一种小金牛草的检测方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102854283 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102854283 A *CN102854283A* (21)申请号 201210337653.X (22)申请日 2012.09.12 G01N 30/90(2006.01) G01N 30/36(2006.01) (71)申请人 广州白云山敬修堂药业股份有限公 司 地址 510000 广东省广州市荔湾区人民南路 179 号 (72)发明人 严志标 彭红英 陆颂规 曾利杰 陈晓坚 程君璐 刘敏珊 (74)专利代理机构 广州市越秀区哲力专利商标 事务所 ( 普通合伙 ) 44288 代理人 汤喜友。

2、 (54) 发明名称 一种小金牛草的检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种小金牛草的检测方法， 运 用薄层色谱法对小金牛草中有效成分芒果苷进行 定性测定， 运用高效液相色谱法对小金牛草中有 效成分芒果苷进行定量测定， 或同时运用这两种 方法。通过上述检测方法能够很好地控制小金牛 草的质量， 可用于小金牛草药材真伪及品质优劣 的评价， 保证其质量的稳定、 均一、 可控。 同时该检 测方法还具有操作方便、 准确度好、 专属性强的特 点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明。

3、书 8 页 附图 3 页 1/2 页 2 1. 一种小金牛草的检测方法， 其特征在于， 以芒果苷作为指标成分， 用薄层色谱法对芒 果苷进行定性测定， 按以下步骤进行 ： 1） 供试品溶液的制备 ： a、 取小金牛草粉末适量， 加甲醇或乙醇作为提取溶剂， 提取溶剂的加入量与小金牛草 粉末取样量的体积质量比， 以 ml/g 计为 50:1， 经超声处理 15 分钟 90 分钟或加热回流提 取 20 分钟 180 分钟， 得到提取溶液 ； b、 取步骤 a 得到的提取溶液， 经滤过、 滤液蒸干、 残渣用甲醇或乙醇使溶解， 作为供试 品溶液 ； 或取步骤 a 得到的提取溶液， 经静置后， 取上清液即可。

4、作为供试品溶液 ； 2) 对照药材溶液的制备 ： 取对照药材粉末， 具体操作同步骤 a 制成对照药材溶液 ； 3) 对照品溶液的制备 ： 取芒果苷对照品， 加甲醇制成每1ml含0.1mg芒果苷的溶液， 作 为对照品溶液 ； 4) 鉴别 ： 吸取供试品溶液、 对照药材溶液和对照品溶液， 分别点于同一硅胶 G 薄层板 上， 以展开剂展开， 取出， 晾干， 喷以显色剂， 供试品色谱中， 在与对照药材色谱和对照品色 谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点 ； 其中， 所述展开剂是体积比为 5 4:3:1:1 的乙酸乙 酯 - 丁酮 - 甲酸 - 水或体积比为 8 10:1:1 的乙酸乙酯 - 甲酸 - 水。

5、 ； 显色剂是浓度为 5% 三氯化铁乙醇溶液。 2. 如权利要求 1 所述的一种小金牛草的检测方法， 其特征在于 ： 在步骤 1) 中， 当所述 提取溶剂是浓度为 40%-100% 的甲醇或浓度为 40% 100% 的乙醇溶液时， 取步骤 a 得到的 提取溶液， 经滤过、 滤液蒸干、 残渣用 10ml 甲醇或乙醇使溶解， 作为供试品溶液。 3. 如权利要求 1 所述的一种小金牛草的检测方法， 其特征在于 ： 在步骤 1) 中， 当所述 提取溶剂是浓度为 95%-100% 的甲醇或浓度为 95% 100% 的乙醇溶液时， 取步骤 a 得到的 提取溶液， 经静置后， 取上清液即可作为供试品溶液。 。

6、4. 如权利要求 1、 2 或 3 所述的一种小金牛草的检测方法， 其特征在于 ： 运用高效液相 色谱法对小金牛草中芒果苷进行定量测定， 按以下步骤进行 ： 1） 供试品溶液的制备 ： 取小金牛草药材粉末适量， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加 入提取溶剂， 提取溶剂的加入量与小金牛草粉末取样量的体积质量比， 以 ml/g 计 200:1， 密 塞， 称定重量， 超声处理 25 90 分钟或回流提取 0.5 3 小时， 放冷， 再称定重量， 用相应 的提取溶剂补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液作为供试品溶液 ； 2） 对照品溶液的制备 ： 取芒果苷对照品适量， 精密称定， 加浓度为。

7、 60% 的乙醇制备成浓 度为 20.584 1029.2g/ml 的对照品溶液， 即得 ； 3） 色谱条件与系统适用性试验 ： 以体积比为 10 20:90 80 的乙腈 - 酸的水溶液或 体积比为 10 40:90 60 的甲醇 - 酸的水溶液或体积比为 0 10 ： 10 30:90 60 的 乙腈 - 甲醇 - 酸的水溶液为液流动相 ； 高效液相色谱法的检测波长为 240 365nm、 柱温为 25 35、 色谱柱为 C18 柱， 理论塔板数按芒果苷峰计算应不低于 8000 ； 4） 测定 ： 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液， 注入高效液相色谱仪， 测定， 即得。 5. 如权利要求。

8、 4 所述的一种小金牛草的检测方法， 其特征在于 ： 在步骤 1） 中， 所述提 取溶剂是浓度为 50 70% 的甲醇或浓度为 50 70% 的乙醇。 6. 如权利要求 4 所述的一种小金牛草的检测方法， 其特征在于 ： 在步骤 3） 中， 所述酸 的水溶液中的酸选自含磷酸、 醋酸、 甲酸， 所述酸的水溶液中的酸与水的体积比为 0.1 权 利 要 求 书 CN 102854283 A 2 2/2 页 3 0.5:100。 7. 一种小金牛草的检测方法， 其特征在于， 运用高效液相色谱法对小金牛草中芒果苷 进行定量测定， 按以下步骤进行 ： 1） 供试品溶液的制备 ： 取小金牛草药材粉末适量， 。

9、精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加 入提取溶剂， 提取溶剂的加入量与小金牛草粉末取样量的体积质量比， 以 ml/g 计 200:1， 密 塞， 称定重量， 超声处理 25 90 分钟或回流提取 0.5 3 小时， 放冷， 再称定重量， 用相应 的提取溶剂补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液作为供试品溶液 ； 2） 对照品溶液的制备 ： 取芒果苷对照品适量， 精密称定， 加浓度为 60% 乙醇制备成浓度 为 20.584 1029.2g/ml 的对照品溶液， 即得 ； 3） 色谱条件与系统适用性试验 ： 以体积比为 10 20:90 80 的乙腈 - 酸的水溶液或 体积比为 10 40:。

10、90 60 的甲醇 - 酸的水溶液或体积比为 0 10 ： 10 30:90 60 的 乙腈 - 甲醇 - 酸的水溶液为液流动相 ； 高效液相色谱法的检测波长为 240 365nm、 柱温为 25 35、 色谱柱为 C18 柱， 理论塔板数按芒果苷峰计算应不低于 8000 ； 4） 测定 ： 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液， 注入高效液相色谱仪， 测定， 即得。 8. 如权利要求 7 所述的一种小金牛草的检测方法， 其特征在于 ： 在步骤 1） 中， 所述提 取溶剂是浓度为 50 70% 的甲醇或浓度为 50 70% 的乙醇。 9. 如权利要求 7 所述的一种小金牛草的检测方法， 其特征在。

11、于 ： 在步骤 3） 中， 所述酸 的水溶液中的酸选自含磷酸、 醋酸、 甲酸， 所述酸的水溶液中的酸与水的体积比为 0.1 0.5:100。 权 利 要 求 书 CN 102854283 A 3 1/8 页 4 一种小金牛草的检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种中药材的分析方法， 特别是涉及一种小金牛草的检测方法， 具体 地说是以小金牛草中的有效成分芒果苷作为指标成分， 对小金牛草进行质量控制的方法。 背景技术 0002 小金牛草为远志科远志属植物小花远志 Polygala arvensis Willd.（P. telephioides Willd.） ， 以全草入药。秋季采集， 晒干。

12、。味甘、 微苦， 平。散瘀止血， 化痰止 咳， 解毒消肿。 用于咳嗽胸痛， 肺结核， 咳血， 尿血， 便血， 月经不调， 跌打损伤， 小儿麻痹后遗 症， 肝炎， 毒蛇咬伤。 0003 小金牛草为组成金喉散处方之一， 且为处方中的君药， 所述的君药是指中医药领 域术语， 是指中医药配伍中的君药、 臣药、 佐药、 使药中的君药。小金牛草作为君药， 其质量 的好坏直接关系到金喉散的质量优劣， 而目前小金牛草还没有有效的质量控制方法， 小金 牛草质量标准收载于上海地方药材标准 （1994 年版） ， 该标准中药材鉴别项中只有性状鉴 别， 没有薄层色谱鉴别及含量测定项， 可见该标准专属性差、 准确性差，。

13、 不能有效地控制小 金牛草的质量。 发明内容 0004 针对现有技术的不足， 本发明的目的旨在提供一种小金牛草的检测方法， 本发明 运用薄层色谱法对小金牛草中有效成分芒果苷进行定性测定， 运用高效液相色谱法进行定 量测定， 或同时运用这两种方法。 通过上述检测方法能够很好地控制小金牛草的质量， 可用 于小金牛草药材真伪及品质优劣的评价， 保证其质量的稳定、 均一、 可控。同时该检测方法 还具有操作方便、 准确度好、 专属性强的特点。 0005 为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 一种小金牛草的检测方法， 其特征在于， 以芒果苷作为指标成分， 用薄层色谱法对芒果 苷进行定性测定， 按以。

14、下步骤进行 ： 1） 供试品溶液的制备 ： a、 取小金牛草粉末适量， 加甲醇或乙醇作为提取溶剂， 提取溶剂的加入量与小金牛草 粉末取样量的体积质量比， 以 ml/g 计为 50:1， 经超声处理 15 分钟 90 分钟或加热回流提 取 20 分钟 180 分钟， 得到提取溶液 ； b、 取步骤 a 得到的提取溶液， 经滤过、 滤液蒸干、 残渣用 10ml 甲醇或乙醇使溶解， 作为 供试品溶液 ； 或取步骤 a 得到的提取溶液， 经静置后， 取上清液即可作为供试品溶液 ； 2) 对照药材溶液的制备 ： 取对照药材粉末， 具体操作同步骤 a 制成对照药材溶液 ； 3) 对照品溶液的制备 ： 取芒。

15、果苷对照品， 加甲醇制成每1ml含0.1mg芒果苷的溶液， 作 为对照品溶液 ； 4) 鉴别 ： 吸取供试品溶液、 对照药材溶液和对照品溶液， 分别点于同一硅胶 G 薄层板 上， 以展开剂展开， 取出， 晾干， 喷以显色剂， 供试品色谱中， 在与对照药材色谱和对照品色 说 明 书 CN 102854283 A 4 2/8 页 5 谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点 ； 其中， 所述展开剂是体积比为 5 4:3:1:1 的乙酸乙 酯 - 丁酮 - 甲酸 - 水或体积比为 8 10:1:1 的乙酸乙酯 - 甲酸 - 水 ； 显色剂是浓度为 5% 三氯化铁乙醇溶液。 0006 优选的 ： 在步骤1)。

16、中， 当所述提取溶剂使浓度为40%-100%的甲醇或浓度为40% 100% 的乙醇溶液时， 取步骤 a 得到的提取溶液， 经滤过、 滤液蒸干、 残渣用 10ml 甲醇或乙醇 使溶解， 作为供试品溶液。 0007 优选的 ： 在步骤1)中， 当所述提取溶剂是浓度为95%-100%的甲醇或浓度为95% 100% 的乙醇溶液时， 取步骤 a 得到的提取溶液， 经静置后， 取上清液即可作为供试品溶液。 0008 一种小金牛草的检测方法， 其特征在于， 运用高效液相色谱法对小金牛草中芒果 苷进行定量测定， 按以下步骤进行 ： 1） 供试品溶液的制备 ： 取小金牛草药材粉末适量， 精密称定， 置 100m。

17、l 具塞锥形瓶中， 精密加入浓度为5070%甲醇或浓度5070%乙醇的作为提取溶剂， 提取溶剂的加入量与 小金牛草粉末取样量的体积质量比， 以ml/g计200:1， 密塞， 称定重量， 超声处理2590分 钟或回流提取 0.5 3 小时， 放冷， 再称定重量， 用相应的提取溶剂补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液作为供试品溶液 ； 2） 对照品溶液的制备 ： 取芒果苷对照品适量， 精密称定， 加浓度为 60% 的乙醇制备成 浓度为 20.584 1029.2g/ml 的对照品溶液， 即得 ； 3） 色谱条件与系统适用性试验 ： 以体积比为 10 20:90 80 的乙腈 - 酸的水溶液或。

18、 体积比为 10 40:90 60 的甲醇 - 酸的水溶液或体积比为 0 10 ： 10 30:90 60 的 乙腈 - 甲醇 - 酸的水溶液为液流动相 ； 高效液相色谱法的检测波长为 240 365nm、 柱温为 25 35、 色谱柱为 C18 柱， 理论塔板数按芒果苷峰计算应不低于 8000 ； 4） 测定 ： 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液 5l， 注入高效液相色谱仪， 测定， 即 得。 0009 优选的 ： 在步骤 1） 中， 所述提取溶剂是浓度为 50 70% 的甲醇或浓度为 50 70% 的乙醇。 0010 优选的 ： 在步骤 3） 中， 所述酸的水溶液中的酸选自含磷酸、 醋酸。

19、、 甲酸， 所述酸的 水溶液中的酸与水的体积比为 0.1 0.5:100。 0011 一种小金牛草的检测方法， 其特征在于， 以芒果苷作为指标成分， 运用薄层色谱法 对芒果苷进行定性测定， 同时， 运用高效液相色谱法对小金牛草中芒果苷进行定量测定 ； 它 们的具体操作步骤如前文所述。 0012 本发明的有益效果在于 ： 小金牛草作为君药， 其质量的好坏直接关系到金喉散的质量优劣， 由于目前小金牛草 没有有效的质量控制方法， 于是对其进行质量标准研究。在研究过程中用薄层鉴别色谱技 术和高效液相色谱技术对小金牛草的化学成分进行分析， 发现了芒果苷成分， 此芒果苷成 分用购自中国食品药品检定研究院 。

20、（批号 111607-200402） 芒果苷对照品进行比对， 其色谱 特征一致。 如 ： 用多种不同极性的展开剂进行薄层鉴别， 小金牛草供试品在与芒果苷对照品 相应的位置上显相同颜色的特征斑点 ； 用高效液相色谱仪 （二极管阵列检测器 DAD） 进行测 定， 小金牛草供试品与芒果苷对照品有相同的吸收光谱图 ； 再用多种体积比的流动相进行 测定， 小金牛草供试品在与对照品相应的位置上有相同的吸收峰， 说明小金牛草中含有芒 说 明 书 CN 102854283 A 5 3/8 页 6 果苷成分。 小金牛草中有芒果苷成分是发明人首次发现。 芒果苷具有抑制中枢神经系统、 抗 炎、 抑菌、 抗单纯疱疹病。

21、毒， 利胆和免疫作用， 对模拟高原急性低氧肝损伤有保护作用， 药理 实验表明， 本品用于治疗慢性支气管炎有较好疗效， 可见芒果苷为小金牛草中有效成分， 以 芒果苷作为主要评价指标来控制小金牛草的质量具有现实意义。与现有技术相比， 本发明 具有以下优点 ： 本发明以芒果苷作为指标成分， 运用薄层色谱法对芒果苷进行定性测定， 或 运用高效液相色谱法对小金牛草中芒果苷进行定量测定， 也可以同时运用这两种方法， 能 够很好地控制小金牛草的质量， 可用于小金牛草药材真伪及品质优劣的评价， 保证其质量 的稳定、 均一， 可控。本发明所述的检测方法还具有操作方便、 准确度好、 专属性强等优点。 附图说明 0。

22、013 图1为本发明的薄层鉴别色谱图， 其中， 1为小金牛草供试品， 2为小金牛草对照药 材， 3 为芒果苷对照品。 0014 图 2 为含量测定对照品高效液相色谱图。 0015 图 3 为含量测定供试品高效液相色谱图。 具体实施方式 0016 本发明提供的检测方法中所用试剂均由市场购得， 其中用于薄层色谱鉴别的 试剂为分析纯， 用于高效液相进行含量测定的甲醇和乙醇为色谱纯， 小金牛草为广州白 云山敬修堂药业股份有限公司购得， 对照品芒果苷购自中国食品药品检定研究院 （批号 111607-200402） 。 0017 以下为本发明的薄层色谱鉴别方法具体实施方式， 所述的实施例是为了进一步描 述。

23、本发明， 而不是限制本发明。 0018 一、 薄层色谱鉴别 ： 实施例 1 ： 供试品溶液的制备 ： 取小金牛草粉末 0.5g， 加 40% 甲醇 25ml， 超声处理 15 分钟， 滤过、 滤液蒸干、 残渣用 10ml 的甲醇使溶解， 即得。 0019 对照药材溶液的制备 ： 取对照药材， 按供试品溶液的制备方法制备对照药材溶液。 0020 对照品溶液的制备 ： 取芒果苷对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.1mg 的对照品溶液。 0021 鉴别 ： 吸取供试品溶液、 对照药材溶液 2l 和对照品溶液 10l， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以乙酸乙酯 - 丁酮 - 甲酸 - 水 （5。

24、:3:1:1） 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以浓 度为 5% 的三氯化铁乙醇溶液， 供试品色谱中， 在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置 上， 显相同颜色的斑点， 参照图 1。 0022 薄层色谱鉴别耐用性考察 ： 分别考察了在低温条件下 （4） 、 室温条件下 （25） 、 低湿条件下 （湿度为 30%） 、 高湿条件下 （湿度为 75%） 主斑点的分离效果。试验结果表明主斑 点分离效果好， 在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上， 均显相同颜色的斑点。 说明 该鉴别方法稳定性、 重复性好。 0023 实施例 2 ： 具体操作步骤同实施例 1， 不同的是供试品溶液的制备步骤中 。

25、： 超声处 理 30 分钟 ； 鉴别步骤中 ： 以乙酸乙酯 - 丁酮 - 甲酸 - 水 （体积比为 4:3:1:1） 为展开剂。 0024 实施例 3 ： 具体操作步骤同实施例 1， 不同的是供试品溶液的制备步骤中 ： 超声处 说 明 书 CN 102854283 A 6 4/8 页 7 理 90 分钟。 0025 实施例 4 ： 具体操作步骤同实施例 1， 不同的是供试品溶液的制备步骤中 ： 提取溶 剂为浓度为 50% 的甲醇， 加热回流 20 分钟 ； 鉴别步骤中 ： 以乙酸乙酯 - 甲酸 - 水 （体积比为 8:1:1） 为展开剂。 0026 实施例 5 ： 具体操作步骤同实施例 1， 。

26、不同的是供试品溶液的制备步骤中 ： 提取溶 剂为浓度为40%的乙醇， 加热回流60分钟， 残渣用10ml乙醇使溶解 ； 鉴别步骤中 ： 以乙酸乙 酯 - 甲酸 - 水 （体积比为 9:1:1） 为展开剂。 0027 实施例 6 ： 具体操作步骤同实施例 1， 不同的是供试品溶液的制备步骤中 ： 提取溶 剂加浓度为50%的乙醇， 加热回流180分钟 ； 鉴别步骤中 ： 以乙酸乙酯-甲酸-水 （体积比为 10:1:1） 为展开剂。 0028 实施例 7 ： 具体操作步骤同实施例 1， 不同的是供试品溶液的制备步骤中 ： 提取溶 剂为浓度为 95% 的甲醇， 提取液经静置后即得 （提取液不需滤过及蒸。

27、干） ； 鉴别步骤中 ： 供试 品溶液、 对照药材溶液的点样量为 10l。 0029 实施例 8 ： 具体操作步骤同实施例 1， 不同的是供试品溶液的制备步骤中 ： 提取溶 剂为浓度为100%的甲醇， 提取液经静置后即得 （提取液不需滤过及蒸干） ； 鉴别步骤中 ： 供试 品溶液、 对照药材溶液的点样量为 5l。 0030 实施例 9 ： 具体操作步骤同实施例 1， 不同的是供试品溶液的制备步骤中 ： 提取溶 剂为浓度为 95% 的乙醇， 滤液滤过即得 ； 鉴别步骤中 ： 供试品溶液、 对照药材溶液的点样量 为 10l。 0031 实施例 10 ： 具体操作步骤同实施例 1， 不同的是供试品溶。

28、液的制备步骤中 ： 提取溶 剂为浓度为 100% 的乙醇， 滤液滤过即得 ； 鉴别步骤中 ： 供试品溶液、 对照药材溶液的点样量 为 10l。 0032 二、 芒果苷含量测定 ： 实施例 11 ： 供试品溶液的制备 ： 取小金牛草药材粉末约 0.25g， 精密称定， 置 100ml 具塞锥形瓶中， 精密加入浓度为 50% 的甲醇 50ml， 密塞， 称定重量， 超声处理 25 分钟， 放冷， 再称定重量， 用 浓度为 50% 的甲醇补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液作为供试品溶液 ； 对照品溶液的制备 ： 取芒果苷对照品适量， 精密称定， 加浓度为 60% 的乙醇制备成浓度 为 400。

29、g/ml 的对照品溶液， 即得。 0033 色谱条件与系统适用性试验 ： 以体积比为 15:85 的乙腈 -0.1% 磷酸的水溶液为流 动相 ； 高效液相色谱法的检测波长为258nm、 柱温为25、 色谱柱为C18柱， 理论塔板数按芒 果苷峰计算应不低于 8000 ； 测定 ： 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液 5l， 注入高效液相色谱仪， 测定， 即得 ； 小金牛草含芒果苷不得少于 1.0%。 0034 实施例 12 ： 具体操作步骤同实施例 11， 不同的是供试品溶液的制备步骤中 ： 用浓 度为 50% 的乙醇为提取溶剂， 采用超声处理 45 分钟 ； 色谱条件与系统适用性试验步骤中 ：。

30、 以体积比为 10:90 的乙腈 -0.2% 磷酸的水溶液为流动相 ； 高效液相色谱法的检测波长为 240nm。 0035 实施例 13 ： 具体操作步骤同实施例 11， 不同的是供试品溶液的制备步骤中 ： 用浓 说 明 书 CN 102854283 A 7 5/8 页 8 度为 70% 的乙醇为提取溶剂， 采用超声处理 90 分钟 ； 色谱条件与系统适用性试验步骤中 ： 以体积比为 20:80 的乙腈 -0.5% 磷酸的水溶液为流动相 ； 高效液相色谱法的检测波长为 365nm。 0036 实施例 14 ： 具体操作步骤同实施例 11， 不同的是供试品溶液的制备步骤中 ： 用浓 度为 50%。

31、 的甲醇为提取溶剂， 采用回流提取 0.5 小时 ； 色谱条件与系统适用性试验步骤中 ： 以体积比为 10:90 的甲醇 -0.1% 磷酸的水溶液为流动相。 0037 实施例 15 ： 具体操作步骤同实施例 11， 不同的是供试品溶液的制备步骤中 ： 用浓 度为 60% 的甲醇为提取溶剂， 采用回流提取 1 小时 ； 色谱条件与系统适用性试验步骤中 ： 以 体积比为 10:90 的甲醇 -0.1% 磷酸的水溶液为流动相。 0038 实施例 16 ： 具体操作步骤同实施例 11， 不同的是供试品溶液的制备步骤中 ： 用浓 度为 70% 的甲醇为提取溶剂， 采用回流提取 1 小时 ； 色谱条件与系。

32、统适用性试验步骤中 ： 以 体积比为 20:80 的甲醇 -0.1% 醋酸的水溶液为流动相。 0039 实施例 17 ： 具体操作步骤同实施例 11， 不同的是供试品溶液的制备步骤中 ： 采用 回流提取3小时 ； 色谱条件与系统适用性试验步骤中 ： 以体积比为40:60的甲醇-0.2%醋酸 的水溶液为流动相。 0040 实施例 18 ： 具体操作步骤同实施例 11， 不同的是色谱条件与系统适用性试验步骤 中 ： 以体积比为 40:60 的甲醇 -0.5% 醋酸的水溶液为流动相， 柱温为 30。 0041 实施例 19 ： 具体操作步骤同实施例 11， 不同的是色谱条件与系统适用性试验步骤 中 。

33、： 以体积比为 0:10:90 的乙腈 - 甲醇 -0.1% 磷酸的水溶液为流动相， 柱温为 35。 0042 实施例 20 ： 具体操作步骤同实施例 11， 不同的是色谱条件与系统适用性试验步骤 中 ： 以体积比为 5:15:80 的乙腈 - 甲醇 -0.1% 甲酸的水溶液为流动相。 0043 实施例 21 ： 具体操作步骤同实施例 11， 不同的是色谱条件与系统适用性试验步骤 中 ： 以体积比为 10:30:60 的乙腈 - 甲醇 -0.2% 甲酸的水溶液为流动相。 0044 实施例 22 ： 具体操作步骤同实施例 11， 不同的是色谱条件与系统适用性试验步骤 中 ： 以体积比为 10:3。

34、0:60 的乙腈 - 甲醇 -0.5% 甲酸的水溶液为流动相。 0045 含量测定方法学验证 ： 仪器与试药 ： 高效液相色谱仪 ： Agilent 1260LC ； DAD 检测器。超声仪 ： 昆山市超声仪器有限公司 KQ-600DE 型。 0046 对照品芒果苷购自中国食品药品检定研究院 （批号 111607-200402） ， 小金牛草 （批 号 GX120601） 由广州白云山敬修堂药业股份有限公司购得 ； 乙腈 （色谱纯， honeywell） ， 作 为溶剂用的乙醇和甲醇为分析纯试剂， 购于广州试剂厂。 0047 色谱条件与系统适用性试验 ： 以体积比为 15:85 的乙腈 -0.。

35、1% 磷酸的水溶液为 流动相 ； 高效液相色谱法的检测波长为 258nm、 柱温为 25， 色谱柱 ： phenomenex synergi FUsion-RP(4m， 4.6250mm)， 理论塔板数按芒果苷峰计算应不低于 8000。 0048 供试品溶液的制备 ： 取小金牛草药材粉末约 0.25g， 精密称定， 置 100ml 具塞锥形 瓶中， 精密加入浓度为 60% 的乙醇 50ml， 密塞， 称定重量， 超声处理 30 分钟， 放冷， 再称定重 量， 用浓度为 60% 的乙醇补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液作为供试品溶液 ； 其高效液 相色谱图如图 3 所示。 说 明 书 C。

36、N 102854283 A 8 6/8 页 9 0049 对照品溶液的制备 ： 取芒果苷对照品适量， 精密称定， 加 60% 乙醇制备成浓度为 400g/ml 的对照品溶液， 即得。其高效液相色谱图如图 2 所示。 0050 线性关系考察 ： 精密称取芒果苷对照品 0.05146g， 置 50ml 容量瓶中， 加浓度 为 60% 的乙醇溶解并定容至刻度， 分别量取 2ml、 2ml、 2ml、 2ml、 5ml 置 100ml、 50ml、 25ml、 10ml、 10ml 的容量瓶中， 加浓度为 60% 的乙醇定容至刻度， 配制成系列含量为 20.584 1029.2g/ml 的芒果苷对照品。

37、溶液。精密吸取上述对照品溶液各 5l， 在前文所述的色谱 条件下测定， 并与峰面积 Y 为纵坐标， 浓度 X（n=6） 为横坐标进行线性回归， 得回归方程为 Y=21.207X-10.068， r=0.9999， 芒果苷在 20.584 1029.2g/ml 呈良好的线性关系。试验 结果见表 1. 表 1 线性关系考察数据 试验号 浓度 （g/ml）峰面积 120.584434.2 241.168860.9 382.3361729.9 4205.844330.05 5514.610943.85 61029.221801.8 精密度试验 ： 精密吸取芒果苷对照品溶液 5l， 重复进样 6 次， 。

38、测定峰面积， 计算芒果苷 峰面积的 RSD 为 0.08%。结果表明仪器精密度良好。结果见表 2. 表 2 精密度试验数据 重复性试验 ： 按前述对照品溶液的制备方法平行制备 6 份供试品溶液， 测定峰面积， 按 照回归方程计算芒果苷的含量。结果芒果苷的含量平均值为 42.60， RSD 为 0.24%， 表明重 复性良好。结果见表 3。 0051 表 3 重复性试验数据 稳定性试验 ： 精密吸取供试品溶液5l在0、 4、 8、 12、 16、 22小时， 分别进样分析， 测定芒 果苷的峰面积， RSD 为 0.26%。表明在供试品 22 小时内稳定。结果见表 4。 0052 表 4 稳定性试。

39、验数据 说 明 书 CN 102854283 A 9 7/8 页 10 加样回收试验 ： 取已知含量的供试品 6 份， 每份 0.2g， 精密称定， 置 100ml 锥形瓶中， 分 别精密加入 5ml 浓度为 1029.2g /ml 的对照品溶液， 按照供试品溶液制备方法制备并测 定。本方法芒果苷的加样回收率在 99.12% 101.66% 之间， RSD 为 1.04%。结果见表 5. 表 5 加样回收试验数据 不同厂家色谱柱考察 ： 取批号 GX120601 小金牛草样品， 按供试品溶液制备方法制备供 试品， 用不同品牌的色谱柱进行含量测定。 0053 色谱柱1 ： Phenemenex 。

40、Synergi 4u Fusion-RP 80A 4.6250mm NO:388211-23， 色 谱 柱 2 ： Agilent Eclipse Plus C18 5um 4.6250mm SN:USUXA01394， 色 谱 柱 3 ： Agilent TC-C18 5um 4.6250mm SN:USEGK01101。试验结果表明考察的 3 根色谱柱均 适用于本方法。结果见 6。 0054 表 6 不同色谱柱考察数据 含量限度的制定 ： 按本发明的含量测定方法先后测定了十批小金牛草中芒果苷的含 量， 结果见表 7。 0055 表 7 十批样品的含量测定结果 说 明 书 CN 102854。

41、283 A 10 8/8 页 11 含量限度的制定 ： 小金牛草中所含的芒果苷含量波动较大， 本发明人对十批小金牛草 进行了含量测定研究， 测定结果见表 7， 发现芒果苷的含量波动较大， 为了避免由于药材受 产地、 采收季节、 操作、 贮藏等因素造成含量的波动， 按小金牛草中芒果苷的含量最低值下 浮 10% 为其限度， 芒果苷的最低值为 1.1%， 下浮 10% 即为 1.0%， 据此规定本品按干燥品计算 芒果苷含量不得少于 1.0%。 0056 以上试验表明该含量测定的方法专属性好， 精密度高， 稳定性、 重复性、 准确度好。 0057 对于本领域的技术人员来说， 可根据以上描述的技术方案以及构思， 做出其它各 种相应的改变以及变形， 而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范 围之内。 说 明 书 CN 102854283 A 11 1/3 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 102854283 A 12 2/3 页 13 图 2 说 明 书 附 图 CN 102854283 A 13 3/3 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 102854283 A 14 。