一种基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104101587 A (43)申请公布日 2014.10.15 CN 104101587 A (21)申请号 201410353200.5 (22)申请日 2014.07.23 G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 苏州和迈精密仪器有限公司 地址 215163 江苏省苏州市高新区科灵路 78 号软件园 8 号楼 7 层 (72)发明人 蒋凯 汤亚伟 王萍 张涛 (74)专利代理机构 杭州赛科专利代理事务所 33230 代理人 曹绍文 (54) 发明名称 一种基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧 光检测方法 (57) 摘要 本发明涉及一种基于相均衡倍频。

2、调制原理的 时间分辨荧光检测方法， 通过基频信号调制激发 光源作用于待测标的物上， 触发荧光， 使荧光成周 期性增强与衰减， 再通过二倍频方波信号， 控制采 样周期， 将荧光上升周期和衰减周期都一分为二， 分别独立采样后计算两部分采样差值并相加得到 荧光信号的强度表征值， 得到待测标的物的浓度 值。本发明的方法不仅同样可以消除样品中底物 的荧光干扰， 还可以消除环境背景光、 空间电磁波 工频干扰等信号， 提升检测样品荧光测量信号强 度， 具备常规时间分辨荧光方法无法完成的优势， 可应用于生物、 化学、 医学等领域标的物的荧光强 度检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 。

3、页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104101587 A CN 104101587 A 1/2 页 2 1. 一种基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法， 其特征在于 ： 所述方法包 括以下步骤 ： 步骤 1.1 ： 采用基频信号发生器生成频率为 X 的规则波信号作为基频信号， 所述频率为 X 的规则波信号调制激发光源， 光源发射激发光， 激发光作用于待测标的物上， 触发荧光 ； 步骤 1.2 ： 控制光电传感器件以 N 倍于 X 的频率对被触发的荧光进行采样， 得到采样周 期中每。

4、个时刻的荧光强度信号 Ai； i0 ； 30 N 80 ； 步骤 1.3 ： 将采样周期中每个时刻的荧光强度信号 Ai进行信号滤波和 AD 转换， 得到每 个时刻的荧光强度信号 Ai对应的每个时刻的荧光强度数字信号 Di； i0 ； 步骤 1.4 ： 将每个时刻的荧光强度信号数字 Di根据采样时间作图得到光谱曲线 ； 所述 光谱曲线包括荧光发光周期 S 和荧光衰减周期 R ； 步骤 1.5 ： 对频率为 X 的基频信号进行倍频调制， 产生频率为 X 的倍频信号， X =2X ； 根据倍频信号将荧光发光周期 S 分为时间相等的荧光发光周期 S1和荧光发光周期 S2， 将荧 光衰减周期 R 分为时。

5、间相等的荧光衰减周期 R1和荧光衰减周期 R2； 步骤1.6 ： 对荧光发光周期S1、 S2和荧光衰减周期R1、 R2在光谱曲线上进行积分运算， 得 到荧光发光周期S1的积分面积记为1， 荧光发光周期S2的积分面积记为2， 荧光衰减周 期R1的积分面积记为3， 荧光衰减周期R2的积分面积记为4 ； 210， 340 ； 步骤 1.7 ： 将荧光发光周期 S2的积分面积 2 减去荧光发光周期 S1的积分面积 1， 得到 S =2-1， S 记为荧光发光周期的荧光强度值 ； 将荧光衰减周期 R1的积分面积 3 减去荧光衰减周期 R2的积分面积 4， 得到 R =3-4， R 记为荧光衰减周期的荧 。

6、光强度值 ； 将荧光发光周期的荧光强度值 S加上荧光衰减周期的荧光强度值 R ， 得到 =2-1+3-4， 记为荧光色素发射的荧光总强度值 ； S 0， R 0 ； 步骤 1.8 ： 荧光色素发射的荧光总强度值 即表征待测标的物的荧光信号测量值， 通过标定方法得到待测标的物浓度值。 2. 根据权利要求 1 所述的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法， 其特征 在于 ： 所述步骤 1.1 中， 采用基频信号发生器生成的频率为 X 的规则波信号为方波信号。 3. 根据权利要求 1 所述的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法， 其特征 在于 ： 所述步骤 1.1 中的激发光源通过双光。

7、源调制。 4. 根据权利要求 1 所述的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法， 其特征 在于 ： 所述步骤 1.2 中， N=50。 5. 根据权利要求 1 所述的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法， 其特征 在于 ： 所述步骤 1.2 中， 光电传感器件设为光电二极管。 6. 根据权利要求 1 所述的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法， 其特征 在于 ： 所述步骤 1.3 中的信号滤波和 AD 转换包括以下步骤 ： 步骤 2.1 ： 将以 N 倍于 X 的采样频率采样到的每个时刻的荧光强度信号 Ai进行信号放 大得到放大荧光强度信号 Ai ； 步骤 2.2 ： 将。

8、放大荧光强度信号 Ai 通过高通滤波模块进行滤波， 滤除低频噪声和工频 干扰 ； 步骤 2.3 ： 将滤波后的放大荧光强度信号 Ai 通过模数转换模块进行转换， 得到与所述 采样周期中每个时刻的荧光强度信号 Ai对应的采样周期中每个时刻的荧光强度数字信号 权 利 要 求 书 CN 104101587 A 2 2/2 页 3 Di。 7. 根据权利要求 1 所述的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法， 其特征 在于 ： 所述步骤 1.3 中的滤波为中值滤波。 权 利 要 求 书 CN 104101587 A 3 1/7 页 4 一种基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法 技术领域 。

9、0001 本发明属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料的技术领域， 特 别涉及一种可以消除样品中底物的荧光干扰、 消除环境背景光、 消除空间电磁波工频干扰 等信号以提升检测样品荧光测量信号强度、 提高荧光检测精准度的基于相均衡倍频调制原 理的时间分辨荧光检测方法。 背景技术 0002 目前， 免疫层析 （lateral flow immunoassay, LFIA） 快速检测试纸条多以胶体 金或者荧光色素作为标记物。近年来免疫荧光检测领域在技术上取得突破， 发展了时间分 辨荧光 （Time-resolved fluorescence, TRF） 免疫分析技术， 此技术具有灵敏度高、。

10、 特异性 强、 荧光寿命长、 稳定性好和无放射性污染等特点， 可以广泛应用于现场定量检测， 是未来 即时检测技术发展的重要方向。 0003 时间分辨荧光 （Time-resolved fluorescence, TRF） 免疫分析技术的具体操作过 程是 ： 在试纸条上的检测线 （T） 和质控线 （C） 区域进行荧光色素染色处理 ； 将试纸条放入检 测样品， 当检测样品中含有能和荧光色素结合的检测标的物时， 即能对样品的测量标的物 进行荧光色素染色 ； 然后利用激发光照射样品， 激发荧光色素发出荧光， 由最终的荧光的强 度值分析出测量标的物的种类、 浓度等信息。本技术要求在短时间根据荧光信息对测。

11、量标 的物进行正确的分析。 0004 然而， 激发光照射激发出荧光的过程中， 除了测量标的物发射的荧光， 也即是标记 在样品上的荧光色素的荧光信息外， 还包括两大类干扰荧光， 干扰荧光包括环境背景荧光 和杂质激发荧光。 所谓环境背景荧光， 包括有样品底液或试纸条本身的自发荧光、 反射的波 段较宽的荧光、 检测系统的漏光及电磁干扰等 ； 杂质激发荧光主要是由于样品中包含非测 量标的物的物质， 这类物质也可能会被激发光激发出荧光， 只是这类荧光的激发和淬灭过 程和测量标的物荧光过程不同。 上述这些干扰荧光波段与荧光色素发出的荧光波段相重叠 时， 如果干扰荧光和荧光色素发出的荧光相比， 强度极其微弱。

12、， 则利用传统的时间分辨荧光 检测方法可以测量出标的物的浓度信息， 但是， 当荧光色素所发出的荧光的强度不足够强 时， 则会严重影响测量分析的结果。 0005 在传统的时间分辨荧光检测方法中， 激发光照射样品激发荧光发射衰减的过程 中， 在荧光发射最大值时并不检测荧光， 而是延迟 200s 左右时间， 等待杂质激发荧光淬 灭， 再开始检测荧光， 从而达到消除上述第二类干扰荧光的影响， 以得到染色荧光色素所发 出的荧光强度， 从而获取测量标的物相对准确的信息。 在此方法中， 虽然能消除干扰物质激 发荧光的影响， 但是由于干扰物质具有不确定性， 控制检测荧光延时也具有不确定性， 故不 能肯定完全消。

13、除所有干扰物质激发荧光， 且上述方法并不能消除第一类环境背景光干扰， 如背景自发荧光、 检测系统漏光和电磁干扰等。 发明内容 说 明 书 CN 104101587 A 4 2/7 页 5 0006 本发明解决的技术问题是， 现有技术中， 激发光照射激发出荧光的过程中， 除了测 量标的物发射的荧光， 也即是标记在样品上的荧光色素的荧光信息外， 还包括环境背景荧 光和杂质激发荧光两大类干扰荧光， 而导致的虽然在传统的时间分辨荧光检测方法中， 可 以在激发光照射样品激发荧光发射衰减的过程中， 在荧光发射最大值的时间点延迟 200s 左右时间， 等待杂质激发荧光淬灭， 再开始检测荧光， 从而达到消除上。

14、述第二类干扰荧光的 影响， 以得到染色荧光色素所发出的荧光强度， 从而获取测量标的物相对准确的信息， 但是 由于干扰物质具有不确定性， 控制检测荧光延时也具有不确定性， 故不能肯定完全消除所 有干扰物质激发荧光， 且并不能消除第一类环境背景光干扰， 如背景自发荧光、 检测系统漏 光和电磁干扰等的问题， 进而提供了一种优化的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光 检测方法。 0007 本发明所采用的技术方案是， 一种采用基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光 检测方法， 所述方法包括以下步骤 ： 步骤 1.1 ： 采用基频信号发生器生成频率为 X 的规则波信号作为基频信号， 所述频率为 X 的规则波。

15、信号调制激发光源， 光源发射激发光， 激发光作用于待测标的物上， 触发荧光 ； 步骤1.2 ： 控制光电传感器件以N倍于X的频率对被触发的荧光进行采样， 得到采样周 期中每个时刻的荧光强度信号 Ai； i0 ； 30 N 80 ； 步骤 1.3 ： 将采样周期中每个时刻的荧光强度信号 Ai进行信号滤波和 AD 转换， 得到每 个时刻的荧光强度信号 Ai对应的每个时刻的荧光强度数字信号 Di； i0 ； 步骤 1.4 ： 将每个时刻的荧光强度信号数字 Di根据采样时间作图得到光谱曲线 ； 所述 光谱曲线包括荧光发光周期 S 和荧光衰减周期 R ； 步骤 1.5 ： 对频率为 X 的基频信号进行倍。

16、频调制， 产生频率为 X 的倍频信号， X =2X ； 根据倍频信号将荧光发光周期 S 分为时间相等的荧光发光周期 S1和荧光发光周期 S2， 将荧 光衰减周期 R 分为时间相等的荧光衰减周期 R1和荧光衰减周期 R2； 步骤1.6 ： 对荧光发光周期S1、 S2和荧光衰减周期R1、 R2在光谱曲线上进行积分运算， 得 到荧光发光周期S1的积分面积记为1， 荧光发光周期S2的积分面积记为2， 荧光衰减周 期R1的积分面积记为3， 荧光衰减周期R2的积分面积记为4 ； 210， 340 ； 步骤 1.7 ： 将荧光发光周期 S2的积分面积 2 减去荧光发光周期 S1的积分面积 1， 得到 S =。

17、2-1， S 记为荧光发光周期的荧光强度值 ； 将荧光衰减周期 R1的积分面积 3 减去荧光衰减周期 R2的积分面积 4， 得到 R =3-4， R 记为荧光衰减周期的荧 光强度值 ； 将荧光发光周期的荧光强度值 S加上荧光衰减周期的荧光强度值 R ， 得到 =2-1+3-4， 记为荧光色素发射的荧光总强度值 ； S 0， R 0 ； 步骤 1.8 ： 荧光色素发射的荧光总强度值 即表征待测标的物的荧光信号测量值， 通过标定方法得到待测标的物浓度值。 0008 优选地， 所述步骤1.1中， 采用基频信号发生器生成的频率为X的规则波信号为方 波信号。 0009 优选地， 所述步骤 1.1 中的激。

18、发光源通过双光源调制。 0010 优选地， 所述步骤 1.2 中， N=50。 0011 优选地， 所述步骤 1.2 中， 光电传感器件设为光电二极管。 0012 优选地， 所述步骤 1.3 中的信号滤波和 AD 转换包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 104101587 A 5 3/7 页 6 步骤 2.1 ： 将以 N 倍于 X 的采样频率采样到的每个时刻的荧光强度信号 Ai进行信号放 大得到放大荧光强度信号 Ai ； 步骤 2.2 ： 将放大荧光强度信号 Ai 通过高通滤波模块进行滤波， 滤除低频噪声和工频 干扰 ； 步骤 2.3 ： 将滤波后的放大荧光强度信号 Ai 通过模数转换模块进。

19、行转换， 得到与所述 采样周期中每个时刻的荧光强度信号 Ai对应的采样周期中每个时刻的荧光强度数字信号 Di。 0013 优选地， 所述步骤 1.3 中的滤波为中值滤波。 0014 本发明提供了一种优化的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法， 通 过基频信号调制激发光源作用于待测标的物上， 触发荧光， 使荧光成周期性增强与衰减， 再 通过二倍频方波信号， 控制采样周期， 将荧光上升周期和衰减周期都一分为二， 分别独立采 样后计算两部分采样差值并相加得到荧光信号的强度表征值， 得到待测标的物的浓度值。 本发明的方法不仅同样可以消除样品中底物的荧光干扰， 还可以消除环境背景光、 空间电 磁。

20、波工频干扰等信号， 提升检测样品荧光测量信号强度， 具备常规时间分辨荧光方法无法 完成的优势， 可应用于生物、 化学、 医学等领域标的物的荧光强度检测。 附图说明 0015 图 1 为本发明中基频信号和倍频信号的示意图， 其中 A 为基频信号， B 为倍频信 号 ； 图 2 为本发明中步骤 1.6 的对荧光发光周期 S1、 S2和荧光衰减周期 R1、 R2在光谱曲线 上进行积分运算的示意图。 具体实施方式 0016 下面结合实施例对本发明做进一步的详细描述， 但本发明的保护范围并不限于 此。 0017 本发明涉及一种采用基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法， 所述方 法包括以下步骤 ：。

21、 步骤 1.1 ： 采用基频信号发生器生成频率为 X 的规则波信号作为基频信号， 所述频率为 X 的规则波信号调制激发光源， 光源发射激发光， 激发光作用于待测标的物上， 触发荧光 ； 步骤1.2 ： 控制光电传感器件以N倍于X的频率对被触发的荧光进行采样， 得到采样周 期中每个时刻的荧光强度信号 Ai； i0 ； 30 N 80 ； 步骤 1.3 ： 将采样周期中每个时刻的荧光强度信号 Ai进行信号滤波和 AD 转换， 得到每 个时刻的荧光强度信号 Ai对应的每个时刻的荧光强度数字信号 Di； i0 ； 步骤 1.4 ： 将每个时刻的荧光强度信号数字 Di根据采样时间作图得到光谱曲线 ； 所。

22、述 光谱曲线包括荧光发光周期 S 和荧光衰减周期 R ； 步骤 1.5 ： 对频率为 X 的基频信号进行倍频调制， 产生频率为 X 的倍频信号， X =2X ； 根据倍频信号将荧光发光周期 S 分为时间相等的荧光发光周期 S1和荧光发光周期 S2， 将荧 光衰减周期 R 分为时间相等的荧光衰减周期 R1和荧光衰减周期 R2； 步骤1.6 ： 对荧光发光周期S1、 S2和荧光衰减周期R1、 R2在光谱曲线上进行积分运算， 得 说 明 书 CN 104101587 A 6 4/7 页 7 到荧光发光周期S1的积分面积记为1， 荧光发光周期S2的积分面积记为2， 荧光衰减周 期R1的积分面积记为3，。

23、 荧光衰减周期R2的积分面积记为4 ； 210， 340 ； 步骤 1.7 ： 将荧光发光周期 S2的积分面积 2 减去荧光发光周期 S1的积分面积 1， 得到 S =2-1， S 记为荧光发光周期的荧光强度值 ； 将荧光衰减周期 R1的积分面积 3 减去荧光衰减周期 R2的积分面积 4， 得到 R =3-4， R 记为荧光衰减周期的荧 光强度值 ； 将荧光发光周期的荧光强度值 S加上荧光衰减周期的荧光强度值 R ， 得到 =2-1+3-4， 记为荧光色素发射的荧光总强度值 ； S 0， R 0 ； 步骤 1.8 ： 荧光色素发射的荧光总强度值 即表征待测标的物的荧光信号测量值， 通过标定方法。

24、得到待测标的物浓度值。 0018 本发明提供的方法中， 测量标的物通过激发光照射而发出荧光， 并对得到的荧光 信号进行处理， 能够迅速且容易的求出荧光强度值， 继而通过标定方法得到标的物浓度值。 0019 本发明中， 步骤 1.1 采用如图 1 所示的频率为 X 的基频信号 A， 完成了控制激发光 源并对待测标的物的触发荧光的作业， 步骤 1.2 则是利用 N 倍于 X 的频率控制采样动作对 被触发的荧光进行采样， 其优势在于由于频率较大， 可以获得不失真的荧光发光和衰减过 程中的荧光强度光谱曲线。步骤 1.3 是数模转化的过程， 并同时完成了采样周期中每个时 刻的荧光强度信号 Ai的信号解调。

25、及滤波， 保证去除由于表面粗糙、 有背景干扰物等原因会 发生的荧光的抖动。步骤 1.4 中， 当每个时刻的荧光强度信号 Ai转化为每个时刻的荧光强 度信号数字 Di后， 实则是每个时刻的电压值， 即代表每个时刻的光强， 可以用于制作基于 荧光检测时间周期和荧光强度数值的光谱曲线， 并根据光谱曲线进行积分得到光谱积分曲 线， 此时曲线有明显的上升段和下降段， 光谱曲线的上升段为荧光发光周期 S， 光谱曲线的 下降段为荧光衰减周期 R。步骤 1.5 中， 采用如图 1 所示的频率为 2X 的倍频信号 B 进行倍 频调制， 将荧光发光周期 S 分为时间相等的两部分， 荧光衰减周期 R 分为时间相等的。

26、两部 分， 并在步骤 1.6 中对荧光发光周期 S 的时间相等的两部分和荧光衰减周期 R 时间相等的 两部分在光谱曲线上进行积分运算， 得到荧光发光周期 S 的两部分的积分面积和荧光衰减 周期 R 的两部分的积分面积， 荧光发光周期 S1的积分面积记为 1， 荧光发光周期 S2的积 分面积记为 2， 荧光衰减周期 R1的积分面积记为 3， 荧光衰减周期 R2的积分面积记为 4， 如图 2 所示。在步骤 1.7 中， 将荧光发光周期 S 的两部分积分面积相减， 得到荧光发光 周期的荧光强度值 2-1， 将荧光衰减周期 R 的两部分积分面积相减， 得到荧光衰减周期 的荧光强度值 3-4， 此时的荧。

27、光发光周期的荧光强度值和荧光衰减周期的荧光强度值 已经消除了同样处于荧光发光周期或荧光衰减周期的样品底物的荧光干扰， 亦消除了同样 处于荧光发光周期或荧光衰减周期的环境背景光、 空间电磁波工频干扰等信号的干扰， 且 由于采用的荧光发光周期和荧光衰减周期的积分面积分别时间相等， 故只需要各减一次即 能得到荧光发光周期内的荧光实际强度值和荧光衰减周期内的荧光实际强度值， 最后将其 相加， 得到荧光色素发射的荧光总强度值=2-1+3-4， 简便易操作。 步骤1.8将 荧光色素发射的荧光总强度值 通过标定方法， 最后得到待测标的物浓度值， 完成待测 标的物浓度的检测。 0020 本发明采用的方法不仅可。

28、以消除待测标的物中底物的荧光干扰， 还可以消除环境 背景光、 空间电磁波工频干扰等信号， 提升了待测标的物荧光测量信号强度， 更为安全可 靠， 可行性强， 可操作性强， 具有常规时间分辨荧光的方法无法具备的优势。 说 明 书 CN 104101587 A 7 5/7 页 8 0021 本发明中， 设置激发光源按一定频率 X 开关， 使触发荧光成周期性增强与衰减， 从 而实现控制待测标的物的荧光发射周期和衰减周期的目的。 0022 本发明中， 激发光可以为普通光源， 如发光二极管， 亦可以设置为激光。 0023 本发明中， 激发光源的频率 X 是根据荧光激发物质的激发波长决定的， 不同的待 测标。

29、的物， 其激发波长不相同。 0024 本发明中， 步骤 1.8 的标定方法包括以下步骤 ： 步骤 3.1 ： 利用标准浓度样本进行荧光激发 ； 步骤 3.2 ： 测量出标准浓度样本对应的光强值 ； 步骤 3.3 ： 通过分段线性插值对光强值进行换算， 得到不同的荧光强度值对应的标的 物浓度值 ； 步骤 3.4 ： 对应查询， 从荧光色素发射的荧光总强度值 对应得到待测标的物的荧 光信号测量值。 0025 本发明中， 采用标定方法来确定荧光色素发射的荧光总强度值 对应的待测 标的物的荧光信号测量值， 一则是为了使用标准的计量方式对所检测的荧光信号测量值的 精度进行检测是否符合标准， 适用于精密度。

30、较高的测量， 二则亦适用于校准， 保证荧光信号 测量值的精准。 0026 所述步骤1.1中， 采用基频信号发生器生成的频率为X的规则波信号为方波信号。 0027 本发明中， 将采用基频信号发生器生成的频率为 X 的规则波信号设置为方波信 号， 因为理想的方波是在高和低两个值之间是瞬时变化的， 本发明采用方波来作为基频信 号并在后续的步骤中利用基频信号产生同为方波信号的倍频信号， 整体数据处理更为简 便， 亦更能直观的显示本发明中涉及到的光谱曲线。 0028 所述步骤 1.1 中的激发光源通过双光源调制。 0029 本发明中， 采用双光源调制激发光源， 保证了激发光源的稳定性， 使得其在被激发 。

31、过程中能稳定统一的作用在待测标的物上， 触发荧光。 0030 本发明中， 不同波长激发光源采用的激发光颜色不同。 0031 本发明中， 由于步骤 1.1 中的激发光源通过双光源调制， 故光学检测模块一般设 置为双光源反射式的光学检测模块， 涉及双共轭结构的光路设计， 在实际工作过程中， 一般 以高稳定性的 LED 为激发光源， 并以光电传感器件检测当前扫描位置的荧光光强， 将信息 传输回控制电路进行分析处理， 最终得到待测标的物的浓度数据。 0032 本发明中， 一般采用 LED 完成激发光源的作业， 因 LED 具有光谱带宽窄， 温度系数 低， 散射角度小等优点。 0033 所述步骤 1.2。

32、 中， N=50。 0034 本发明中， 将步骤 1.2 中控制光电传感器件的对被触发的荧光进行采样 N 倍于 X 的频率设置为 N 为 50， 一般情况下， N 为 50 时的采样频率可以较好的采样到各点信号， 又不 会由于采样过于密集导致光谱曲线的失真。 0035 所述步骤 1.2 中， 光电传感器件设为光电二极管。 0036 本发明中， 光电传感器件是常用的采用光电元件作为检测元件的传感器， 其能将 光信号的变化借助光电元件将光信号转换成电信号。本发明中， 只要能将光信号转换成电 信号的光电传感器件在步骤 1.2 中均适用。一般情况下， 采用光电二极管即能满足发明需 说 明 书 CN 1。

33、04101587 A 8 6/7 页 9 求。 0037 所述步骤 1.3 中的信号滤波和 AD 转换包括以下步骤 ： 步骤 2.1 ： 将以 N 倍于 X 的采样频率采样到的每个时刻的荧光强度信号 Ai进行信号放 大得到放大荧光强度信号 Ai ； 步骤 2.2 ： 将放大荧光强度信号 Ai 通过高通滤波模块进行滤波， 滤除低频噪声和工频 干扰 ； 步骤 2.3 ： 将滤波后的放大荧光强度信号 Ai 通过模数转换模块进行转换， 得到与所述 采样周期中每个时刻的荧光强度信号 Ai对应的采样周期中每个时刻的荧光强度数字信号 Di。 0038 本发明中， 信号解调中需要将光源的光信号调制至频率 X 。

34、并转化成有效的电压信 号， 然后通过放大采样周期中每个时刻的荧光强度信号 Ai并通过高通滤波模块， 滤除低频 噪声和工频干扰， 滤除噪声和干扰后， 利用频率为 X 的基频信号和频率为 X 的倍频信号进 行同步的解调， 最后将解调后的结果送入模数转换模块进行转换， 得到对应荧光光强的数 字信号 Di。 0039 本发明中， 模数转换模块可以用过高精度、 低噪声的 24 位 - 型 AD 转换芯片来 完成。 0040 本发明中， 由于由光电传感器件扫描采样的结果仍存在一定的干扰信号， 故步骤 1.3中将采样周期中每个时刻的荧光强度信号Ai进行信号滤波和AD转换， 得到每个时刻的 荧光强度信号 Ai。

35、对应的每个时刻的荧光强度数字信号 Di， 一般情况下， 设置控制电路， 满足 光电传感器件将扫描采样的信息反馈给 CPU， 并通过光电信号 IV 转换模块将光源的光信号 调制至一定频率并转化成有效的电压信号， 然后通过信号放大滤波模块滤除低频噪声和工 频干扰并最后通过 AD 转换模块荧光强度信号由模拟信号转换成数字信号， 得到转换为数 字信号的荧光强度并进行后续的分析计算， 最终得到待测标的物的实际浓度值。 0041 所述步骤 1.3 中的滤波为中值滤波。 0042 本发明中， 中值滤波是基于排序统计理论的一种能有效抑制噪声的非线性信号处 理技术， 其基本原理是把数字图像或数字序列中一点的值用。

36、该点的一个邻域中各点值的中 值代替， 让周围的像素值接近的真实值， 从而消除孤立的噪声点， 其优点在于能保护边缘信 息 , 是经典的平滑噪声的方法。 0043 本发明中， 基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法可以通过设置相关 的设备来完成， 设备可以由本领域技术人员在本发明的方法基础上设置。 一般情况下， 在设 备的壳体内设置光学检测机构和控制电路， 设有待测标的物的试纸条自壳体的试纸条插入 口插入， 控制电路控制光学检测模块对试纸条上的待测标的物的荧光强度进行检测、 扫描 采样， 采集荧光层析试纸条上控制线 （C） 与测量线 （T） 的荧光标记物发射光强， 记录光谱采 样信息曲线并显。

37、示， 由控制电路对荧光强度进行分析， 得到标的物的浓度。 0044 本发明中， 可以通过选择基于时间分辨荧光技术的层析试纸条， 加入不同浓度的 检测样品， 待试纸条完全干燥之后多次检测其控制线 （C） 、 测量线信号 （T） ， 考察其 T/C 值的 稳定性， 由于荧光漂白效果， C 线、 T 线绝对光强都会衰减， 而 T/C 值保持相对稳定， 能达到 0.5的检测灵敏度指标。 0045 本发明解决了现有技术中， 激发光照射激发出荧光的过程中， 除了测量标的物发 说 明 书 CN 104101587 A 9 7/7 页 10 射的荧光， 也即是标记在样品上的荧光色素的荧光信息外， 还包括环境背。

38、景荧光和杂质激 发荧光两大类干扰荧光， 而导致的虽然在传统的时间分辨荧光检测方法中， 可以在激发光 照射样品激发荧光发射衰减的过程中， 在荧光发射最大值的时间点延迟 200s 左右时间， 等待杂质激发荧光淬灭， 再开始检测荧光， 从而达到消除上述第二类干扰荧光的影响， 以得 到染色荧光色素所发出的荧光强度， 从而获取测量标的物相对准确的信息， 但是由于干扰 物质具有不确定性， 控制检测荧光延时也具有不确定性， 故不能肯定完全消除所有干扰物 质激发荧光， 且并不能消除第一类环境背景光干扰， 如背景自发荧光、 检测系统漏光和电磁 干扰等的问题， 通过基频信号调制激发光源作用于待测标的物上， 触发荧光， 使荧光成周期 性增强与衰减， 再通过二倍频方波信号， 控制采样周期， 将荧光上升周期和衰减周期都一分 为二， 分别独立采样后计算两部分采样差值并相加得到荧光信号的强度表征值， 得到待测 标的物的浓度值。本发明的方法不仅同样可以消除样品中底物的荧光干扰， 还可以消除环 境背景光、 空间电磁波工频干扰等信号， 提升检测样品荧光测量信号强度， 具备常规时间分 辨荧光方法无法完成的优势， 可应用于生物、 化学、 医学等领域标的物的荧光强度检测。 说 明 书 CN 104101587 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104101587 A 11 。