蛋白质等电聚焦电泳的装置.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104034789 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104034789 A (21)申请号 201410309652.3 (22)申请日 2013.04.02 201310113855.0 2013.04.02 G01N 27/447(2006.01) (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路 800 号 (72)发明人 曹成喜 郭陈刚 刘小平 李思 王后禹 (74)专利代理机构 上海交达专利事务所 31201 代理人 王毓理 王锡麟 (54) 发明名称 蛋白质等电聚焦电泳的装置 (57) 摘要 一种基于移动反应界面和扩。

2、散技术的蛋白质 等电聚焦电泳装置， 首先制备含有电极液的多孔 亲水材料作为酸性垫和碱性垫， 然后将酸性垫置 于电泳槽内的阳极与经过水化上样的固化或非固 化 pH 梯度胶条的一端之间， 将碱性垫置于阴极与 胶条的另一端之间且并轻压固定以实现电连接， 最后滴加硅油覆盖整个电泳槽内并施加直流电 压， 通过逐步增加电压实现等电聚焦电泳测试。 本 发明的目的在于提高 pH 梯度可调控性和分辨率。 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 (10)申请公。

3、布号 CN 104034789 A CN 104034789 A 1/1 页 2 1.一种实现蛋白质等电聚焦电泳的pH梯度控制的电泳槽， 其特征在于， 所述的pH梯度 控制是指 ： 首先制备含有电极液的多孔亲水材料作为酸性垫和碱性垫， 然后将酸性垫置于 电泳槽内的阳极与经过水化上样的固化或非固化 pH 梯度胶条的一端之间， 将碱性垫置于 阴极与胶条的另一端之间， 且并轻压固定以实现电连接， 最后滴加硅油覆盖整个电泳槽内 并施加直流电压， 通过逐步增加电压实现等电聚焦电泳测试 ； 所述的电泳槽包括 ： 设有若干个槽道的聚焦槽框架、 散热底板、 用于压制酸性垫或碱性 垫的盖板和电极部件， 其中 ：。

4、 聚焦槽框架和散热底板相互契合， 电极部件固定于聚焦槽框架 和散热底板之间， 盖板与散热底板相互配合。 2.根据权利要求1所述的电泳槽， 其特征是， 在基于MRB的稳定pH梯度控制时， 所述的 酸性垫为酸性电极液垫， 其中所含的电极液为 ： H2SO4、 HCl、 HBr、 HI、 HNO3、 CH3COOH、 H3PO4、 或 者上述混合溶液的酸性电解质， 但 HF 除外， 酸性电极液浓度为 5mM 200mM ； 所述的碱性垫 为碱性电极液垫， 其中的电极液为 ： NaOH、 NH4OH、 H2NCH2CH2NH2、 或者上述混合溶液的碱性电 解质， 但 KOH 除外， 碱性性电极液浓度为。

5、 5mM 200mM ； 在基于 MRB 和扩散技术设计非线性 pH 梯度调控时， 所述的酸性垫为酸性扩散调控垫， 其中所含的电极液为 ： H2SO4、 HCl、 HBr、 HI、 HNO3、 CH3COOH、 H3PO4、 或者上述混合溶液的酸性 电解质， 浓度为 150mM 2000mM ； 所述的碱性垫为碱性电极液垫， 其中的电极液为 ： NaOH、 NH4OH、 H2NCH2CH2NH2、 或者上述混合溶液的碱性电解质， 浓度为 150mM 2000mM。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的电泳槽， 其特征是， 所述的酸性垫和碱性垫以及的基材 为 ： 滤纸、 脱脂棉、 海绵或无纺布。

6、， 其长度是与所在的电泳槽两端电极到电泳槽道端部之间 的距离相适应。 4. 根据权利要求 1 所述的电泳槽， 其特征是， 所述的聚焦槽框架有楔形头且与散热底 板上的楔形孔相配合。 5.根据权利要求1或4所述的电泳槽， 其特征是， 所述的聚焦槽框架有定位孔且与盖板 上的定位片相配合。 6. 根据权利要求 5 所述的电泳槽， 其特征是， 所述的电极部件包括 ： 相互接触的电极丝 和电极片， 其中 ： 电极丝的电极丝环贴在环聚焦槽框架上所开的电极螺丝孔上。 权 利 要 求 书 CN 104034789 A 2 1/7 页 3 蛋白质等电聚焦电泳的装置 本申请为申请号 ： CN201310113855。

7、.0， 发明名称 ： 蛋白质等电聚焦电泳的方法及其装 置， 申请人 ： 上海交通大学， 申请日 2013 年 4 月 2 日的中国发明专利申请的分案。 技术领域 0001 本发明涉及的是电化学方法分析材料技术领域的方法和装置， 具体是基于移动反 应界面(moving reaction boundary， MRB)的蛋白质等电聚焦电泳(isoelectric focusing， IEF) 装置。 背景技术 0002 IEF 技术为蛋白质高效分离技术， 其原理是利用两性电解质在凝胶中创造一 个 pH 梯度， 同时利用蛋白质具有两性解离和等电点的特点， 对蛋白质进行分离分析 (P.G.Rightti。

8、,In:T.S.Work and R.H.Rurdon,Laboraotary Techniques in Biochemistry and Molecular Bioboligy,Elsevier Biomedical Press,Amesterdam New York Oxford,v II,1983,p.1-86,268-313)。IEF 具有分离效率高、 分离富集同时完成、 上样模式多 样等优点。IEF 技术应用广泛， 它不仅是蛋白质 pI 表征和纯度鉴定的标准分析技术 (O.Vesterberg,Acta Chem.Scand.1969,23,2653) ； 同时也是复杂蛋白质及其组。

9、学研 究 中 的 关 键 分 离 技 术 (S.Nilesh,E.Scott,Nature Protocols,2006,1,1732)， 在 双 向 凝胶电泳中总是作为第一向分离技术 (P.H.OFarrell,J.Biol.Chem.1975,250,4007 ； A.D.Rolland,B.Evrard,N.Guitton,J.Proteome Res.2007,6,683)。 0003 基 于 常 规 凝 胶 电 泳 的 IEF 技 术 主 要 二 种， 包 括 ： (i)、 管 式 凝 胶 IEF 技 术 (L.E.M.Miles,G.E.Simmons,A.Chrambach,An。

10、al.Biochem.1972,49,109) ； (ii)、 薄层 凝 胶 IEF 技 术 (P.G.Rightti,In:T.S.Work and R.H.Rurdon,Laboraotary Techniques in Biochemistry and Molecular Bioboligy,Elsevier Biomedical Press,Amesterdam New York Oxford,v II,1983,p.1-86,268-313)。 但 在 这 两 种 凝 胶 IEF 电 泳 技 术 中 始 终 存 在 pH 梯 度 漂 移 (drifting of pH gradien。

11、t,H.Rilbe,In:Electrofocusing and Isotachophoresis(Editors:B.J.Radola and D.Graeslin),Walter de Gruyter&Co.,Berlin New York,1977,p35-50) 和 水 平 化 (plateau of pH gradient,P. Arosio,E.Grana and P.G.Righetti,J.Chromatogr.1978,166,55)现象造成的不稳定性。 并 且在双向凝胶电泳 (two dimensional gel electrophoresis,2DE) 中， 由于管式和。

12、薄层凝胶 IEF 的凝胶很难取出， 取出后也很难完整的进行后续的转移操作 ； 因此， 基于常规凝胶电泳 的第一向 IEF 分离技术很难与第二向的 SDS-PAGE 电泳兼容。 0004 为了克服常规凝胶 IEF 技术稳定性问题以及与 SDS-PAGE 电泳兼容性问题， Rightti 等于上世纪八十年代发明了固定化 pH 梯度 (immobilized pH gradient,IPG) 胶 条 以 及 基 于 IPG 胶 条 的 IEF 技 术 (A.W.Postel,R.Westermeier,B. Bjellqvist,K.Ek,E.Gianazza,P.G.Righetti,Prot.B。

13、iol.Fluids1983,30,607 ； A. W.Postel,R.Westermeier,B.Bjellqvist,K.Ek,E.Gianazza,P.G.Righetti,Prot.Biol. 说 明 书 CN 104034789 A 3 2/7 页 4 Fluids1983,30,607)。由于较好地解决了传统凝胶 IEF 技术稳定性和兼容性等问题， 基于 IPG 胶条的 IEF 是目前应用最广泛的聚焦电泳技术， 已经成为 2DE 的第一向标准分离技术 (S.Nilesh,E.Scott,Nature Protocols,2006,1,1732)。相关的 IEF 技术体系、 IP。

14、G 胶条以 及配套仪器等主要有美国 GE 公司通用电气医疗集团生命科学部 (http:/gehealthcare. bioon.com.cn/) 和 Bio-Rad 公司 (http:/www.bio-rad.com/) 提供。 0005 但 IPG 技术带来一些新的问题。第一、 由于 IPG 胶条是直接放在正负电极上， 胶条 两端没有电极液， 所以无法有效控制 pH 梯度的形成， 进而对 pH 梯度进行调控， 这特别不利 于酸性和 / 或碱性蛋白的分离分析 ； 第二、 在 IPG 电泳技术中， 由于两性电解质的固化导致 不同 pI 的蛋白质非同步聚焦， 造成 IEF 分辨率的明显下降。第三、。

15、 IPG 技术消耗了 IEF 体系 中大量的活性极性基团， 增加了 pH 梯度形成后 IEF 体系的疏水性， 导致聚焦电泳时蛋白质 很容易沉淀， 严重影响 IEF 和 2DE 稳定性以及后续定量分析的不确定性。因此， 亟待发明一 种新的 IEF 技术， 该 IEF 技术能够较好解决上述 IEF 时的蛋白质沉淀、 非同步聚焦和 pH 梯 度的调控等问题。 0006 在 新 近 的 研 究 中，我 国 学 者 Cao 等 提 出 了 系 统 的 移 动 反 应 界 面 (moving reaction boundary,MRB) 概念和理论 (C.-X.Cao,Acta Phys.-Chim. S。

16、in.1997,13,827 ； C.-X.Cao,Acta Chem.Scand.1998,52,709 ； C.X.Cao,L.Y.Fan,W. Zhang,Analyst2008,133,1139)， 并且基于 MRB 概念 Cao 和 Liang 等建立了较系统的 IEF 动 力 学 理 论 (C.X.Cao,J.Chromatogr.A1998， 813,153 ； C.-X.Cao,J.-H.Zhu,H.Liu,W.-H. Fang,W.-Z.Tang,L.-H.Song,W.-K.Chen,Acta Chem.Scand.1999,53,955.C.X.Cao,L. Y.Fan,。

17、W.Zhang,Analyst2008,133,1139 ； H.Liang,Y.Chen,L.J.Tian,L.Zhang,Electropho resis2009,30,3134)。 这些前期研究结果为上述问题的解决创造了重要条件， 并且为较稳定 IEF 技术的设计等提供了关键基础。 发明内容 0007 本发明针对现有技术存在的上述不足， 提供一种蛋白质等电聚焦电泳的装置， 发 展了蛋白质等电聚焦电泳的方法与器件， 目的在于提高在 IEF 中的 pH 梯度可调控性， 解决 现有 IPG-IEF 的蛋白质沉淀和非同步聚焦问题， 提高 IEF 的稳定性和分辨率。 0008 本发明是通过以下技术。

18、方案实现的 ： 制备含有电极液的多孔亲水材料作为酸性垫 和碱性垫， 然后将酸性垫置于电泳槽内的阳极， 并与经过水化上样的固化或非固化 pH 梯度 胶条的一端接触 ； 将碱性垫置于电泳槽内的阴极， 并与胶条的另一端接触， 阴极和阳极端再 经轻压固定确保实现电连接， 最后滴加硅油覆盖整个电泳槽内的胶条与酸性电极液垫和碱 性电极液垫， 并施加直流电压， 通过逐步增加电压实现等电聚焦电泳测试。 0009 在基于 MRB 的稳定 pH 梯度控制时， 所述的酸性垫为酸性电极液垫， 其中所含的电 极液为 ： H2SO4、 HCl、 HBr、 HI、 HNO3、 CH3COOH、 H3PO4、 或者上述混合溶。

19、液的除 HF 外的酸性电 解质， 酸性电极液浓度为 5mM 200mM ； 所述的碱性垫为碱性电极液垫， 其中的电极液为 ： NaOH、 NH4OH、 H2NCH2CH2NH2、 或者上述混合溶液的除 KOH 外的碱性电解质， 碱性性电极液浓度 为 5mM 200mM。 0010 在基于MRB和扩散技术设计非线性pH梯度调控时， 所述的酸性垫为酸性扩散调控 垫， 其中所含的电极液为 ： H2SO4、 HCl、 HBr、 HI、 HNO3、 CH3COOH、 H3PO4、 或者上述混合溶液的酸 说 明 书 CN 104034789 A 4 3/7 页 5 性电解质， 浓度为200mM2000mM。

20、 ； 所述的碱性垫为碱性电极液垫， 其中的电极液为 ： NaOH、 NH4OH、 H2NCH2CH2NH2、 或者上述混合溶液的除 KOH 外的碱性电解质， 浓度为 200mM 2000mM。 0011 所述的酸性垫和碱性垫的基材为 ： 滤纸、 脱脂棉、 海绵或无纺布， 其长度是与所在 的电泳槽两端电极到电泳槽道端部之间的距离相适应， 为 4.5mm 12mm ； 其宽度与所在的 电泳槽的槽道宽度匹配， 为 2.5 6.5mm， 其厚度为 0.6mm 4mm。 0012 本发明涉及一种实现 pH 梯度调控、 避免蛋白质沉淀和非同步聚焦的非固化 pH 梯 度胶条， 即 non-IPG 胶条， 包。

21、括 ： 包含具有亲水面并直接与聚丙烯酰胺凝胶聚合的凝胶支持 膜、 承载蛋白质样品并与支持膜键合的抗对流介质、 形成 pH 梯度并增加亲水性的两性载体 电解质和储存保护 non-IPG-IEF 的保护膜。 0013 所述的凝胶支持膜的其中一面是具有乙烯基团的聚酯材料的薄膜， 以便与聚丙烯 酰胺凝胶牢固键合。 0014 所述的凝胶支持膜的宽度为 2.5 4.5mm ； 长度为 3.5cm 24cm ； 其厚度为 0.15mm 0.35mm。 0015 所述的抗对流介质材料由聚丙烯酰胺凝胶， 其浓度 T 为 2 10 ( 质量百分比浓 度 )， 交联度 C 为 2 6。 0016 所述的抗对流介质的。

22、长度为 3.5cm 24cm， 厚度为 0.45mm 0.65mm， 宽度为 2.5 4.5mm。 0017 所述的保护膜的材料为聚乙烯膜或聚酯膜或腈纶膜或尼龙膜 ； 其长度和宽度均与 凝胶支持膜相匹配， 宽度为 2.5 4.5mm ； 长度为 3.5cm 24cm ； 厚度为 40m 100m。 0018 本发明涉及一种实现上述方法的电泳槽， 包括 ： 设有若干个槽道的聚焦槽框架、 散 热底板、 用于压制酸性垫或碱性垫的盖板和电极部件， 其中 ： 聚焦槽框架和散热底板相互契 合， 电极部件固定于聚焦槽框架和散热底板之间， 盖板与散热底板相互配合。 0019 所述的聚焦槽框架有楔形头且与散热底。

23、板上的楔形孔相配合。 0020 所述的聚焦槽框架有定位孔且与盖板上的定位片相配合。 0021 所述的电极部件包括 ： 相互接触的电极丝和电极片， 其中 ： 电极丝的电极丝环贴 在环聚焦槽框架上所开的电极螺丝孔上。 0022 所述的聚焦槽框架的槽道个数为 6 12 个， 聚焦槽框架沿槽道方向的长度为 7cm 24cm。 技术效果 0023 与现有技术相比， 本发明利用移动反应界面 MRB 通过设计稳定 pH 梯度控制方法 和器件， 提高 IEF 的可调控性 ； 基于 MRB 和扩散技术设计非线性 pH 梯度调控方法和器件， 进一步提高 pH 梯度调控范围和分辨率 ； 基于 MRB 和亲水相互作用。

24、设计非固化 pH 梯度胶条 (non-IPG 胶条 )， 解决 IPG-IEF 的蛋白质非同步聚焦和沉淀问题， 提高分辨率和稳定性。 附图说明 0024 图 1 为基于 MRB 的稳定 pH 梯度控制的电泳槽的纵向横截面图 ； 0025 图 2 为基于 MRB 的稳定 pH 梯度控制的实验结果 ； 0026 图 3 为基于 MRB 和扩散技术设计非线性 pH 梯度的电泳槽的纵向横截面图 ； 0027 图 4 为基于 MRB 和扩散技术设计非线性 pH 梯度调控的实验结果 ； 说 明 书 CN 104034789 A 5 4/7 页 6 0028 图 5 为实施例 1 和实施例 3 使用的非固化。

25、 pH 梯度胶条 (non-IPG 胶条 ) 示意图 ； 0029 图 6 为电泳槽的结构分解图。 具体实施方式 0030 下面对本发明的实施例作详细说明， 本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 实施例 1 0031 如图 1 所示， 本实施例是基于 MRB 的稳定 pH 梯度控制的实例， 实施方法具体如下 ： 1) 对 IPG 或 non-IPG 胶条 1 进行水化上样 ； 2) 制备 IEF 酸性电极液垫 2 和碱性电极液垫 3 ； 3) 将水化后的 IPG 或 non-IPG 胶条放入 IEF 电。

26、泳槽 4 ； 4) 将酸性电极液垫 2 和碱性电极液 垫 3 分别放置于电泳槽 4 的阳极 5 和阴极 6， 并使其接触良好 ； 5) 将所述盖板 7 轻压酸性电 极液垫 2 和碱性电极液垫 3， 之后滴加硅油覆盖整个胶条 1 ； 6) 通直流电， 并程序性升压， 进 行等电聚焦电泳实验。 0032 图 1 显示所述的电泳槽 4， 其中， 电泳槽 4 是导热系数较高的材料制作， 如导热塑 料 (2 10W m-1K-1) 或导热陶瓷 (5 150W m-1K-1) 或它们的混合材料 (2 30W m-1K-1)， 有良 好的散热效果， 所述胶条1放置在电泳槽4的上面， 其在等点聚焦过程中产生的。

27、热量会通过 所述电泳槽 4 散去。所述胶条 1 放置在电泳槽 4 槽道内， 其长度比正电极丝和负电极丝之 间的间距要略微短些， 其两端离阳极 5 和阴极 6 有适当的空间， 酸性电极液垫 2 和碱性电极 液垫 3 各自一端放在胶条 1 上， 另一端放置在阳极 5 或者阴极 6 上面， 起到一个连接桥的作 用， 并且酸性电极液垫 2 和碱性电极液垫 3 分别浸泡正极电极液和负极电极液。等电聚焦 电泳时， 盖板 7 适当落入电泳槽 4 中， 其作用是适当压紧酸性电极液垫 2 和碱性电极液垫 3 与胶条 1 接触， 使其导电良好。接通直流电源即可进行等电聚焦实验。 0033 所述的酸性电极液垫 2，。

28、 其中所含的电极液为 ： H2SO4、 HCl、 HBr、 HI、 HNO3、 CH3COOH、 H3PO4、 或者上述混合溶液的酸性电解质， 但 HF 除外， 酸性电极液浓度为 5mM 200mM ； 所述 的碱性电极液垫3， 其中的电极液为 ： NaOH、 NH4OH、 H2NCH2CH2NH2、 或者上述混合溶液的碱性电 解质， 但 KOH 除外， 碱性电极液浓度为 5mM 200mM。 0034 所述的酸性电极液垫2和碱性电极液垫3的基材为 ： 滤纸、 脱脂棉、 海绵或无纺布， 其长度是与所在的电泳槽两端电极到电泳槽道端部之间的距离相适应， 为 4.5mm 12mm ； 其宽度与所在的。

29、电泳槽的槽道宽度匹配， 为 2.5 6.5mm， 其厚度为 0.6mm 3mm。 实施例 2 0035 如图 2 所示， 本实施例为基于 MRB 的稳定 pH 梯度控制的对比实验结果。在此描述 的实验中， 对有酸性和碱性电极液垫控制的 IEF 实验 ( 图 2A) 和没有酸性和碱性电极液垫 控制的 IEF 实验 ( 图 2B) 进行比较。在图 2A 中， 所述的酸性电极液垫中使用的酸性电极液 为 H3PO4溶液， 浓度为 150mM， 所述的碱性电极液垫中使用的碱性电极液为 H2NCH2CH2NH2， 浓 度为 200mM。而在图 2B 中， 不使用酸性和碱性电极液垫。实验中可见的几种蛋白质样。

30、品分 别为藻蓝蛋白(pI ： 4.45)、 肌红蛋白(pI ： 6.8和7.0)、 血红蛋白(pI ： 7.1和7.5)、 细胞色素 C(pI ： 9.6)。图 2A 中使用的方法可以很好的控制 pH 梯度的漂移。与下面的图 2B 对比后可 以看出， 藻蓝蛋白的相对位置聚焦在 4.3 附近， 肌红蛋白和血红蛋白相对位置分别聚焦在 说 明 书 CN 104034789 A 6 5/7 页 7 6.7 6.85 和 7.1 7.3， 细胞色素 C 相对位置设定在 9.6， 这些相对位置基本与各自的 pI 值接近。而在图 2B 中， 藻蓝蛋白相对位置在 pH4.55 4.7， 肌红蛋白和血红蛋白相对。

31、位置 分别聚焦在 7.95 8.1 和 8.55， 细胞色素 C 相对位置设定在 9.6， 说明 pH 梯度有明显的阴 极漂移现象。图 2A 和 2B 的对比实验结果说明在此描述的 pH 梯度可以很好的控制蛋白质 的漂移。 实施例 3 0036 如图 3 所示， 本实施例是基于 MRB 和扩散技术设计非线性 pH 梯度调控实例， 其具 体方法是 ： 0037 1) 对 IPG 或 non-IPG 胶条 1 进行水化上样 ； 2) 制备 IEF 酸性扩散调控垫 8 和碱性 扩散调控垫 9 ； 3) 将酸性扩散调控垫 8 和碱性扩散调控垫 9 分别放置于电泳槽 4 的阳极 5 和阴极 6， 并使其。

32、接触良好 ； 4) 将水化后的 IPG 或 non-IPG 胶条 1 放入 IEF 电泳槽 4， 并使 胶面与电泳槽底部接触 ； 5) 将所述盖板 7 轻压胶条的阳极端和阴极端， 并分别于酸性调控 垫8和碱性调控垫9电连接， 之后滴加硅油覆盖整个胶条1 ； 6)通直流电， 并程序性升压， 进 行等电聚焦电泳实验。 0038 所述的酸性扩散调控垫， 其中所含的电极液为 ： H2SO4、 HCl、 HBr、 HI、 HNO3、 CH3COOH、 H3PO4、 或者上述混合溶液的酸性电解质， 浓度为 150mM 2000mM ； 所述的碱性扩散调控垫， 其中的电极液为 ： NaOH、 NH4OH、 。

33、H2NCH2CH2NH2、 或者上述混合溶液的除 KOH 以外的碱性电解 质， 浓度为 150mM 2000mM。 0039 所述的酸性扩散调控垫和碱性扩散调控垫的基材为 ： 滤纸、 脱脂棉、 海绵或无纺 布， 其长度是与所在的电泳槽两端电极到电泳槽道端部之间的距离相适应， 为 4.5mm 12mm ； 其宽度与所在的电泳槽的槽道宽度匹配， 为 2.5 6.5mm， 其厚度为 0.6mm 3mm。 实施例 4 0040 如图 4 所示， 本实施例为基于 MRB 和扩散技术设计非线性 pH 梯度调控的实验结 果。 在此描述的实验中， 对有高浓度酸性和碱性电极液垫控制的IEF实验(图4A)和只有酸。

34、 性和碱性电极液垫控制的 IEF 实验 ( 图 4B) 进行比较。在图 4A 中， 所述的高浓度酸性电极 液垫中使用的酸性电极液为 H3PO4溶液， 浓度为 150mM， 所述的高浓度碱性电极液垫中使用 的碱性电极液为H2NCH2CH2NH2， 浓度为1000mM。 而在图4B中， 使用的是实施例2A中所述的酸 性和碱性电极液垫， 即酸性电极液为 H3PO4溶液， 浓度为 150mM， 碱性电极液为 H2NCH2CH2NH2， 浓度为 200mM。实验中可见的几种蛋白质样品分别为藻蓝蛋白 (pI ： 4.45)、 肌红蛋白 (pI ： 6.8 和 7.0)、 血红蛋白 (pI ： 7.1 和 。

35、7.5)、 细胞色素 C(pI ： 9.6)。在图 4A 中， 藻蓝蛋白相对聚 焦位置在 3.6， 肌红蛋白和血红蛋白相对聚焦位置分别在 4.4 4.85 和 5.05 5.4， 细胞 色素C相对聚焦位置设定在9.6， 明显的拉大了阴极端的pH梯度范围， 并且可以看出几条褐 色的条带分辨率提高了， 说明拉大阴极端 pH 梯度范围可以很好的用于阴极端碱性蛋白样 品的分离， 这对于碱性蛋白质样品的重点分析有重要意义。而在图 4B 中， 藻蓝蛋白聚焦位 置在 4.3， 肌红蛋白和血红蛋白位置分别在 pH6.65 6.85 和 7.1 7.3， 细胞色素 C 聚焦 位置设定在 pH9.6， 进一步对比。

36、分析可以看出褐色蛋白的分辨率没有图 4A 中好， 当需要对 碱性 pI 值样品进行重点分析时就会有困难。综上所述分析， 使用本技术所述的高浓度酸性 和碱性扩散调控垫有很好的调节 pH 梯度线性和范围的作用。 实施例 5 说 明 书 CN 104034789 A 7 6/7 页 8 0041 如图 5 所示， 本实施例是非固化 pH 梯度胶条 (non-IPG 胶条 ) 的实例， 包括 ： 包含 能与聚丙烯酰胺凝胶聚合的亲水面的凝胶支持膜 10、 承载蛋白质样品并与支持膜键合的抗 对流介质 11、 形成 pH 梯度和亲水性的两性载体电解质 12 和储存保护胶条的保护膜 13。 0042 所述的凝。

37、胶支持膜 10 的其中一面是具有乙烯基团的材质， 以便与聚丙烯酰胺凝 胶牢固键合。 0043 所述的凝胶支持膜 10 的宽度为 2.5 4.5mm， 长度为 3.5cm 24cm， 其厚度为 0.15mm 0.35mm。 0044 所述的抗对流介质11的材料由聚丙烯酰胺凝胶， 介质浓度T为210(质量百 分百 )， 交联度 C 为 2 6。 0045 所述的抗对流介质 11 的长度为 3.5cm 24cm， 厚度为 0.45mm 0.65mm， 宽度为 2.5 4.5mm。 0046 凝胶支持膜 10 长度和宽度可随需要裁切。抗对流介质 11 与凝胶支持膜 10 牢固 结合， 在抗对流介质 1。

38、1 中添加的两性载体电解质 12 与抗对流介质 11 没有化学键的结合， 在电场作用下， 两性载体电解质 12 沿正极到负极方向形成从低到高的 pH 梯度。两性电解 质质量百分浓度优选在 1.5至 5， 而现有 IPG-IEF 中所有两性电解质质量浓度为 0.5 至 1， 两性电解质浓度的提高有助于提高抗对流介质中的水溶性基团， 使其更好的稳定 pH 梯度。 0047 所述的保护膜 13 覆盖于抗对流介质 11 之上， 材料为聚乙烯膜或聚酯膜或腈纶膜 或尼龙膜 ； 其长度和宽度均与凝胶支持膜 10 相匹配， 宽度为 2.5 4.5mm， 长度为 3.5cm 24cm， 厚度为40m100m。 。

39、可以有效地防止胶条受到污染， 方便non-IPG胶条的长期保 存。 实施例 6 0048 如图 6 所示， 本实施例为电泳槽的实例， 包括 ： 设有若干个槽道的聚焦槽框架 14、 散热底板 16、 用于压制酸性电极液垫或碱性电极液垫的盖板 7 和电极部件， 其中 ： 聚焦槽框 架 14 和散热底板 16 相互契合， 电极部件固定于聚焦槽框架 14 和散热底板 16 之间， 盖板 7 与散热底板 16 相互配合。 0049 所述的聚焦槽框架 14 有楔形头 15 且与散热底板 16 上的楔形孔 17 相配合。 0050 所述的聚焦槽框架 14 有定位孔 22 且与盖板 7 上的定位片 23 相配。

40、合。 0051 所述的电极部件包括 ： 相互接触的电极丝和电极片 20， 其中 ： 电极丝的电极丝环 19 贴在环聚焦槽框架 14 上所开的电极螺丝孔 18 上， 电极固定螺丝 21 穿过所述电极丝环 19 和电极片 20 固定于所述聚焦槽框架 14 上的所述电极螺丝孔 18。 0052 所述的聚焦槽框架 14 的槽道个数为 6 12 个， 聚焦槽框架 14 沿槽道方向的长度 为 7cm 24cm。 0053 等电聚焦电泳时， 盖板 7 落于电泳盘内， 优选所述盖板材料为 PMMA， 其作用是适当 压紧所述酸性垫或碱性垫， 使其与所述等电聚焦电泳盘两端的电极丝接触良好。 0054 在此描述的电。

41、泳槽能很好的与实施例 1 至 6 所述的稳定 pH 梯度的控制技术和调 节 pH 梯度线性的技术相兼容。具体包括 ： 1) 电泳槽 4 是导热系数较高的材料制作， 如导热 塑料 (2 10W m-1K-1) 或导热陶瓷 (5 150W m-1K-1) 或它们的混合材料 (2-30W m-1K-1)， 有良 好的散热效果， 而现有通用的电泳槽散热效果较差， 导热系数一般在3W m-1K-1以下。 2)电泳 说 明 书 CN 104034789 A 8 7/7 页 9 槽槽道宽度与所述 non-IPG-IEF 胶条的宽度匹配， 宽度在 2.5mm 至 4.5mm 之间。3) 所述的 电极使用内嵌设计， 与现有等点聚焦设备完全兼容， 且有更方便操作的优势。 说 明 书 CN 104034789 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104034789 A 10 2/2 页 11 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 104034789 A 11 。