通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103031362 A (43)申请公布日 2013.04.10 CN 103031362 A *CN103031362A* (21)申请号 201110290872.2 (22)申请日 2011.09.29 C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 成都灵动生物技术有限公司 地址 610041 四川省成都市高新区高朋大道 5 号 A 座 501 (72)发明人 刘畅 (54) 发明名称 通用 ACTB 基因荧光定量聚合酶链反应试剂 盒 (57) 摘要 本发明涉及一种能够定量检测人、 大鼠、 小 鼠等多个物种的 AC。

2、TB 基因表达的荧光定量体外 扩增检测试剂盒 ； 其中包含 ACTB 特异的引物、 探 针和耐热 DNA 聚合酶、 dNTPs、 模板 DNA、 镁离子、 PCR 缓冲液、 超纯水等组成的 PCR 扩增缓冲反应 体系， 以及标准 ACTB 模板 ； 其中所用引物和探 针序列分别为 ： 上游引物 ： SEQ ID NO 1 ； 下游引 物 ： SEQ ID NO 2 ； 探针序列 ： SEQ ID NO 3 ； 引物 和探针浓度为每条 0.25umol/L、 Taq DNA 聚合酶 1.5U/50ul、 dNTPs 底物 0.3mmol/L、 模板 cDNA 若 干、 Mg+2.5mmol/L、。

3、 缓冲液1XPCR ； 标准ACTB模板 序列为 ： SEQ ID NO 4。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 1/1 页 2 1. 一种操作简单、 能够有效定量扩增检测人、 大鼠、 小鼠等多个物种的 ACTB 基因表达 的DNA荧光定量体外扩增检测试剂盒 ； 其中包含ACTB特异的引物、 探针和耐热DNA聚合酶、 dNTPs、 模板 DNA、 镁离子、 PCR 缓冲液、 超纯水等组成的 PCR 扩增缓冲反应体系， 以及标准 ACTB 模板。

4、。 2. 根据权利要求 1 所述的通用 ACTB 基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒， 其特征在于 ： 所用引物和探针序列分别为 ： 上游引物 P1 ： 5 -AGA TGA CCC AGA TCA TGT TTG-3 (SEQ IDNO ： 1) ； 下游引物 P2 ： 5 -CCA CCT CCA GAC GCA GGA T-3 (SEQ ID NO ： 2) ； TaqMan 探针 序列 ： 5 -FAM-CAC CCA CAC TGT GCC CATC-TAMRA-3 (SEQ ID NO ： 3)。 3. 根据权利要求 1 所述的通用 ACTB 基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒， 其特征在。

5、于 ： 特异的引物和探针每条0.25umol/L、 Taq DNA聚合酶1.5/50ul、 dNTPs底物0.3mmol/L、 模板 eDNA 若干、 Mg+2.5mmol/L、 缓冲液 1XPCR ； 其中 1XPCR 缓冲液包括 50mmol/L KCl、 10mmol/L Tris.HCl PH8.3、 0.01明胶。 4. 根据权利要求 1 所述的通用 ACTB 基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒， 其特征在于 ： 标准 ACTB 基因模板序列为 ： 5 -AGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTA GCCATCCAGGCTGTGT。

6、TGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACTGGCATTGTGATGGACTCCGGAGACGGGGTCAC CCACACTGTGCCCATCTATGA GGGTTACGCGCTCCCTCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGG-3 (SEQ ID NO ： 4) ： 其浓度分别为 10E+8/ML、 10E+7/ML、 10E+6/ML、 10E+5/ML、 10E+4/ML。 权 利 要 求 书 CN 103031362 A 2 1/3 页 3 通用 ACTB 基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种操作简单、 高特异性和能够定量检测人、 大。

7、鼠、 小鼠等多个物种 ACTB(actin， beta) 基因表达的 DNA 体外扩增试剂盒， 属于分子生物学检测技术中的荧光定 量 DNA 体外扩增技术领域。 背景技术 0002 在现有的DNA体外扩增技术中， 聚合酶链反应(polymerase chain reaction， PCR) 是最主要的也是很有效的常用技术。 该技术系将耐热DAN聚合酶、 特异引物、 dNTPs底物、 模 板 DNA、 镁离子等放在同一个缓冲反应体系中， 进行反复高温、 低温、 中温的热循环， 以使模 板 DNA 变性、 引物与模板复性、 引物沿模板 DNA 延伸反复进行， 而达到靶 DNA 片段在体外呈 2n倍。

8、扩增 ( 其中 n 为热循环次数 )。荧光定量 PCR 技术则在 PCR 反应的基础上， 耦合以实时 荧光检测和计算机分析技术， 即在PCR反应体系中加入能够反映DNA扩增情况的荧光物质， 并通过检测经过每个热循环后的荧光变化情况来实时探测 DNA 的扩增情况， 并通过标准曲 线对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。 TaqMan探针技术是目前最常用的和应用最 成功的荧光定量 PCR 技术。TaqMan 探针是一条能够与待扩增检测的靶 DNA 序列互补配对 的寡核苷酸， 其 5 端标记了一个荧光报告基团 (R)， 其 3 端标记了一个荧光淬灭基团 (Q)。 当这条探针处于游离状态或者没有发。

9、生反应时， R 所产生的荧光将被 Q 吸收或淬灭 ； 在 PCR 反应中， 该探针可与 PCR 目标基因发生杂交， 并由 TaqDNA 聚合酶的依赖于聚合的外切活性 切断， 使得 R 与 Q 分离， 游离的 R 发出荧光可被荧光检测装置检测。随着 PCR 反应的进行， 被切断的荧光报告基团 (R) 与 PCR 产物相对应的增加。因此， 根据荧光报告基团 (R) 产生 的荧光信号的强弱， 即可测量出 PCR 反应产物的数量。再依据标准曲线即可对每个反应的 起始 DNA 模板数进行定量测定。 0003 在荧光定量 PCR 检测中， 经常遇到检测基因相对表达量的情况， 其中内对照基因 常常选择 AC。

10、TB。有鉴于此， 我们通过大量的实验研究优选出了一套能够有效检测人、 大鼠、 小鼠等多个物种 ACTB 基因表达的引物和探针， 优化出了其 PCR 反应的条件， 并组装成通用 ACTB 基因表达检测荧光定量聚合酶链反应试剂盒。 发明内容 0004 本发明的技术方案是 ： 首先获得人、 大鼠、 小鼠的 ACTB 标准序列， 进行 BLAST 同源 性比较， 再根据比较结果设计相应的引物和探针， 最后将引物、 探针加入含有耐热 DNA 聚合 酶、 dNTPs、 模板 cDNA、 镁离子、 PCR 缓冲液、 超纯水等组成的 PCR 扩增缓冲反应体系中， 在热 循环仪上进行高温、 低温、 中温的反复热。

11、循环 ； 并在中温时检测和记录荧光值。 0005 所优选出的引物和探针的序列分别如下 ： 0006 上游引物 P1 ： 5 -AGA TGA CCC AGA TCA TGT TTG-3 (SEQ ID NO ： 1) ； 0007 下游引物 P2 ： 5 -CCA CCT CCA GAC GCA GGA T-3 (SEQ ID NO ： 2) ； 0008 TaqMan 探针序列 ： 5 -FAM-CAC CCA CAC TGT GCC CATC-TAMRA-3 (SEQ ID NO ： 3) 说 明 书 CN 103031362 A 3 2/3 页 4 0009 所优化出的 PCR 扩增缓冲。

12、反应体系是由引物、 探针、 耐热 DNA 聚合酶、 dNTPs、 模 板 DNA、 Mg+、 PCR 缓冲液、 超纯水等组成的， 各个成分的终浓度分别如下 ： 特异的引物和探 针每条 0.25umol/L、 Taq DNA 聚合酶 1.5/50ul、 dNTPs 底物 0.3mmol/L、 模板 cDNA 若干、 Mg+2.5mmol/L、 缓冲液 1XPCR ； 其中 1XPCR 缓冲液包括 50mmol/L KCl、 10mmol/L Tris. HClPH8.3、 0.01明胶。 0010 该ACTB荧光定量PCR由于引物和探针在人、 大鼠、 小鼠中完全同源， 所以能够有效 扩增来源于这。

13、些物种的 ACTB 基因， 从而检测 ACTB 基因的表达量。 0011 根据上述研究结果， 将上述引物、 探针和其他 PCR 试剂混合后分装到 PCR 扩增管 中， 并配以 10E+8/ML、 10E+7/ML、 10E+6/ML、 10E+5/ML、 10E+4/ML 等系列稀释度的标准 ACTB 基因模板组装成通用 ACTB 基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒。标准 ACTB 基因模板的序列 为 ： 0012 5 -AGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTGT TGTCCCTGTATGCCTCTGGTCG。

14、TACCACTGGCATTGTGATGGACTCCGGAGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATC TATGAGGGTTACGCGCTCCCTCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGG-3 (SEQID NO ： 4) 具体实施方式 ： 0013 1、 在 DNA 合成仪上人工合成下述引物和探针各 20D， 并用 TE 缓冲液 ( 其中 含 10mmol/LTris， 1 含 10mmol/L EDTA) 稀释至 10umol/L。其中上游引物 P1 序列为 ： 5 -AGA TGA CCCAGA TCA TGT TTG-3 (SEQ ID NO ： 1) ； 下游引物 P。

15、2 ： 5 -CCA CCT CCA GAC GCA GGA T-3 (SEQ ID NO ： 2) ； TaqMan 探针序列 ： 5 -FAM-CAC CCA CAC TGT GCC CATC-TAMRA-3 (SEQID NO ： 3) 0014 2、 取 各 引 物、 探 针 各 37.5ul， 25mmol/L dNTPs 18ul， 、 25mmol/L MgCl2150ul， 10XPCR 反应缓冲液 150ul， 5U/ul Taq DNA 聚合酶 9ul， 超纯水 990.5ul 加入到 2ml 的干净 无菌试管中， 充分混匀， 配制 1400ul FQ-PCR 反应预混液。。

16、 0015 3、 将预混液成按46.7ul/管分装成30小管(用200ul PCR扩增管)， 再配以10E+8/ ML、 10E+7/ML、 10E+6/ML、 10E+5/ML、 10E+4/ML等系列稀释度的标准ACTB基因模板5管， 每管 各 20ul， 即组装成了通用 ACTB 基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒。其中标准 ACTB 基因模 板的序列为 ： 0016 5 -AGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTG TTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACTGGCATTGTGATGGA。

17、CTCCGGAGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCA TCTATGA GGGTTACGCGCTCCCTCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGG-3 (SEQ ID NO ： 4) 0017 4、 FQ-PCR 扩增 0018 每个装有 46.7ulPCR 反应预混液的反应管中分别加入 3.3ul 待测 cDNA， 水或标准 ACTB 基因模板， 震荡混匀， 瞬时离心后上机到荧光定量 PCR 仪 ( 如 PE9600) 中， 96下变性 5 分钟， 然后按 9620 秒， 53 30 秒， 60 30 秒热循环 45 次， 并在 60时检测记录荧光信 号 ； PCR 反应结。

18、束后， 读取各个反应的 Ct 值用以定量分析 ； 同时于 2.5琼脂糖凝胶行 PCR 产物电泳， 溴乙锭染色， GelDoc1000 下观察， 灰度扫描分析记录各 PCR 反应的结果。4. 结果 0019 在30个标本的FQ-PCR反应中， 经电泳检测， 加入待测标本和标准品的反应产物中 均检测到了预期大小的 192bp 左右的 PCR 产物条带， 而未加 DNA 标本的阴性对照未见相应 说 明 书 CN 103031362 A 4 3/3 页 5 扩增产物。加入标准 ACTB 基因模板和待测标本的反应均获得了 S 形的扩增曲线， 加入标 准 ACTB 基因模板的 Ct 值与加入模板拷贝数的对数呈线性关系， 可以拟合成一条直线， 斜 率 -3.35， 截距为 41.3， 相关系数 9.9， 说明该反应体系和反应条件均符合精确定量研究的 要求。 说 明 书 CN 103031362 A 5 1/2 页 6 0001 序 列 表 CN 103031362 A 6 2/2 页 7 0002 序 列 表 CN 103031362 A 7 。