利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104198669 A (43)申请公布日 2014.12.10 CN 104198669 A (21)申请号 201410456112.8 (22)申请日 2014.09.02 G01N 33/15(2006.01) G01N 21/31(2006.01) (71)申请人 蒋建江 地址 213125 江苏省常州市奥林匹克花园 55 幢甲单元 402 室 (72)发明人 蒋建江 潘翔 (54) 发明名称 利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免 疫活性的方法 (57) 摘要 本发明涉及测定气管炎疫苗免疫活性的技术 领域， 尤其是一种利用微量溶血分光光度法测定 气管炎疫苗。

2、免疫活性的方法， 包括如下工艺步骤 ： 试验准备免疫脾细胞悬液制备 SRBC 悬液 配制补体制备抗体形成细胞检测统计学分 析不同浓度气管炎疫苗免疫。本发明工艺将溶 血空斑形成试验和分光光度法测定抗体形成细胞 两种方法进行优化和创新， 建立了微量溶血分光 光度法测定抗体形成细胞。 反应在96孔细胞培养 板内进行， 用酶标仪一次大量检测样品 ； 本发明 工艺经过经过多次重复均能得出相应结果， 固采 用该方法科学、 准确， 重复性好。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号。

3、 CN 104198669 A CN 104198669 A 1/1 页 2 1. 一种利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法， 其特征在于， 包括 如下工艺步骤 ： (1) 试验准备 ： a. 供试品 ： 制备气管炎疫苗 ： 将甲型溶血性链球菌、 白色葡萄球菌、 奈瑟氏双球菌经培 养基培养采集后用甲醛杀菌， 经离心洗涤后按照三种菌等量浓度混合， 经 PBS 稀释而成 ； b 试验对象 ： 50 只雄性 BABL/C 小鼠， 5 6 的周龄， 体重为 18 22g， 以及 5 只体重为 250-300g 的豚鼠， 其中， 小鼠共分 5 组， 每组 10 只小鼠， 具体为 ： 第一组。

4、 ： 绝对空白对照组 ； 第二组 ： 羊红细胞对照组 ； 第三组 ： 气管炎疫苗第一试验组 ； 第四组 ： 气管炎疫苗第二试验组 ； 第五组 ： 气管炎疫苗第三试验组 ； c. 试验溶液 ： 无菌脱纤维绵羊血， D-PBS， pH7.2-7.4 ； d. 试验仪器 ： 显微镜， 酶标仪， 高速冷冻离心机 ； (2) 免疫 ： 将第二组到第五组的小鼠分别用生理盐水和气管炎疫苗在第一天、 第七天、 第十四天颈背部皮下进行 0.5ml/ 只的免疫， 且这些小鼠在第 22 天腹腔内注射 20浓度绵 羊红细胞悬液 0.2ml/ 只， 4 天后将小鼠断颈脊髓处死， 取脾脏 ； (3) 脾细胞悬液制备 ： 。

5、将步骤 (2) 中收集到的脾脏经研磨、 过滤， 使其成为单个脾细胞， 用 D-PBS 溶液洗涤并配制成 2.9107/ml 的细胞悬液 ； (4)SRBC 悬液配制 ： 取绵羊血， 经无菌生理氯化钠溶液 1500rpm 离心 10min 洗涤 3 次， 分别配制成 20和 1的积压绵红细胞悬液 ； (5) 补体制备 ： 取 3 5 只未免疫豚鼠， 采血分离血清后混合， 取压积 SRBC， 按 SRBC 与 豚鼠血清 1 3 的比例加入压积 SRBC， 混匀， 置 4冰箱 30min， 2000r/min 离心 10min 去除 SRBC， 以吸收豚鼠血清中存在的抗 SRBC 抗体 ； (6) 。

6、抗体形成细胞检测 ： 取 96 孔板， 依据分组要求， 按生理盐水 200ul， 1绵羊红细胞 100ul， 补体 100ul， 脾细胞 100ul 加入 1ml 离心管中， 37孵育 1h， 在冰浴条件下停止反应， 2000rpm 离心 10min， 取上清 150 微升至 96 孔细胞板， 酶标仪 450nm 读数 ； (7) 统计学分析 ： 应用 SPSS17.0 软件进行统计学分析， 各实验组与对羊红细胞对照组 采用 t 检验， 以 p 0.05 为无统计学差异 ； 以 p 0.05 为有统计学差异 ； p 0.01 为有非 常显著性差异 ； (8) 不同浓度气管炎疫苗免疫 ： 将含菌。

7、 6108/ml 的气管炎疫苗对倍稀释至 0.375108/ml， 共分成 5 组作为实验组同时与羊红细胞组、 空白组， 按上述试验操作方法进 行。 权 利 要 求 书 CN 104198669 A 2 1/4 页 3 利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法 技术领域 0001 本发明涉及测定气管炎疫苗免疫活性的技术领域， 尤其是一种利用微量溶血分光 光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法。 背景技术 0002 免疫活性是研究药物的生化、 生理效应及机制以及剂量与效应之间的关系， 其目 的是确定药物预期用于临床防、 诊、 治目的的疗效， 确定药物的作用强度， 阐明药物的作用 部位和机制。

8、， 发现预期用于临床以外的广泛药理作用。 0003 溶血空斑形成试验 (PFC) 和分光光度法测定抗体形成细胞 (QHS)， 前者是抗体形 成细胞释放溶血素， 借助于补体使绵羊红细胞溶解， 形成肉眼可见的空斑， 计算形成空斑数 目 ； 后者是通过分光光度法测定抗体形成细胞介导溶血反应中绵羊红细胞溶解后释放血红 蛋白的量。通过抗体形成细胞形成空斑数目和释放血红蛋白量的多少， 可以反映抗体形成 细胞产生抗体的功能。 0004 由于目前气管炎疫苗成品标准中没有活性检测方法， 国内主治功能为预防呼吸道 的反复感染及慢性支气管炎的生物制品中有细菌溶解产物 ( 泛福舒 )， 此制品的活性检测 为 “溶血空。

9、斑法” ， 由于此方法通过肉眼观察、 人工计数， 主观因素影响较大， 客观性和重复 性相对较差。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是 ： 基于上述问题， 本发明提供一种科学、 准确， 重复性 好利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法。 0006 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是 ： 提供一种利用微量溶血分光光度法 测定气管炎疫苗免疫活性的方法， 包括如下工艺步骤 ： 0007 (1) 试验准备 ： 0008 a. 供试品 ： 制备气管炎疫苗 ： 将甲型溶血性链球菌、 白色葡萄球菌、 奈瑟氏双球菌 经培养基培养采集后用甲醛杀菌， 经离心洗涤后按照三种菌等量浓度混合， 。

10、经 PBS 稀释而 成 ； 0009 b 试验对象 ： 50 只雄性 BABL/C 小鼠， 5 6 的周龄， 体重为 18 22g， 以及 5 只体 重为 250-300g 的豚鼠， 其中， 小鼠共分 5 组， 每组 10 只小鼠， 具体为 ： 0010 第一组 ： 绝对空白对照组 ； 0011 第二组 ： 羊红细胞对照组 ； 0012 第三组 ： 气管炎疫苗第一试验组 ； 0013 第四组 ： 气管炎疫苗第二试验组 ； 0014 第五组 ： 气管炎疫苗第三试验组 ； 0015 c. 试验溶液 ： 无菌脱纤维绵羊血， D-PBS， pH7.2-7.4 ； 0016 d. 试验仪器 ： 显微镜，。

11、 酶标仪， 高速冷冻离心机 ； 说 明 书 CN 104198669 A 3 2/4 页 4 0017 (2) 免疫 ： 将第二组到第五组的小鼠分别用生理盐水和气管炎疫苗在第一天、 第 七天、 第十四天颈背部皮下进行0.5ml/只的免疫， 且这些小鼠在第22天腹腔内注射20浓 度绵羊红细胞悬液 0.2ml/ 只， 4 天后将小鼠断颈脊髓处死， 取脾脏 ； 0018 (3) 脾细胞悬液制备 ： 将步骤 (2) 中收集到的脾脏经研磨、 过滤， 使其成为单个脾 细胞， 用 D-PBS 溶液洗涤并配制成 2.9107/ml 的细胞悬液 ； 0019 (4)SRBC 悬液配制 ： 取绵羊血， 经无菌生理。

12、氯化钠溶液 1500rpm 离心 10min 洗涤 3 次， 分别配制成 20和 1的积压绵红细胞悬液 ； 0020 (5)补体制备 ： 取35只未免疫豚鼠， 采血分离血清后混合， 取压积SRBC， 按SRBC 与豚鼠血清 1 3 的比例加入压积 SRBC， 混匀， 置 4冰箱 30min， 2000r/min 离心 10min 去 除 SRBC， 以吸收豚鼠血清中存在的抗 SRBC 抗体 ； 0021 (6) 抗体形成细胞检测 ： 取 96 孔板， 依据分组要求， 按生理盐水 200ul， 1绵羊红 细胞 100ul， 补体 100ul， 脾细胞 100ul 加入 1ml 离心管中， 37孵。

13、育 1h， 在冰浴条件下停止 反应， 2000rpm 离心 10min， 取上清 150 微升至 96 孔细胞板， 酶标仪 450nm 读数 ； 0022 (7) 统计学分析 ： 应用 SPSS17.0 软件进行统计学分析， 各实验组与对羊红细胞对 照组采用 t 检验， 以 p 0.05 为无统计学差异 ； 以 p 0.05 为有统计学差异 ； p 0.01 为 有非常显著性差异 ； 0023 (8) 不同浓度气管炎疫苗免疫 ： 将含菌 6108/ml 的气管炎疫苗对倍稀释至 0.375108/ml， 共分成 5 组作为实验组同时与羊红细胞组、 空白组， 按上述试验操作方法进 行。 0024 。

14、本发明的有益效果是 ： 本发明工艺将溶血空斑形成试验和分光光度法测定抗体形 成细胞两种方法进行优化和创新， 建立了微量溶血分光光度法测定抗体形成细胞。反应在 96 孔细胞培养板内进行， 用酶标仪一次大量检测样品 ； 本发明工艺经过经过多次重复均能 得出相应结果， 固采用该方法科学、 准确， 重复性好。 具体实施方式 0025 现在结合具体实施例对本发明作进一步说明， 以下实施例旨在说明本发明而不是 对本发明的进一步限定。 0026 一种利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法， 包括如下工艺步 骤 ： 0027 (1) 试验准备 ： 0028 a. 供试品 ： 制备气管炎疫苗 ： 将。

15、甲型溶血性链球菌、 白色葡萄球菌、 奈瑟氏双球菌 经培养基培养采集后用甲醛杀菌， 经离心洗涤后按照三种菌等量浓度混合， 经 PBS 稀释而 成 ； 0029 b 试验对象 ： 50 只雄性 BABL/C 小鼠， 5 6 的周龄， 体重为 18 22g， 以及 5 只体 重为 250-300g 的豚鼠， 其中， 小鼠共分 5 组， 每组 10 只小鼠， 具体为 ： 0030 第一组 ： 绝对空白对照组 ； 0031 第二组 ： 羊红细胞对照组 ； 0032 第三组 ： 气管炎疫苗第一试验组 ； 0033 第四组 ： 气管炎疫苗第二试验组 ； 说 明 书 CN 104198669 A 4 3/4 。

16、页 5 0034 第五组 ： 气管炎疫苗第三试验组 ； 0035 c. 试验溶液 ： 无菌脱纤维绵羊血， D-PBS， pH7.2-7.4 ； 0036 d. 试验仪器 ： 显微镜， 酶标仪， 高速冷冻离心机 ； 0037 (2) 免疫 ： 将第二组到第五组的小鼠分别用生理盐水和气管炎疫苗在第一天、 第 七天、 第十四天颈背部皮下进行0.5ml/只的免疫， 且这些小鼠在第22天腹腔内注射20浓 度绵羊红细胞悬液 0.2ml/ 只， 4 天后将小鼠断颈脊髓处死， 取脾脏 ； 0038 (3) 脾细胞悬液制备 ： 将步骤 (2) 中收集到的脾脏经研磨、 过滤， 使其成为单个脾 细胞， 用 D-PB。

17、S 溶液洗涤并配制成 2.9107/ml 的细胞悬液 ； 0039 (4)SRBC 悬液配制 ： 取绵羊血， 经无菌生理氯化钠溶液 1500rpm 离心 10min 洗涤 3 次， 分别配制成 20和 1的积压绵红细胞悬液 ； 0040 (5)补体制备 ： 取35只未免疫豚鼠， 采血分离血清后混合， 取压积SRBC， 按SRBC 与豚鼠血清 1 3 的比例加入压积 SRBC， 混匀， 置 4冰箱 30min， 2000r/min 离心 10min 去 除 SRBC， 以吸收豚鼠血清中存在的抗 SRBC 抗体 ； 0041 (6) 抗体形成细胞检测 ： 取 96 孔板， 依据分组要求， 按生理盐。

18、水 200ul， 1绵羊红 细胞 100ul， 补体 100ul， 脾细胞 100ul 加入 1ml 离心管中， 37孵育 1h， 在冰浴条件下停止 反应， 2000rpm 离心 10min， 取上清 150 微升至 96 孔细胞板， 酶标仪 450nm 读数 ； 0042 (7) 统计学分析 ： 应用 SPSS17.0 软件进行统计学分析， 各实验组与对羊红细胞对 照组采用 t 检验， 以 p 0.05 为无统计学差异 ； 以 p 0.05 为有统计学差异 ； p 0.01 为 有非常显著性差异 ； 0043 (8) 不同浓度气管炎疫苗免疫 ： 将含菌 6108/ml 的气管炎疫苗对倍稀释至。

19、 0.375108/ml， 共分成 5 组作为实验组同时与羊红细胞组、 空白组， 按上述试验操作方法进 行。 0044 三批气管炎疫苗的结果如下 ： 0045 试验组在 450nm 下 OD 值明显高于阴性对照组， 见表 1 ： 0046 表 1 实验组和对照组样本 A450 值 0047 0048 结果从 OD 值表明， 实验组与阴性对照组的抗体形成细胞介导溶血反应中释放的 血红蛋白的量不同， 试验组明显高于阴性组。 0049 将绝对空白组、 试验组分别与羊红细胞组进行 t 检验， 统计结果显示各组与羊红 细胞对照组有显著差异 (p 0.05) 结果表明， 在抗体形成细胞介导的溶血反应中， 。

20、实验组 与对照组中绵羊红细胞溶解后释放血红蛋白的量不同。 0050 不同浓度气管炎疫苗免疫后的结果 说 明 书 CN 104198669 A 5 4/4 页 6 0051 将不同浓度的气管炎疫苗试验组和羊红细胞组、 空白组在 450nm 下 OD 值， 见表 2 ： 0052 表 2 实验组和对照组样本 A450 值 0053 0054 结果从 OD 值表明， 气管炎疫苗随着浓度的降低其 OD 值也成降低趋势。 0055 将绝对空白组、 试验组分别与羊红细胞组进行 t 检验， 统计结果显示空白组和气 管炎疫苗浓度为 6108/ml、 3108/ml、 1.5108/ml 时与羊红细胞对照组有显。

21、著差异 (p 0.05)， 在气管炎疫苗浓度为 0.75108/ml 与羊红细胞组不存在显著差异 (P 0.066)， 在浓度为 0.375108/ml 与羊红细胞组不存在显著差异 (P 0.517)。结果表明， 在抗体形 成细胞介导的溶血反应中， 不同浓度的气管炎疫苗对小鼠刺激后产生抗体释放血红蛋白的 量不同、 且随着浓度的降低释放血红蛋白的量也降低。 0056 分光光度法是通过被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强 度， 对该物质进行定性和定量分析的方法。微量溶血分光光度法测定抗体形成细胞也是通 过溶解后释放血红蛋白的量进行定性分析的方法， 它应用溶血空斑形成试验结合用分光光。

22、 度法测定抗体形成细胞， 能够反映抗体形成细胞的数量变化规律。 0057 气管炎疫苗免疫活性的研究通过绝对空白组、 实验组与绵羊红细胞对照组效应关 系实验加以证明。 实验结果表明， 实验组浓度在达到1.5108/ml以上时与对照组相比均有 显著性差异(p0.05)， 同时在气管炎疫苗浓度低于0.75108/ml时不存在显著差异(p 0.05)。气管炎疫苗在国内用于治疗和预防呼吸道疾病已经有很长一段时间， 效果显著， 在 动物实验中， 可以提高动物对实验性感染的抵抗力， 对巨噬细胞和 B 淋巴细胞有刺激作用， 并可增强呼吸道粘膜的免疫球蛋白分泌。在人体中可增加循环中 T 淋巴细胞数量， 提高唾 。

23、液中 sIgA 含量， 增强对多克隆有丝分裂原的非特异性反应， 证明气管炎疫苗对呼吸道的感 染及慢性支气管炎均有的免疫疗效。 0058 本实施例从非特异性免疫、 体液免疫和细胞免疫角度， 研究气管炎疫苗对机体免 疫增强作用及免疫调节作用。实验表明， 气管炎疫苗在浓度为 1.5108/ml 以上时就可以 达到增强小鼠免疫功能。 0059 以上述依据本发明的理想实施例为启示， 通过上述的说明内容， 相关工作人员完 全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内， 进行多样的变更以及修改。本项发明的技术 性范围并不局限于说明书上的内容， 必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。 说 明 书 CN 104198669 A 6 。