筛选醛糖还原酶抑制剂的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102796802 A (43)申请公布日 2012.11.28 CN 102796802 A *CN102796802A* (21)申请号 201210284802.0 (22)申请日 2012.08.10 C12Q 1/26(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 27/62(2006.01) (71)申请人 中国科学院长春应用化学研究所 地址 130022 吉林省长春市朝阳区人民大街 5625 号 (72)发明人 宋凤瑞 侯广月 刘舒 皮子凤 刘志强 刘淑莹 (74)专利代理机构 长春菁华专利商标代理事务 所 22210 代理人 南小。

2、平 (54) 发明名称 筛选醛糖还原酶抑制剂的方法 (57) 摘要 筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 解决了现有 技术中光谱法易受背景干扰， 引起假阳性和假阴 性结果的问题。本发明以葡萄糖为底物， 醛糖还 原酶在 25-37 摄氏度催化葡萄糖生成山梨醇， 用 超高效液相色谱和质谱联用对山梨醇进行定量， 进一步计算出天然产物提取物、 单体及合成类的 醛糖还原酶抑制剂对醛糖还原酶的抑制率。本发 明的筛选方法快速、 准确， 线性方程相关系数达到 0.999， 可用于醛糖还原酶抑制剂的筛选及醛糖还 原酶的动力学研究。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 12 页 附图 4 页 (19)中华。

3、人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 12 页 附图 4 页 1/2 页 2 1. 筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (1) 酶促反应缓冲液的配制 缓冲液是 pH 值为 6.0-6.4 的醋酸铵水溶液 ； (2) 标准品的配制 将山梨醇分别配成浓度为 0.1 微摩尔 / 升、 0.2 微摩尔 / 升、 0.5 微摩尔 / 升、 1 微摩尔 / 升、 2 微摩尔 / 升、 5 微摩尔 / 升、 10 微摩尔 / 升、 20 微摩尔 / 升、 50 微摩尔 / 升的标准品 溶液， 且每个浓度的标准品溶液均含 1 微摩尔 / 升的木糖。

4、醇作为内标 ； (3) 空白样品和样品的酶促反应 空白样品 ： 反应总体积 200 微升， 含有体积为 30 微升的醛糖还原酶、 终浓度 5 毫摩尔 / 升的 2- 巯基乙醇、 终浓度 150 微摩尔 / 升的 NADPH、 终浓度 10 毫摩尔 / 升的底物葡萄糖， 其 余以缓冲液补足 ； 样品 ： 反应总体积 200 微升， 含有体积为 30 微升的醛糖还原酶、 终浓度 5 毫摩尔 / 升的 2- 巯基乙醇、 终浓度 150 微摩尔 / 升的 NADPH、 终浓度 0.1-50 微摩尔 / 升的待测物、 终浓度 10 毫摩尔 / 升的底物葡萄糖， 其余以缓冲液补足 ； 空白样品和样品在25。

5、-40摄氏度反应15-40分钟， 分别加入甲醇或乙腈终止反应， 分别 加入终浓度为 1 微摩尔 / 升的内标木糖醇 ； (4) 标准品、 空白样品和样品的检测 对 (2) 中的标准品进行超高效液相色谱和质谱检测， 从总离子流图中提取山梨醇和木 糖醇的色谱图， 分别积分求峰面积， 以标准品浓度为横坐标， 以山梨醇与木糖醇峰面积比值 为纵坐标， 或以标准品浓度为纵坐标， 以山梨醇与木糖醇的峰面积比值为横坐标， 得到山梨 醇浓度的线性方程 ； 对空白样品、 样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测 ； 所述的超高效液相色谱的检测条件 ： 色谱柱 ： Waters ACQUITY UPLC BEH C18。

6、 2.150 毫米， 1.7 微米 ； 流动相 ： 甲醇和水 ； 等度洗脱程序 ： 0-2 分钟， 20% 甲醇， 所指的百分比均为体积百分比 ； 流速 ： 0.2 毫升 / 分钟 ； 进样量 ： 3 微升 ； 所述的质谱检测条件 ： 毛细管电压 ： 3000 伏特 ； 去溶剂气氮气温度 ： 350 摄氏度 ； 锥孔电压 ： 14 伏特 ； 去溶剂气氮气流速 ： 800 升 / 小时 ； 锥孔气氮气流速 ： 60 升 / 小时 ； 碰撞气氩气流速 ： 0.15 毫升 / 分钟 ； (5) 待测物对醛糖还原酶的抑制率 分别计算空白样品、 样品中山梨醇峰面积和内标木糖醇峰面积的比值， 根据 (4)。

7、 得到 的线性方程， 求得空白样品和样品中山梨醇的浓度， 计算出待测物对醛糖还原酶的抑制率。 2. 根据权利要求 1 所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 其特征在于， 所述的缓冲液 权 利 要 求 书 CN 102796802 A 2 2/2 页 3 的 pH 值为 6.2。 3. 根据权利要求 1 所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 其特征在于， 所述的缓冲液 由醋酸铵和醋酸配制而成， 缓冲液浓度为 100 毫摩尔 / 升。 4. 根据权利要求 1 所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 其特征在于， 步骤 (2) 中， 所 述的标准品溶液是由缓冲液和甲醇配制而成的， 或由缓冲液和乙腈配制而成的。

8、。 5. 根据权利要求 1 所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 其特征在于， 步骤 (3) 中， 所 述的样品中待测物的终浓度为 10-50 微摩尔 / 升。 6. 根据权利要求 1 所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 其特征在于， 步骤 (3) 中， 所 述的空白样品和样品在 37 摄氏度反应 25 分钟。 7. 根据权利要求 1 所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 其特征在于， 步骤 (3) 中， 所 述的甲醇或乙腈的体积为 800-1000 微升。 权 利 要 求 书 CN 102796802 A 3 1/12 页 4 筛选醛糖还原酶抑制剂的方法 技术领域 0001 本发明属于分析化学领。

9、域， 具体涉及一种筛选醛糖还原酶抑制剂的方法。 背景技术 0002 醛糖还原酶主要存在于晶状体、 血管、 神经、 红细胞以及肾脏等组织中， 属于还原 型辅酶 (NADPH) 依赖的醛 - 酮还原酶超家族。它是体内多元醇代谢途径的限速酶， 可以 催化多种亲水性的醛还原为相应的醇。在体内， 醛糖还原酶催化底物葡萄糖还原生成山梨 醇。 0003 在糖尿病病人体内的高血糖生理环境下， 醛糖还原酶被激活引发多元醇通路， 山 梨醇的细胞膜通透性较差造成组织内山梨醇聚积， 引发白内障、 视网膜病变、 肾脏病变等慢 性并发症。目前， 由日本 Ono 制药公司 1992 年上市的依帕司他 (Epalrestat。

10、) 作为醛糖还 原酶抑制剂被批准使用于临床， 用于治疗糖尿病性神经病变， 但是它还没有获得美国食品 药物管理局 (Food and Drug Administration， FDA) 的批准。所以寻找醛糖还原酶抑制剂 和研究醛糖还原酶抑制剂在临床中的应用对于开发新药有着非常重要的意义。 0004 现有醛糖还原酶抑制剂的筛选一般使用紫外光谱法， 其是以 DL- 甘油醛为底 物， 利用辅酶 NAD(P)H 在 340nm 处有特征吸收这一特点， 根据反应体系在 340nm 处吸 光度的变化进行抑制剂的筛选 (Chihiro Nishimura, Takashi Yamaoka, Masakazu 。

11、Mizutani, Kamejiro Yamashita, Tai Akera, Tsuyoshi Tanimoto. Purification and characterization of the recombinant human aldose reductase expressed in baculovirus system. Biochimica et Biophysica Acta, 1991, 1078, 171-178)。 0005 光谱法筛选酶抑制剂使用 DL- 甘油醛为底物， 与人体葡萄糖环境有较大差异， 且 由于在溶液中 NAD(P)H 自然氧化引起吸光度的变化， 使得光。

12、谱法灵敏度低， 且在 340nm 处 吸光度容易受外界干扰， 引起假阳性和假阴性结果 (Arjen R. de Boer, Henk Lingeman, Wilfried M.A. Niessen, Hubertus Irth. Mass spectrometry-based biochemical assays for enzyme-inhibitor screening. Trends in Analytical Chemistry, 2007, 26, 867-883.)。 0006 现代质谱仪的高精确度和灵敏度为我们提供了不受干扰的分子指纹图谱， 串 联质谱高度特异性和精确性揭示待分析。

13、化合物的结构信息， 且质谱方法可以同时检 测和定量多种组分， 近年来在药物筛选中得到了广泛的应用 (Gejing Deng, Gautam Sanyal. Applications of mass spectrometry in early stages of target based drug discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 40, 528-538)。但现有技术中还未有用质谱检测方法筛选醛糖还原酶抑制剂的方法。 0007 酶促反应缓冲液中往往含有不挥发的盐和为保持酶活性稳定的添加物， 盐和。

14、添 加物可能会污染质谱仪的离子源并导致离子化抑制， 样品进入质谱前使用高效液相色谱 进行分离可以避免反应体系中的盐和添加物对检测的影响 (Arjen R. de Boer, Thomas Letzel, Danny A. van Elswijk, Henk Lingeman,Wilfried M. A. Niessen,Hubertus 说 明 书 CN 102796802 A 4 2/12 页 5 Irth. On-Line Coupling of High-Performance Liquid Chromatography to a Continuous-Flow Enzyme Assay。

15、 Based on Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2004, 76, 3155-3161)。 发明内容 0008 为了解决现有筛选醛糖还原酶抑制剂技术中， 光谱法灵敏度低、 容易受外界干扰 的技术问题， 本发明提供一种筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 应用本发明筛选醛糖还原酶 抑制剂精确度高、 特异性好。 0009 本发明提供的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 包括以下步骤 ： 0010 (1) 酶促反应缓冲液的配制 0011 缓冲液为 pH 值为 6.0-6.4 的醋酸铵水溶液 ； 0012 (2) 标准品的配制 001。

16、3 将山梨醇分别配成浓度为 0.1 微摩尔 / 升、 0.2 微摩尔 / 升、 0.5 微摩尔 / 升、 1 微 摩尔 / 升、 2 微摩尔 / 升、 5 微摩尔 / 升、 10 微摩尔 / 升、 20 微摩尔 / 升、 50 微摩尔 / 升的标 准品溶液， 且每个浓度的标准品溶液均含 1 微摩尔 / 升的木糖醇作为内标 ； 0014 (3) 空白样品和样品的酶促反应 0015 空白样品 ： 反应总体积200微升， 含有体积为30微升的醛糖还原酶、 终浓度5毫摩 尔 / 升的 2- 巯基乙醇、 终浓度 150 微摩尔 / 升的 NADPH、 终浓度 10 毫摩尔 / 升的底物葡萄 糖， 其余以。

17、缓冲液补足 ； 0016 样品 ： 反应总体积 200 微升， 含有体积为 30 微升的醛糖还原酶、 终浓度 5 毫摩尔 / 升的 2- 巯基乙醇、 终浓度 150 微摩尔 / 升的 NADPH、 终浓度 0.1-50 微摩尔 / 升的待测物、 终 浓度 10 毫摩尔 / 升的底物葡萄糖， 其余以缓冲液补足 ； 0017 空白样品和样品在25-37摄氏度反应15-40分钟， 分别加入甲醇或乙腈终止反应， 分别加入终浓度为 1 微摩尔 / 升的内标木糖醇 ； 0018 (4) 标准品、 空白样品和样品的检测 0019 对 (2) 中标准品进行超高效液相色谱和质谱检测， 从总离子流图中提取山梨醇和。

18、 木糖醇的色谱图， 分别积分求峰面积， 以标准品浓度为横坐标， 以山梨醇与木糖醇峰面积比 值为纵坐标， 或以标准品浓度为纵坐标， 以山梨醇与木糖醇的峰面积比值为横坐标， 得到山 梨醇浓度的线性方程 ； 0020 对空白样品、 样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测 ； 0021 所述的超高效液相色谱的检测条件 ： 0022 色谱柱 ： Waters ACQUITY UPLC BEH C18 2.150 毫米， 1.7 微米 ； 0023 流动相 ： 甲醇和水 ； 0024 等度洗脱程序 ： 0-2 分钟， 20% 甲醇， 所指的百分比均为体积百分比 ； 0025 流速 ： 0.2 毫升 / 分钟。

19、 ； 0026 进样量 ： 3 微升 ； 0027 所述的质谱检测条件 ： 0028 毛细管电压 ： 3000 伏特 ； 0029 去溶剂气氮气温度 ： 350 摄氏度 ； 说 明 书 CN 102796802 A 5 3/12 页 6 0030 锥孔电压 ： 14 伏特 ； 0031 去溶剂气氮气流速 ： 800 升 / 小时 ； 0032 锥孔气氮气流速 ： 60 升 / 小时 ； 0033 碰撞气氩气流速 ： 0.15 毫升 / 分钟 ； 0034 (5) 待测物对醛糖还原酶的抑制率 0035 分别计算空白样品、 样品中山梨醇峰面积和内标木糖醇峰面积的比值， 根据 (4) 得到的线性方程。

20、， 求得空白样品和样品中山梨醇的浓度， 计算出待测物对醛糖还原酶的抑 制率。 0036 优选的是， 所述的缓冲液的 pH 值为 6.2。 0037 优选的是， 所述的缓冲液由醋酸铵和醋酸配制而成， 缓冲液的浓度为 100 毫摩尔 / 升。 0038 优选的是， 步骤 (2) 中， 所述的标准品溶液是由缓冲液和甲醇配制而成的， 或由缓 冲液和乙腈配制而成的。 0039 优选的是， 步骤 (3) 中， 所述的样品中待测物的终浓度为 10-50 微摩尔 / 升。 0040 优选的是， 步骤 (3) 中， 所述的空白样品和样品在 37 摄氏度反应 25 分钟。 0041 优选的是， 步骤 (3) 中，。

21、 所述的甲醇或乙腈的体积为 800-1000 微升 ； 更有优选的 是， 所述的甲醇或乙腈的体积为 800 微升。 0042 本发明的有益效果 ： 0043 (1) 葡萄糖在醛糖还原酶的作用下， 产生山梨醇， 醛糖还原酶抑制剂抑制醛糖还原 酶的活性， 从而导致酶促反应产物山梨醇生成量减少， 通过产物山梨醇含量的变化可以计 算待测物对醛糖还原酶的抑制率 ； 0044 (2) 本发明筛选醛糖还原酶抑制剂， 样品检测准确、 快速， 线性方程相关系数高达 0.999， 避免了光谱法筛选醛糖还原酶抑制剂使用 DL- 甘油醛为底物， 在溶液中由于 NAD(P) H 自然氧化引起吸光度的变化， 导致灵敏度低。

22、， 且筛选中容易出现的假阳性和假阴性结果的 问题 ； 0045 (3) 本发明可用于分析天然产物提取物、 单体及合成类醛糖还原酶抑制剂对醛糖 还原酶的体外抑制率， 进而筛选出醛糖还原酶抑制剂 ； 本发明还可用于醛糖还原酶的动力 学研究 ( 生物化学 ( 第三版 ) 上册， 351-381， 王镜岩， 朱圣庚， 徐长法， 主编 )。 附图说明 0046 图 1 为实施例 1 中 10 微摩尔 / 升的标准品山梨醇和内标木糖醇的的总离子流色 谱图 ； 0047 图 2 为实施例 1 中内标木糖醇的提取色谱图 ； 0048 图 3 为实施例 1 中 10 微摩尔 / 升的标准品山梨醇的的提取色谱图 。

23、； 0049 图 4 为实施例 1 中不同浓度山梨醇标准品的标准曲线 ； 0050 图 5 为实施例 1 中空白样品中内标木糖醇的提取色谱图 ； 0051 图 6 为实施例 1 中空白样品中山梨醇的提取色谱图 ； 0052 图 7 为实施例 1 中样品中内标木糖醇的提取色谱图 ； 0053 图 8 为实施例 1 中样品中山梨醇的提取色谱图 ； 说 明 书 CN 102796802 A 6 4/12 页 7 0054 图 9 为实施例 2 中样品中内标木糖醇的提取色谱图 ； 0055 图 10 为实施例 2 中样品中山梨醇的提取色谱图 ； 0056 图 11 为实施例 3 中样品中内标木糖醇的提。

24、取色谱图 ； 0057 图 12 为实施例 3 中样品中山梨醇的提取色谱图 ； 0058 图 13 为实施例 4 中样品中内标木糖醇的提取色谱图 ； 0059 图 14 为实施例 4 中样品中山梨醇的提取色谱图。 具体实施方式 0060 本发明提供的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 包括以下步骤 ： 0061 (1) 酶促反应缓冲液的配制 0062 缓冲液为醋酸铵溶液， 用醋酸调节 pH 值为 6.0-6.4， 缓冲液浓度为 100 毫摩尔 / 升 ； 0063 (2) 标准品的配制 0064 将山梨醇分别配成浓度为 0.1 微摩尔 / 升、 0.2 微摩尔 / 升、 0.5 微摩尔 / 升、 1。

25、 微 摩尔 / 升、 2 微摩尔 / 升、 5 微摩尔 / 升、 10 微摩尔 / 升、 20 微摩尔 / 升、 50 微摩尔 / 升的标 准品溶液， 且每个浓度的标准品溶液均含 1 微摩尔 / 升的木糖醇作为内标 ； 0065 (3) 空白样品和样品的酶促反应 0066 空白样品 ： 反应总体积200微升， 含有体积为30微升的醛糖还原酶、 终浓度5毫摩 尔 / 升的 2- 巯基乙醇、 终浓度 150 微摩尔 / 升的 NADPH、 终浓度 10 毫摩尔 / 升的底物葡萄 糖， 其余以缓冲液补足 ； 0067 样品 ： 反应总体积 200 微升， 含有体积为 30 微升的醛糖还原酶、 终浓度。

26、 5 毫摩尔 / 升的 2- 巯基乙醇、 终浓度 150 微摩尔 / 升的 NADPH、 终浓度 0.1-50 微摩尔 / 升的待测物、 终 浓度 10 毫摩尔 / 升的底物葡萄糖， 其余以缓冲液补足 ； 0068 空白样品和样品在 25-40 摄氏度反应 15-40 分钟， 分别加入 800-1000 微升的甲醇 或乙腈终止反应， 分别加入终浓度为 1 微摩尔 / 升的内标木糖醇 ； 0069 空白样品和样品中的酶是同一种酶 ； 0070 (4) 标准品、 空白样品和样品的检测 0071 对 (2) 中的标准品进行超高效液相色谱和质谱检测， 从总离子流图中提取山梨醇 和木糖醇的色谱图， 分别。

27、积分求峰面积， 以所述的标准品浓度为横坐标， 以山梨醇与木糖 醇峰面积比值为纵坐标， 或以标准品浓度为纵坐标， 以山梨醇与木糖醇的峰面积比值为横 坐标， 在所述的标准品浓度为 0.1 微摩尔 / 升至 50 微摩尔 / 升范围内， 使用仪器的软件 MassLynx4.1 或微软公司 (Microsoft) 的 Excel 软件得到山梨醇浓度的线性方程 ： 0072 y=ax+b 0073 式中， y 为所述的标准品山梨醇与内标木糖醇峰面积比值 ； x 为标准品山梨醇的浓 度， 量纲为微摩尔 / 升 ； a、 b 为计算得到的常数 ； 同时计算得到相关系数 R2； 0074 对空白样品、 样品溶。

28、液进行超高效液相色谱和质谱检测 ； 0075 所述的超高效液相色谱的检测条件 ： 0076 超高效液相色谱仪 ： Waters ACQUITY ； 0077 色谱柱 ： Waters ACQUITY UPLC BEH C18 2.150 毫米， 1.7 微米 ； 说 明 书 CN 102796802 A 7 5/12 页 8 0078 流动相 ： 甲醇和水 ； 0079 等度洗脱程序 ： 0-2 分钟， 20% 甲醇， 所指的百分比均为体积百分比 ； 0080 流速 ： 0.2 毫升 / 分钟 ； 0081 进样量 ： 3 微升 ； 0082 所述的质谱检测条件 ： 0083 质谱仪 ： Wa。

29、ters Xevo TQ ； 0084 离子源 ： 电喷雾电离源 (ESI) 正离子模式 ； 0085 毛细管电压 ： 3000 伏特 ； 0086 锥孔电压 ： 14 伏特 ； 0087 去溶剂气氮气温度 ： 350 摄氏度 ； 0088 去溶剂气氮气流速 ： 800 升 / 小时 ； 0089 锥孔气氮气流速 ： 60 升 / 小时 ； 0090 碰撞气氩气流速 ： 0.15 毫升 / 分钟 ； 0091 所述质谱条件在检测山梨醇和内标木糖醇时是相同的 ； 0092 碎裂能量和选择的碎片离子在检测山梨醇和内标木糖醇时是不同的 ： 检测山梨 醇时碎裂能量是 12， 碎片离子是 68.94 ；。

30、 检测内标木糖醇时碎裂能量是 10， 碎片离子是 56.95 ； 0093 (5) 待测物对醛糖还原酶的抑制率 0094 分别计算空白样品、 样品中山梨醇峰面积和内标木糖醇峰面积， 得到空白样品、 样 品中山梨醇峰面积和内标木糖醇峰面积的比值， 根据 (4) 得到的线性方程， 求得空白样品 和样品中山梨醇的浓度， 待测物对醛糖还原酶的抑制率按照以下公式计算 ： 0095 I样品 = (1-C样品/ C空白) 100% 0096 式中， I样品 为待测物对醛糖还原酶的抑制率 ； C样品为根据线性方程求得的样品中 山梨醇浓度， 量纲为微摩尔 / 升 ； C空白为根据线性方程求得的空白样品中山梨醇浓。

31、度， 量纲 为微摩尔 / 升。 0097 优选的是， 所述的缓冲液的 pH 值为 6.2。 0098 优选的是， 步骤 (2) 中， 所述的标准品溶液是由缓冲液和甲醇配制而成的， 或由缓 冲液和乙腈配制而成的。 0099 优选的是， 步骤 (3) 中， 所述的样品中待测物的终浓度为 10-50 微摩尔 / 升。 0100 优选的是， 步骤 (3) 中， 所述的空白样品和样品在 37 摄氏度反应 25 分钟。 0101 优选的是， 步骤 (3) 中， 所述的甲醇或乙腈的体积为 800 微升。 0102 根据步骤 (5) 计算出的待测物的抑制率， 可以筛选醛糖还原酶抑制剂 ： 抑制率高， 说明待测。

32、物对醛糖还原酶的抑制效果好， 可以作为醛糖还原酶抑制剂 ； 抑制率低， 说明待测 物对醛糖还原酶的抑制效果差， 不适合作为醛糖还原酶抑制剂。 0103 本发明的醛糖还原酶可以是商购， 也可以是实验室制备， 其制备方法为 ： 4 条件下进行， 取新鲜牛晶状体， 经匀浆、 离心、 盐析、 超滤后得到酶的粗提取液， 分装， 储 藏于 -80冰箱中备用 (Anjana Basak Halder, M. James C. Crabbe. Bovine lens aldehyde reductase (aldose reductase). Biochemical Journal, 1984, 219, 3。

33、3-39)。 0104 本发明的其他材料均可以通过商购途径获得。 说 明 书 CN 102796802 A 8 6/12 页 9 0105 为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案， 下面结合具体实施例对本发 明作进一步详细描述。 0106 实施例 1 0107 结合图 1-8 说明实施例 1 0108 筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 步骤如下 ： 0109 (1) 酶促反应缓冲液的配制 0110 缓冲液为醋酸铵溶液， 用醋酸调 pH 值为 6.2， 缓冲液浓度为 100 毫摩尔 / 升 ； 0111 (2) 标准品的配制 0112 用缓冲液和甲醇将山梨醇分别配成浓度为 0.1 微摩尔 / 。

34、升、 0.2 微摩尔 / 升、 0.5 微摩尔 / 升、 1 微摩尔 / 升、 2 微摩尔 / 升、 5 微摩尔 / 升、 10 微摩尔 / 升、 20 微摩尔 / 升、 50 微摩尔 / 升的标准溶液， 且每个浓度的标准品溶液均含 1 微摩尔 / 升的木糖醇作为内标 ； 0113 (3) 空白样品和样品的酶促反应 0114 空白样品 ： 反应总体积200微升， 含有体积为30微升的醛糖还原酶、 终浓度5毫摩 尔 / 升的 2- 巯基乙醇、 终浓度 150 微摩尔 / 升的 NADPH、 终浓度 10 毫摩尔 / 升的底物葡萄 糖， 其余以缓冲液补足 ； 0115 样品 ： 反应总体积 200。

35、 微升， 含有体积为 30 微升的醛糖还原酶、 终浓度 5 毫摩尔 / 升的 2- 巯基乙醇、 终浓度 150 微摩尔 / 升的 NADPH、 终浓度 10 微摩尔 / 升的依帕司他、 终浓 度 10 毫摩尔 / 升的底物葡萄糖， 其余以缓冲液补足 ； 0116 37 摄氏度反应 25 分钟， 分别加入 800 微升甲醇终止反应， 分别加入终浓度为 1 微 摩尔 / 升的内标木糖醇 ； 0117 (4) 标准品、 空白样品和样品的检测 0118 对标准品检测 ： 采用木糖醇为内标， 以内标法定量， 对 (2) 中的标准品进行超高 效液相色谱和质谱检测， 从总离子流图中提取山梨醇 m/z=68.。

36、94 和木糖醇 m/z=56.95 的色 谱图， 分别积分求峰面积， 以所述的标准品浓度为横坐标， 以山梨醇与木糖醇峰面积比值为 纵坐标， 在所述的标准品浓度为 0.1 微摩尔 / 升至 50 微摩尔 / 升范围内， 使用微软公司 (Microsoft) 的 Excel 软件得到山梨醇浓度的线性方程 ： 0119 y=0.7221x+0.1992 0120 式中， y 为所述的标准品山梨醇与内标木糖醇峰面积比值 ； x 为标准品山梨醇的浓 度， 量纲为微摩尔 / 升 ； 计算得到相关系数 R2=0.9998 ； 0121 对空白样品、 样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测 ； 0122 所述的。

37、超高效液相色谱的检测条件 ： 0123 超高效液相色谱仪 ： Waters ACQUITY ； 0124 色谱柱 ： Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (2.150 毫米， 1.7 微米 ) ； 0125 流动相 ： 甲醇 (A) 和水 (B) ； 0126 等度洗脱程序 ： 0-2 分钟， 20%A， 所指的百分比均为体积百分比 ； 0127 流速 ： 0.2 毫升 / 分钟 ； 0128 进样量 ： 3 微升 ； 0129 所述的质谱检测条件 ： 0130 质谱仪 ： Waters Xevo TQ ； 说 明 书 CN 102796802 A 9 7/12 页 10 。

38、0131 离子源 ： 电喷雾电离源 (ESI) 正离子模式 ； 0132 毛细管电压 ： 3000 伏特 ； 0133 去溶剂气氮气温度 ： 350 摄氏度 ； 0134 锥孔电压 ： 14 伏特 ； 0135 去溶剂气氮气流速 ： 800 升 / 小时 ； 0136 锥孔气氮气流速 ： 60 升 / 小时 ； 0137 碰撞气氩气流速 ： 0.15 毫升 / 分钟 ； 0138 第一个四极杆的低端分辨率为 ： 2.82 ； 高端分辨率为 15.2 ； 离子能量为 ： 0.4 ； 0139 第二个四极杆的低端分辨率为 ： 2.80 ； 高端分辨率为 14.8 ； 离子能量为 ： 0.5 ； 0。

39、140 以上所述质谱条件在检测山梨醇和内标木糖醇时是相同的 ； 0141 碎裂能量和选择的碎片离子在检测山梨醇和内标木糖醇时是不同的 ： 检测山梨 醇时碎裂能量是 12， 碎片离子是 68.94 ； 检测内标木糖醇时碎裂能量是 10， 碎片离子是 56.95 ； 0142 (5) 待测物对醛糖还原酶的抑制率 0143 分别计算空白样品、 样品中山梨醇和内标木糖醇的峰面积比值， 根据 (4) 得到的 线性方程， 求得空白样品和样品中山梨醇浓度， 待测物对醛糖还原酶的抑制率按照以下公 式计算 ： 0144 I样品 =(1-C样品/ C空白) 100% 0145 式中， I样品为待测物对醛糖还原酶的。

40、抑制率 ； C样品为根据线性方程求得的样品中 山梨醇浓度， 量纲为微摩尔 / 升 ； C空白为根据线性方程求得的空白样品中山梨醇浓度， 量纲 为微摩尔 / 升。 0146 图 1 为实施例 1 中 10 微摩尔 / 升的标准品山梨醇和 1 微摩尔 / 升的内标木糖醇 的总离子流色谱图， 信号强度为 4.54104； 0147 图 2 为实施例 1 中 1 微摩尔 / 升的内标木糖醇的提取色谱图， 信号强度为 2.68104； 0148 图 3 为实施例 1 中 10 微摩尔 / 升的标准品山梨醇的提取色谱图， 信号强度为 1.97105； 0149 图 4 为 实 施 例 1 中 不 同 浓 。

41、度 山 梨 醇 标 准 品 的 标 准 曲 线， 标 准 曲 线 为 y=0.7221x+0.1992， R2=0.9998 ； 0150 图 5 为实施例 1 中空白样品中 1 微摩尔 / 升的内标木糖醇的提取色谱图， 信号强 度为 2.87104； 0151 图 6 为实施例 1 中空白样品中山梨醇的提取色谱图， 信号强度为 5.00104； 0152 图 7 为实施例 1 中样品中 1 微摩尔 / 升的内标木糖醇的提取色谱图， 信号强度为 3.48104； 0153 图 8 为实施例 1 中样品中山梨醇的提取色谱图， 信号强度为 6.32103。 0154 由图 1-8 经计算得到 10。

42、 微摩尔 / 升依帕司他对醛糖还原酶的抑制率为 90%。 0155 实施例 2 0156 结合图 9、 图 10 说明实施例 2 0157 筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 步骤如下 ： 说 明 书 CN 102796802 A 10 8/12 页 11 0158 (1) 酶促反应缓冲液的配制 0159 缓冲液为醋酸铵溶液， 用醋酸调 pH 值为 6.2， 浓度为 100 毫摩尔 / 升 ； 0160 (2) 标准品的配制 0161 用缓冲液和乙腈将标准品分别配成浓度为 0.1 微摩尔 / 升、 0.2 微摩尔 / 升、 0.5 微摩尔 / 升、 1 微摩尔 / 升、 2 微摩尔 / 升、 5 微。

43、摩尔 / 升、 10 微摩尔 / 升、 20 微摩尔 / 升、 50 微摩尔 / 升的标准溶液， 且每个浓度的标准品溶液均含 1 微摩尔 / 升的木糖醇作为内标 ； 0162 (3) 空白样品和样品的酶促反应 0163 空白样品 ： 反应总体积200微升， 含有体积为30微升的醛糖还原酶、 终浓度5毫摩 尔 / 升的 2- 巯基乙醇、 终浓度 150 微摩尔 / 升的 NADPH、 终浓度 10 毫摩尔 / 升的底物葡萄 糖， 其余以缓冲液补足 ； 0164 样品 ： 反应总体积 200 微升， 含有体积为 30 微升的醛糖还原酶、 终浓度 5 毫摩尔 / 升的 2- 巯基乙醇、 终浓度 15。

44、0 微摩尔 /升的 NADPH、 终浓度 10 微摩尔 / 升的槲皮苷标准品、 终浓度 10 毫摩尔 / 升的底物葡萄糖， 其余以缓冲液补足 ； 0165 37 摄氏度反应 30 分钟， 分别加入 800 微升乙腈终止反应， 分别加入终浓度为 1 微 摩尔 / 升的内标木糖醇 ； 0166 其余的同实施例 1。 0167 图 9 为实施例 2 中样品中 1 微摩尔 / 升的内标木糖醇的提取色谱图， 信号强度为 3.46104； 0168 图 10 为实施例 2 中样品中山梨醇的提取色谱图， 信号强度为 2.79104。 0169 按照实施例 1 的检测步骤检测并计算得到 10 微摩尔 / 升槲。

45、皮苷标准品对醛糖还 原酶的抑制率为 54%。 0170 实施例 3 0171 结合图 11、 图 12 说明实施例 3 0172 筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 步骤如下 ： 0173 (1) 酶促反应缓冲液的配制 0174 缓冲液为醋酸铵溶液， 用醋酸调 pH 值为 6.2， 浓度为 100 毫摩尔 / 升 ； 0175 (2) 标准品的配制 0176 用缓冲液和乙腈将标准品分别配成浓度为 0.1 微摩尔 / 升、 0.2 微摩尔 / 升、 0.5 微摩尔 / 升、 1 微摩尔 / 升、 2 微摩尔 / 升、 5 微摩尔 / 升、 10 微摩尔 / 升、 20 微摩尔 / 升、 50 微摩尔 。

46、/ 升的标准溶液， 且每个浓度的标准品溶液均含 1 微摩尔 / 升的木糖醇作为内标 ； 0177 (3) 空白样品和样品的酶促反应 0178 空白样品 ： 反应总体积200微升， 含有体积为30微升的醛糖还原酶、 终浓度5毫摩 尔 / 升的 2- 巯基乙醇、 终浓度 150 微摩尔 / 升的 NADPH、 终浓度 10 毫摩尔 / 升的底物葡萄 糖， 其余以缓冲液补足 ； 0179 样品 ： 反应总体积 200 微升， 含有体积为 30 微升的醛糖还原酶、 终浓度 5 毫摩尔 / 升的 2- 巯基乙醇、 终浓度 150 微摩尔 / 升的 NADPH、 终浓度 40 微摩尔 / 升的芦丁标准品、。

47、 终 浓度 10 毫摩尔 / 升的底物葡萄糖， 其余以缓冲液补足 ； 0180 37 摄氏度反应 25 分钟， 分别加入 800 微升乙腈终止反应， 分别加入终浓度为 1 微 摩尔 / 升的内标木糖醇 ； 说 明 书 CN 102796802 A 11 9/12 页 12 0181 其余的同实施例 1。 0182 图 11 为实施例 3 中样品中 1 微摩尔 / 升的内标木糖醇的提取色谱图， 信号强度为 3.04104； 0183 图 12 为实施例 3 中样品山梨醇的提取色谱图， 信号强度为 2.19104。 0184 按照实施例 1 的检测步骤检测并计算得到 40 微摩尔 / 升芦丁标准品。

48、对醛糖还原 酶的抑制率为 59%。 0185 实施例 4 0186 结合图 13、 图 14 说明实施例 4 0187 筛选醛糖还原酶抑制剂的方法， 步骤如下 ： 0188 (1) 酶促反应缓冲液的配制 0189 缓冲液为醋酸铵溶液， 用醋酸调 pH 值为 6.2， 浓度为 100 毫摩尔 / 升 ； 0190 (2) 标准品的配制 0191 用缓冲液和甲醇将标准品分别配成浓度为 0.1 微摩尔 / 升、 0.2 微摩尔 / 升、 0.5 微摩尔 / 升、 1 微摩尔 / 升、 2 微摩尔 / 升、 5 微摩尔 / 升、 10 微摩尔 / 升、 20 微摩尔 / 升、 50 微摩尔 / 升的标准溶液， 且每个浓度的标准品溶液均含 1 微摩尔 / 升的木糖醇作为内标 ； 0192 (3) 空白样品和样品的酶促反应 0193 空白样品 ： 反应总体积200微升， 含有体积为30微升的醛糖还原酶、 终浓度5毫摩 尔 / 升的 2- 巯基乙醇、 终浓度 150 微摩尔 / 升的 NADPH、 终浓度 10 毫摩尔 / 升的底物葡萄 糖， 其余以缓冲液补足 ； 0194 样品。