一种实时荧光定量RTPCR鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102808040 A (43)申请公布日 2012.12.05 CN 102808040 A *CN102808040A* (21)申请号 201110143039.5 (22)申请日 2011.05.30 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人山东绿都生物科技有限公司地址 256600 山东省滨州市黄河二路 169 号 (72)发明人沈志强谢金文李安王金良苗立中 (74)专利代理机构北京神州华茂知识产权代理有限公司 11358 代理人吴照幸 (54) 发。

2、明名称一种实时荧光定量 RT-PCR 鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的方法 (57) 摘要本发明涉及一种实时荧光定量 RT-PCR 反应结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的方法。设计合成了 3 条引物， P1/P3 可特异性扩增猪瘟病毒强毒株，预期扩增产物为 549bp， Tm 值为 89.50.5 ； P2/P3 可特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株，预期扩增产物为 164bp， Tm 值为 84.50.5。在最优条件下进行荧光定量 RT-PCR反应和复合荧光定量RT-PCR反应，最终成功建立了能够鉴别区分猪瘟野毒与疫苗毒的荧光定量RT-PCR方法。不仅可以根据熔解曲线波峰。

3、的多少确定是否有非特异性 PCR 产物，还可根据波峰峰顶对应的温度进一步确定产物的特异性。本方法可以根据熔解曲线立即判断发病猪是强毒或者弱毒疫苗感染，减少了未感染免疫猪被误杀的可能性，具有很高的科研与临床应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 4 页附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 4 页附图 1 页 1/1 页 2 1.一种能够鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR) 的诊断方法，其特征是设计合成 3 条引物： P1(5 -TTGGCATCATT。

4、GCATAAGGG-3 ) 为猪瘟强毒特异上游引物， P2(5 -GTGGTCTACACAGGGGGGGT-3 ) 为猪瘟兔化弱毒疫苗株特异上游引物， P3(5 -GATTACAACGCCATCTCTGTTACA-3 ) 为猪瘟病毒共用下游引物； P1/P3 可特异性扩增猪瘟病毒强毒株，预期扩增产物为 549bp， Tm 值为 89.50.5； P2/P3 可特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株，预期扩增产物为 164bp， Tm 值为 84.50.5 ；然后提取病毒总 RNA 进行常规 RT-PCR 反应。 2. 一种如权利要求 1 所述的鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的反转录 - 复合套式。

5、聚合酶链式反应(RT-nPCR)的诊断方法，其特征是PCR反应条件为： 94预变性3min ； 94变性30s， 59退火 30s， 72延伸 30s，共 35 个循环； 72延伸 10min。 3.一种如权利要求1所述的鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的反转录-复合套式聚合酶链式反应 (RT-nPCR) 的诊断方法，其特征是用引物 P1/P3 进行 PCR 反应只能从强毒基因组扩增出一条Tm值为88.5目的片段，而以引物P2/P3进行PCR反应只能从兔化弱毒基因组扩增出一条 TM 值为 85.5的目的片段，与此同时， BVDV、 PRV、 PCV、 PPV、 PRRSV 等常见猪。

6、源病毒均无扩增条带。 4.一种如权利要求1所述的鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的诊断方法，其特征是以5RID50的细胞苗基因组为模板，仍能得到特异性扩增，具有很高的敏感性。 5.一种如权利要求1所述的鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的反转录-复合套式聚合酶链式反应 (RT-nPCR) 的诊断方法，其特征是本方法中采用了 SYBR Green I 荧光染料。 6.一种如权利要求1所述的鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的诊断方法，其特征是本方法是荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的。

7、方法。权利要求书 CN 102808040 A 2 1/4 页 3 一种实时荧光定量 RT-PCR 鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的方法技术领域 0001 本发明涉及一种实时荧光定量 RT-PCR 反应结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的方法。背景技术 0002 猪瘟是严重威胁养猪业，造成重大经济损失的病毒性、烈性、高度接触性、传染性疾病，被世界动物卫生组织 (OIE) 列为 A 类 16 种法定传染病之一。1999 年 2 月 12 日我国农业部发布的第 96 号公告也将猪瘟列为一类动物疫病。 0003 迄今为止，猪瘟已经存在了近 2 个世纪之久，尽管许多国家。

8、采取了严格的措施控制和扑灭猪瘟，但由于目前生猪贸易全球化和养猪业集约化的发展，猪瘟在很多国家被消灭后又多次死灰复燃。目前，猪瘟在世界许多国家和地区仍广泛传播。多年来，由于我国猪瘟兔化弱毒疫苗的广泛使用，已经很好的控制了猪瘟在我国的大面积流行，但近年来由于种种原因，猪瘟在一些地区常有零星发生，而且常呈隐性感染，给临床确诊带来了很大的困难。 0004 猪瘟弱毒疫苗在全世界的广泛应用对控制和消灭猪瘟起到了极其重要的作用，但临床上非典型猪瘟及免疫失败的不断发生对猪瘟诊断技术以及区分强毒自然感染与疫苗弱毒提出了更高的要求，增加了难度。 0005 为了降低猪瘟给养猪业带。

9、来的巨大经济损失，需要快速、准确的诊断技术，世界各国也为此进行了大量的研究，主要分为检测病毒抗原和检测病毒抗体两个方向。目前，检测病毒抗原的方法主要有动物接种试验、新城疫病毒强化试验、琼脂扩散试验、免疫荧光试验、血清中和试验及 RT-PCR 方法等。检测病毒血清的方法主要有血清中和试验、酶联免疫吸附试验、正想间接血凝试验和间接免疫荧光试验等。但这些方法均不能有效区分野毒和弱毒疫苗株感染。 0006 SYBR Green I 是一种能特异性与双链 DNA 结合的新型荧光染料，结合后能发出 560nm 波长的荧光。PCR 反应完成后，当体系温度从 60逐渐升高，。

10、 PCR 产物逐渐解链，检测到的荧光值逐步下降，当温度接近Tm值时，双链DNA解链速度急剧变化，熔解曲线会在该温度出现一个相应波峰，因此，不仅可以根据熔解曲线波峰的多少确定是否有非特异性 PCR 产物，还可根据波峰峰顶对应的温度进一步确定产物的特异性。近年来荧光定量 PCR 结合熔解曲线分析方法在病原体检测方面得到广泛应用，王小飞等 (2006) 建立了可快速检测 GSTM1 基因多态性的 SYBR Green I 结合熔解曲线分析方法，在 1h 内可完成基因分型；刘新钰等 (2004) 建立了可检测乙型肝炎病毒变异株的 PCR 熔解曲线法，该法简便、省时，。

11、与 DNA 测序法符合率是 91.28，适合于临床快速诊断；郑薇薇等 (2005) 建立了可检测 APC 基因突变的实时聚合酶链反应熔解曲线分析法，从18例肿瘤患者的组织标本中检测出7例缺失突变株，正常人外周血标本检测结果均为阴性。虽然荧光定量 PCR 结合熔解曲线分析在基因分型中已得到较为广泛应用，但目前在猪瘟病毒强弱毒的鉴别诊断中还没有报道。说明书 CN 102808040 A 3 2/4 页 4 发明内容 0007 本发明提供一种实时荧光定量 RT-PCR 反应结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的方法。 0008 本发明是对 GenBank 中登。

12、录的 Shimen 株、 HCLV 株、 Alfort 株、 Brescia 株等 25 株猪瘟病毒的基因组全序列进行比较分析，在其高度保守区设计合成 3 条引物： P1(5 -TTGGCATCATTGCATAAGGG-3 ) 为猪瘟强毒特异上游引物， P2(5-GTGGTCTACACAGGGGGGGT-3)为猪瘟兔化弱毒疫苗株特异上游引物， P3(5-GATT ACAACGCCATCTCTGTTACA-3 ) 为猪瘟病毒共用下游引物。P1/P3 可特异性扩增猪瘟病毒强毒株，预期扩增产物为 549bp，。

13、Tm 值为 89.50.5 ； P2/P3 可特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株，预期扩增产物为 164bp， Tm 值为 84.50.5。然后提取病毒总 RNA 进行常规 RT-PCR 反应，接着进行 PCR 反应条件的优化，并进行特异性实验、敏感性实验、重复性实验等。进行荧光定量 RT-PCR 反应和复合荧光定量 RT-PCR 反应，成功建立了能够鉴别区分猪瘟野毒与疫苗毒的荧光定量 RT-PCR 方法。PCR 反应条件为： 94预变性 3min ； 94变性 30s， 59退火 30s， 72延伸 30s，共 35 个循环； 72延伸 10min。该方法采用了 SYBR。

14、 Green I 荧光染料；并且以 5RID50的细胞苗基因组为模板，仍能得到特异性扩增，具有很高的敏感性。 0009 SYBR Green I 是一种能特异性与双链 DNA 结合的新型荧光染料，结合后能发出 560nm 波长的荧光。PCR 反应完成后，当体系温度从 60逐渐升高， PCR 产物逐渐解链，检测到的荧光值逐步下降，当温度接近Tm值时，双链DNA解链速度急剧变化，熔解曲线会在该温度出现一个相应波峰，因此，不仅可以根据熔解曲线波峰的多少确定是否有非特异性 PCR 产物，还可根据波峰峰顶对应的温度进一步确定产物的特异性。虽然荧光定量 PCR 结合熔解曲。

15、线分析在基因分型中已得到较为广泛应用，但迄今为止在猪瘟病毒强弱毒的鉴别诊断中还没有报道，本发明正好填补该项空白。 0010 猪瘟病毒基因组相对保守，但也包含强毒与弱毒的差异性位点，可以作为强毒与弱毒分子鉴别诊断的靶区域。实验中选用的引物 P3 是根据 CSFV 的高度保守区设计的，引物P1是根据强毒的高度保守区设计的，而引物P2是根据兔化弱毒的高度保守区设计的，用引物P1/P3进行PCR反应只能从强毒基因组扩增出一条Tm值为88.5目的片段，而以引物 P2/P3 进行 PCR 反应只能从兔化弱毒基因组扩增出一条 TM 值为 85.5的目的片段，与此同时， BVDV、。

16、 PRV、 PCV、 PPV、 PRRSV 等常见猪源病毒均无扩增条带，表明本试验是特异的。本方法能从 0.065pg 的病毒基因组总 RNA 中扩增到目的片段，具有很高的敏感性。对 24 份猪瘟病料进行PCR检测，结果有10份属于强毒， 12份属于弱毒。表明本方法可用于临床应用，同时也证明了本方法的重复性和适应性良好。 0011 本发明建立的鉴别猪瘟强毒感染与疫苗弱毒的荧光定量 RT-PCR 结合熔解曲线分析方法扩增效率高、线性范围广、检测时间短，熔解曲线分析显示为单特异峰，并且具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点。本发明建立的鉴别猪瘟强毒感染与疫苗弱毒的。

17、荧光定量 RT-PCR 结合熔解曲线分析方法扩增效率高、线性范围广、检测时间短，可对猪瘟强毒感染做出快速准确诊断，可将强毒感染猪迅速从免疫猪群中筛选出来，可用于免疫猪群的猪瘟净化检测，并减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。 0012 本发明的优点说明书 CN 102808040 A 4 3/4 页 5 0013 1、本发明所使用的猪瘟病毒特异引物是对 GenBank 中登录的 Shimen 株、 HCLV 株、 Alfort 株、 Brescia 株等 25 株猪瘟病毒基因组全序列进行比较分析后，在其 E2 蛋白基因高度保守区设计合成 3 条引物： P1(5 -T。

18、TGGCATCATTGCATAAGGG-3 ) 为猪瘟强毒特异上游引物， P2(5 -GTGGTCTACACAGGGGGGGT-3 ) 为猪瘟兔化弱毒疫苗株特异上游引物， P3(5 -GATTACAACGCCATCTCTGTTACA-3)为猪瘟病毒共用下游引物。 P1/P3可特异性扩增猪瘟病毒强毒株，预期扩增产物为 549bp， Tm 值为 89.50.5； P2/P3 可特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株，预期扩增产物为 164bp， Tm 值为 84.50.5。用引物 P1/P3 进行 PCR 反应只能从强毒基因组扩增出一条Tm值为88.5目的片段，而以引物P2/P3进行PCR反应。

19、只能从兔化弱毒基因组扩增出一条 TM 值为 85.5的目的片段，与此同时， BVDV、 PRV、 PCV、 PPV、 PRRSV 等常见猪源病毒均无扩增条带，具有高度特异性，荧光定量PCR反应呈现特征性S形扩增动力曲线，熔解曲线分析显示出现单特异峰，不与 BVDV 发生交叉反应。 0014 2、灵敏度高，能从 0.065pg 的病毒基因组总 RNA 中扩增到目的片段，扩增效率高、线性范围广。 0015 3、检测速度快，所需时间短。整个过程只需两个半小时左右。 0016 4、不需后续处理，没有电泳、照相、显色等过程。 0017 5、操作简单，自动化程度高。P。

20、CR 反应闭管完成，勿需开盖，没有污染。 0018 6、本发明所使用的荧光染料是 SYBR Green I，该染料可嵌合于 DNA 双链结构的小沟中，当其处于游离状态时，检测不到荧光信号，当其结合于双链 DNA 后荧光强度明显增强，可被荧光探测系统检测到，而且具有方法简便、成本较低等优势。附图说明 0019 图 1 ：引物在猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组中的位置。 0020 图 2 ：复合荧光定量 RT-PCR 检测结果。具体实施方式 0021 首先，应用生物学软件 DNAstar 比对 GenBank 中登录的 Shimen 株、 HCLV 株、 Alfort 株。

21、、 Brescia 株等 25 株的猪瘟病毒基因组全序列，找出强毒和弱毒基因组全序列中有差异的地方，以此作为猪瘟强弱毒特异性上游引物的 3 端，应用生物学软件 Primer Premier5.0 设计出 3 条引物： P1(5 -TTGGCATCATTGCATAAGGG-3 ) 为猪瘟强毒特异上游引物， P2(5 -GTGGTCTACACAGGGGGGGT-3 ) 为猪瘟兔化弱毒疫苗株特异上游引物， P3(5 -GATTACAACGCCATCTCTGTTACA-3)为猪瘟病毒共用下游引物。 P1/P3可特异性扩增猪瘟病毒强毒株，预期扩增产物为 549bp， Tm 值为 89.5。

22、0.5； P2/P3 可特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株，预期扩增产物为 164bp， Tm 值为 84.50.5。 0022 然后，提取病毒总 RNA 进行常规 RT-PCR 反应，接着进行 PCR 反应条件的优化，并进行特异性实验、敏感性实验、重复性实验等。在最优条件下进行荧光定量 RT-PCR 反应和复合荧光定量 RT-PCR 反应，最终成功建立了能够鉴别区分猪瘟野毒与疫苗毒的荧光定量 RT-PCR方法。与此同时，本方法能以10倍系列稀释的RID505104的细胞苗基因组为模板，进行荧光定量 PCR 扩增，结果表明将模板稀释 10000 倍后仍能得到特异性扩增，。

23、并且具有良好的扩增曲线，本方法能从0.065pg的病毒基因组总RNA中扩增到目的片段，具有很高说明书 CN 102808040 A 5 4/4 页 6 的敏感性。本方法也具有很高的特异性，应用建立的复合荧光定量 RT-PCR 分别扩增 BVDV、猪伪狂 PRV、 PPV、 PCV、 PRRSV 基因组均无特异性峰值出现。用已经建立的荧光定量 RT-PCR 方法在不同时间、不同地点对每份样品重复检验 3 次，结果一致。 0023 最后，通过临床病料检测和与我们建立的反转录 - 复合套式聚合酶链式反应 (RT-nPCR) 鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗诊断方法进行比较，对该方法进行临床检测验证。对 24 份猪瘟病料进行 RT-PCR 检测，结果熔解曲线分析显示有 10 份样品属于强毒， 12 份样品属于疫苗毒， 2 份样品结果不明确，与 RT-nPCR 复合率是 91.67。 0024 表明本方法可用于临床应用，同时也证明了本方法的稳定性和适应性良好。说明书 CN 102808040 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说明书附图 CN 102808040 A 7 。

摘要
申请专利号：	CN201110143039.5	申请日：	2011.05.30
公开号：	CN102808040A	公开日：	2012.12.05
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12Q 1/70申请公布日:20121205\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/70; C12Q1/68; G01N21/64	主分类号：	C12Q1/70
申请人：	山东绿都生物科技有限公司
发明人：	沈志强; 谢金文; 李安; 王金良; 苗立中
地址：	256600 山东省滨州市黄河二路169号
优先权：
专利代理机构：	北京神州华茂知识产权代理有限公司 11358	代理人：	吴照幸
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内容摘要

本发明涉及一种实时荧光定量RT-PCR反应结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的方法。设计合成了3条引物，P1/P3可特异性扩增猪瘟病毒强毒株，预期扩增产物为549bp，Tm值为89.5±0.5℃；P2/P3可特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株，预期扩增产物为164bp，Tm值为84.5±0.5℃。在最优条件下进行荧光定量RT-PCR反应和复合荧光定量RT-PCR反应，最终成功建立了能够鉴别区分猪瘟野毒与疫苗毒的荧光定量RT-PCR方法。不仅可以根据熔解曲线波峰的多少确定是否有非特异性PCR产物，还可根据波峰峰顶对应的温度进一步确定产物的特异性。本方法可以根据熔解曲线立即判断发病猪是强毒或者弱毒疫苗感染，减少了未感染免疫猪被误杀的可能性，具有很高的科研与临床应用价值。

权利要求书

1：一种能够鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的反转录 - 复合套式聚合酶链式反应 (RT-nPCR) 的诊断方法，其特征是设计合成 3 条引物： P1(5′ -TTGGCATCATTGCATAAGGG-3′ ) 为猪瘟强毒特异上游引物， P2(5′ -GTGGTCTACACAGGGGGGGT-3′ ) 为猪瘟兔化弱毒疫苗株特异上游引物， P3(5′ -GATTACAACGCCATCTCTGTTACA-3′ ) 为猪瘟病毒共用下游引物； P1/P3 可特异性扩增猪瘟病毒强毒株，预期扩增产物为 549bp， Tm 值为 89.5±0.5℃； P2/P3 可特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株，预期扩增产物为 164bp， Tm 值为 84.5±0.5℃ ；然后提取病毒总 RNA 进行常规 RT-PCR 反应。
2：一种如权利要求 1 所述的鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的反转录 - 复合套式聚合酶链式反应 (RT-nPCR) 的诊断方法，其特征是 PCR 反应条件为： 94℃预变性 3min ； 94℃变性 30s， 59℃退火 30s， 72℃延伸 30s，共 35 个循环； 72℃延伸 10min。
3：一种如权利要求 1 所述的鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的反转录 - 复合套式聚合酶链式反应 (RT-nPCR) 的诊断方法，其特征是用引物 P1/P3 进行 PCR 反应只能从强毒基因组扩增出一条 Tm 值为 88.5℃目的片段，而以引物 P2/P3 进行 PCR 反应只能从兔化弱毒基因组扩增出一条 TM 值为 85.5℃的目的片段，与此同时， BVDV、 PRV、 PCV、 PPV、 PRRSV 等常见猪源病毒均无扩增条带。
4：一种如权利要求 1 所述的鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的反转录 - 复合套式聚合酶链式反应 (RT-nPCR) 的诊断方法，其特征是以 5×RID50 的细胞苗基因组为模板，仍能得到特异性扩增，具有很高的敏感性。
5：一种如权利要求 1 所述的鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的反转录 - 复合套式聚合酶链式反应 (RT-nPCR) 的诊断方法，其特征是本方法中采用了 SYBR Green I 荧光染料。
6：一种如权利要求 1 所述的鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的反转录 - 复合套式聚合酶链式反应 (RT-nPCR) 的诊断方法，其特征是本方法是荧光定量 RT-PCR 结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗的方法。

说明书

一种实时荧光定量 RT-PCR 鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的方法
    技术领域本发明涉及一种实时荧光定量 RT-PCR 反应结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的方法。
     背景技术猪瘟是严重威胁养猪业，造成重大经济损失的病毒性、烈性、高度接触性、传染性疾病，被世界动物卫生组织 (OIE) 列为 A 类 16 种法定传染病之一。1999 年 2 月 12 日我国农业部发布的第 96 号公告也将猪瘟列为一类动物疫病。
     迄今为止，猪瘟已经存在了近 2 个世纪之久，尽管许多国家采取了严格的措施控制和扑灭猪瘟，但由于目前生猪贸易全球化和养猪业集约化的发展，猪瘟在很多国家被消灭后又多次死灰复燃。目前，猪瘟在世界许多国家和地区仍广泛传播。多年来，由于我国猪瘟兔化弱毒疫苗的广泛使用，已经很好的控制了猪瘟在我国的大面积流行，但近年来由于种种原因，猪瘟在一些地区常有零星发生，而且常呈隐性感染，给临床确诊带来了很大的困难。
     猪瘟弱毒疫苗在全世界的广泛应用对控制和消灭猪瘟起到了极其重要的作用，但临床上非典型猪瘟及免疫失败的不断发生对猪瘟诊断技术以及区分强毒自然感染与疫苗弱毒提出了更高的要求，增加了难度。
     为了降低猪瘟给养猪业带来的巨大经济损失，需要快速、准确的诊断技术，世界各国也为此进行了大量的研究，主要分为检测病毒抗原和检测病毒抗体两个方向。目前，检测病毒抗原的方法主要有动物接种试验、新城疫病毒强化试验、琼脂扩散试验、免疫荧光试验、血清中和试验及 RT-PCR 方法等。检测病毒血清的方法主要有血清中和试验、酶联免疫吸附试验、正想间接血凝试验和间接免疫荧光试验等。但这些方法均不能有效区分野毒和弱毒疫苗株感染。
     SYBR Green I 是一种能特异性与双链 DNA 结合的新型荧光染料，结合后能发出 560nm 波长的荧光。PCR 反应完成后，当体系温度从 60℃逐渐升高， PCR 产物逐渐解链，检测到的荧光值逐步下降，当温度接近 Tm 值时，双链 DNA 解链速度急剧变化，熔解曲线会在该温度出现一个相应波峰，因此，不仅可以根据熔解曲线波峰的多少确定是否有非特异性 PCR 产物，还可根据波峰峰顶对应的温度进一步确定产物的特异性。近年来荧光定量 PCR 结合熔解曲线分析方法在病原体检测方面得到广泛应用，王小飞等 (2006) 建立了可快速检测 GSTM1 基因多态性的 SYBR Green I 结合熔解曲线分析方法，在 1h 内可完成基因分型；刘新钰等 (2004) 建立了可检测乙型肝炎病毒变异株的 PCR 熔解曲线法，该法简便、省时，与 DNA 测序法符合率是 91.28％，适合于临床快速诊断；郑薇薇等 (2005) 建立了可检测 APC 基因突变的实时聚合酶链反应熔解曲线分析法，从 18 例肿瘤患者的组织标本中检测出 7 例缺失突变株，正常人外周血标本检测结果均为阴性。虽然荧光定量 PCR 结合熔解曲线分析在基因分型中已得到较为广泛应用，但目前在猪瘟病毒强弱毒的鉴别诊断中还没有报道。
     发明内容本发明提供一种实时荧光定量 RT-PCR 反应结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的方法。
     本发明是对 GenBank 中登录的 Shimen 株、 HCLV 株、 Alfort 株、 Brescia 株等 25 株猪瘟病毒的基因组全序列进行比较分析，在其高度保守区设计合成 3 条引物： P1(5 ′ -TTGGCATCATTGCATAAGGG-3 ′ ) 为猪瘟强毒特异上游引物， P2(5′ -GTGGTCTACACAGGGGGGGT-3′ ) 为猪瘟兔化弱毒疫苗株特异上游引物， P3(5′ -GATT ACAACGCCATCTCTGTTACA-3′ ) 为猪瘟病毒共用下游引物。P1/P3 可特异性扩增猪瘟病毒强毒株，预期扩增产物为 549bp， Tm 值为 89.5±0.5℃ ； P2/P3 可特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株，预期扩增产物为 164bp， Tm 值为 84.5±0.5℃。然后提取病毒总 RNA 进行常规 RT-PCR 反应，接着进行 PCR 反应条件的优化，并进行特异性实验、敏感性实验、重复性实验等。进行荧光定量 RT-PCR 反应和复合荧光定量 RT-PCR 反应，成功建立了能够鉴别区分猪瘟野毒与疫苗毒的荧光定量 RT-PCR 方法。PCR 反应条件为： 94℃预变性 3min ； 94℃变性 30s， 59℃退火 30s， 72℃延伸 30s，共 35 个循环； 72℃延伸 10min。该方法采用了 SYBR Green I 荧光染料；并且以 5×RID50 的细胞苗基因组为模板，仍能得到特异性扩增，具有很高的敏感性。
     SYBR Green I 是一种能特异性与双链 DNA 结合的新型荧光染料，结合后能发出 560nm 波长的荧光。PCR 反应完成后，当体系温度从 60℃逐渐升高， PCR 产物逐渐解链，检测到的荧光值逐步下降，当温度接近 Tm 值时，双链 DNA 解链速度急剧变化，熔解曲线会在该温度出现一个相应波峰，因此，不仅可以根据熔解曲线波峰的多少确定是否有非特异性 PCR 产物，还可根据波峰峰顶对应的温度进一步确定产物的特异性。虽然荧光定量 PCR 结合熔解曲线分析在基因分型中已得到较为广泛应用，但迄今为止在猪瘟病毒强弱毒的鉴别诊断中还没有报道，本发明正好填补该项空白。
     猪瘟病毒基因组相对保守，但也包含强毒与弱毒的差异性位点，可以作为强毒与弱毒分子鉴别诊断的靶区域。实验中选用的引物 P3 是根据 CSFV 的高度保守区设计的，引物 P1 是根据强毒的高度保守区设计的，而引物 P2 是根据兔化弱毒的高度保守区设计的，用引物 P1/P3 进行 PCR 反应只能从强毒基因组扩增出一条 Tm 值为 88.5℃目的片段，而以引物 P2/P3 进行 PCR 反应只能从兔化弱毒基因组扩增出一条 TM 值为 85.5℃的目的片段，与此同时， BVDV、 PRV、 PCV、 PPV、 PRRSV 等常见猪源病毒均无扩增条带，表明本试验是特异的。本方法能从 0.065pg 的病毒基因组总 RNA 中扩增到目的片段，具有很高的敏感性。对 24 份猪瘟病料进行 PCR 检测，结果有 10 份属于强毒， 12 份属于弱毒。表明本方法可用于临床应用，同时也证明了本方法的重复性和适应性良好。
     本发明建立的鉴别猪瘟强毒感染与疫苗弱毒的荧光定量 RT-PCR 结合熔解曲线分析方法扩增效率高、线性范围广、检测时间短，熔解曲线分析显示为单特异峰，并且具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点。本发明建立的鉴别猪瘟强毒感染与疫苗弱毒的荧光定量 RT-PCR 结合熔解曲线分析方法扩增效率高、线性范围广、检测时间短，可对猪瘟强毒感染做出快速准确诊断，可将强毒感染猪迅速从免疫猪群中筛选出来，可用于免疫猪群的猪瘟净化检测，并减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。
     本发明的优点
     1、本发明所使用的猪瘟病毒特异引物是对 GenBank 中登录的 Shimen 株、 HCLV 株、 Alfort 株、 Brescia 株等 25 株猪瘟病毒基因组全序列进行比较分析后，在其 E2 蛋白基因高度保守区设计合成 3 条引物： P1(5′ -TTGGCATCATTGCATAAGGG-3′ ) 为猪瘟强毒特异上游引物， P2(5′ -GTGGTCTACACAGGGGGGGT-3′ ) 为猪瘟兔化弱毒疫苗株特异上游引物， P3(5′ -GATTACAACGCCATCTCTGTTACA-3′ ) 为猪瘟病毒共用下游引物。 P1/P3 可特异性扩增猪瘟病毒强毒株，预期扩增产物为 549bp， Tm 值为 89.5±0.5℃； P2/P3 可特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株，预期扩增产物为 164bp， Tm 值为 84.5±0.5℃。用引物 P1/P3 进行 PCR 反应只能从强毒基因组扩增出一条 Tm 值为 88.5℃目的片段，而以引物 P2/P3 进行 PCR 反应只能从兔化弱毒基因组扩增出一条 TM 值为 85.5℃的目的片段，与此同时， BVDV、 PRV、 PCV、 PPV、 PRRSV 等常见猪源病毒均无扩增条带，具有高度特异性，荧光定量 PCR 反应呈现特征性 S 形扩增动力曲线，熔解曲线分析显示出现单特异峰，不与 BVDV 发生交叉反应。
     2、灵敏度高，能从 0.065pg 的病毒基因组总 RNA 中扩增到目的片段，扩增效率高、线性范围广。
     3、检测速度快，所需时间短。整个过程只需两个半小时左右。
     4、不需后续处理，没有电泳、照相、显色等过程。 5、操作简单，自动化程度高。PCR 反应闭管完成，勿需开盖，没有污染。
     6、本发明所使用的荧光染料是 SYBR Green I，该染料可嵌合于 DNA 双链结构的小沟中，当其处于游离状态时，检测不到荧光信号，当其结合于双链 DNA 后荧光强度明显增强，可被荧光探测系统检测到，而且具有方法简便、成本较低等优势。
     附图说明
     图1：引物在猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组中的位置。图2：复合荧光定量 RT-PCR 检测结果。具体实施方式
     首先，应用生物学软件 DNAstar 比对 GenBank 中登录的 Shimen 株、 HCLV 株、 Alfort 株、 Brescia 株等 25 株的猪瘟病毒基因组全序列，找出强毒和弱毒基因组全序列中有差异的地方，以此作为猪瘟强弱毒特异性上游引物的 3’ 端，应用生物学软件 Primer Premier5.0 设计出 3 条引物： P1(5′ -TTGGCATCATTGCATAAGGG-3′ ) 为猪瘟强毒特异上游引物， P2(5′ -GTGGTCTACACAGGGGGGGT-3′ ) 为猪瘟兔化弱毒疫苗株特异上游引物， P3(5′ -GATTACAACGCCATCTCTGTTACA-3′ ) 为猪瘟病毒共用下游引物。 P1/P3 可特异性扩增猪瘟病毒强毒株，预期扩增产物为 549bp， Tm 值为 89.5±0.5℃； P2/P3 可特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株，预期扩增产物为 164bp， Tm 值为 84.5±0.5℃。
     然后，提取病毒总 RNA 进行常规 RT-PCR 反应，接着进行 PCR 反应条件的优化，并进行特异性实验、敏感性实验、重复性实验等。在最优条件下进行荧光定量 RT-PCR 反应和复合荧光定量 RT-PCR 反应，最终成功建立了能够鉴别区分猪瘟野毒与疫苗毒的荧光定量 RT-PCR 方法。与此同时，本方法能以 10 倍系列稀释的 RID50 ＝ 5×104 的细胞苗基因组为模板，进行荧光定量 PCR 扩增，结果表明将模板稀释 10000 倍后仍能得到特异性扩增，并且具有良好的扩增曲线，本方法能从 0.065pg 的病毒基因组总 RNA 中扩增到目的片段，具有很高的敏感性。本方法也具有很高的特异性，应用建立的复合荧光定量 RT-PCR 分别扩增 BVDV、猪伪狂 PRV、 PPV、 PCV、 PRRSV 基因组均无特异性峰值出现。用已经建立的荧光定量 RT-PCR 方法在不同时间、不同地点对每份样品重复检验 3 次，结果一致。
     最后，通过临床病料检测和与我们建立的反转录 - 复合套式聚合酶链式反应 (RT-nPCR) 鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗诊断方法进行比较，对该方法进行临床检测验证。对 24 份猪瘟病料进行 RT-PCR 检测，结果熔解曲线分析显示有 10 份样品属于强毒， 12 份样品属于疫苗毒， 2 份样品结果不明确，与 RT-nPCR 复合率是 91.67％。
     表明本方法可用于临床应用，同时也证明了本方法的稳定性和适应性良好。