳并转印至 PVDF 膜 ； 5脱脂奶 4封闭过夜， TBST 洗 涤 5 次， 3min/ 次 ； 加入腹水单抗 1.5h， TBST 洗涤 10 次， 3min/ 次 ； 加入生物素标记二抗 1h， TBST 洗涤 6 次， 3min/ 次， 采用化学发光法进行 X 底片曝光。 0022 与现有技术相比较本发明的有益效果在于 ： 本发明中， 用羊 PrPC 核心片段免疫 PrP 基因敲除小鼠，。

16、 然后采用常规方法制备单抗， 然后用牛、 羊 PrPC 核心片段同时对杂交瘤 细胞进行筛选， 容易获得针对某一物种特异性的单抗 ； 本发明中获得的单抗， 其抗原结合位 点为羊朊蛋白 208 位的异亮氨酸。经过比对分析 Genbank 上公布的牛羊朊蛋白氨基酸序 列， 该位点羊朊蛋白为异亮氨酸， 牛为甲硫氨酸， 因此该单抗的特异性识别位点为 208 位异 亮氨酸， 该单抗只与羊PrPC反应， 不与牛PrPC反应， 通过分析某物种该位点的氨基酸， 可以 确定所得单抗能否与该物种朊蛋白反应， 其能够对不同物种朊蛋白进行鉴别。 具体实施方式 0023 以下， 对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详。

17、细的说明。 0024 本发明制备鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体及应用， 所用试剂包括弗氏完全佐 剂、 弗氏不完全佐剂、 高糖型 DMEM 粉、 融合用 PEG(MW4000) ； 次黄嘌呤、 胸腺嘧啶核苷和氨基 喋呤。 0025 该具体过程为 ： 0026 步骤 a， 重组表达牛和羊 PrPC 核心片段， 以羊 PrPC 核心片段作为用于免疫的朊蛋 白抗原。以牛和羊 PrPC 核心片段作为筛选包被抗原。 0027 步骤b， 细胞融合前一周复苏冻存于液氮中的SP2/0， 在20小牛血清HT培养基和 说 明 书 CN 104017077 A 4 3/3 页 5 5 CO2培养箱中培养， 每天观察生长。

18、状况， 融合前调整至对数生长期。 0028 步骤 c， 将步骤 a 中制备的羊朊蛋白抗原与等量弗氏完全佐剂充分乳化后， 在其腹 部皮下多点注射6周龄PrP基因敲除小鼠， 20g/只 ； 2周后腹部皮下多点注射相同剂量弗 氏不完全佐剂充分乳化的朊蛋白抗原 ； 14d 后腹腔追加注射 5g 朊蛋白抗原， 3d 后无菌取 脾脏进行细胞融合。 0029 步骤 d， 采用间接 ELISA 方法对长有杂交瘤细胞的孔进行筛选， 以纯化的重组牛和 羊 PrPC 核心片段为包被抗原分别包板 ； 0030 检测羊 PrPC 核心片段为阳性同时牛 PrPC 核心片段为阴性的孔， 进行 24 孔板扩大 培养 ； 检测。

19、仍符合上述条件的孔， 采用有限稀释法进行 2 次亚克隆 ； 取形态良好， 生长旺盛 的单克隆细胞 6 孔板扩大培养， 一部分用于液氮冻存， 另一部分用于单抗腹水的生产 ； 取青 壮年 Balb/c 小鼠， 制备腹水单抗。 0031 步骤 e， 比较牛、 羊 PrPC 核心片段氨基酸序列， 找出两者存在差异的位置， 以此位 置为中心， 人工合成 10 肽， 以 16g/mL 分别溶于 CBS(pH9.6)， 每孔加入 100L 溶液， 37 孵育 2h， 5脱脂乳 4封闭过夜 ； 0032 包被好的 ELISA 板与所得单抗进行标准 ELISA 反应， 检测所得单抗的特异性抗原 结合位点。比较不。

20、同物种该位点的氨基酸， 确定所得单抗与哪些物种 PrPC 核心片段能够结 合， 与哪些物种 PrPC 核心片段不结合。 0033 本发明鉴别不同物种朊蛋白单克隆抗体的应用过程为 ： 取健康牛、 羊脑组织匀浆、 离心处理后， 进行 SDS-PAGE 电泳并转印至 PVDF 膜 ； 5脱脂奶 4封闭过夜， TBST 洗涤 5 次， 3min/ 次 ； 加入腹水单抗 1.5h， TBST 洗涤 10 次， 3min/ 次 ； 加入生物素标记二抗 1h， TBST 洗涤 6 次， 3min/ 次， 采用化学发光法进行 X 底片曝光。 0034 本发明所得到的单抗只与羊脑组织中的 PrPC(Ov-PrP。

21、C) 反应， 不与牛脑组织中的 PrPC(Bo-PrPC)反应， 并确定单抗其抗原结合位点为羊朊蛋白208位的异亮氨酸。 经过比对 分析 Genbank 上公布的牛羊朊蛋白氨基酸序列， 该位点羊朊蛋白为异亮氨酸， 牛为甲硫氨 酸， 因此该单抗只与羊PrPC反应， 不与牛PrPC反应， 通过分析某物种该位点的氨基酸， 可以 确定本单抗能否与该物种朊蛋白反应， 其能够对不同物种朊蛋白进行鉴别。 0035 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 对发明而言仅仅是说明性的， 而非限制性的。 本专业技术人员理解， 在发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变， 修改， 甚至等效， 但都将落入本发明的保护范围内。 说 明 书 CN 104017077 A 5 。