一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102890074 A (43)申请公布日 2013.01.23 CN 102890074 A *CN102890074A* (21)申请号 201210390082.6 (22)申请日 2012.10.15 G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 常州大学 地址 213164 江苏省常州市武进区滆湖中路 1 号 (72)发明人 王建浩 邱琳 蒋鹏举 王车礼 夏江 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称 一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方 法 (57) 摘要 本发明涉及一种毛细管电泳检测蛋白多 肽相。

2、互作用的方法， 属于生物分析领域。首先 将 DQ2 与凝血酶混合， 切除 DQ2 上的 I 多肽 （LQPFPQPELPY） 。 将外源多肽荧光标记后与DQ2混 合， 然后进行毛细管电泳检测， 同时检测蛋白多肽 复合物和荧光多肽的出峰时间及荧光强度。该方 法还可以同时检测两种外源多肽与蛋白相互作用 的竞争过程。实验证明， 该方法操作简单， 检测灵 敏度高， 所需时间短。 该方法是对传统蛋白多肽相 互作用检测技术进行改进， 结合多波长荧光检测 灵敏度高等优点， 建立的一种新的高灵敏蛋白多 肽相互作用检测技术。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 附图 2 。

3、页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 先将 DQ2 与凝血酶混合， 切除 DQ2 上的 I 多肽 ； 再与经荧光标记的外源多肽混合得混合物， 然 后对混合物进行毛细管电泳荧光检测， 同时检测混合物中 DQ2- 多肽复合物和外源多肽的 出峰时间及荧光强度， 得出 DQ2 与外源多肽结合的曲线。 2. 如权利要求 1 所述的一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法， 其特征在于 ： 所述外源多肽为两种或两种以上， 。

4、不同的外源多肽分别用不同的荧光分子标记， 进行毛细 管电泳检测， 分别记录不同荧光标记物的荧光变化。 3. 如权利要求 1 所述的一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法， 其特征在于所 述的毛细管电泳检测中， 电泳缓冲液为 25 mM 硼酸缓冲液， pH9.3。 4. 如权利要求 3 所述的一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法， 其特征在于 ： 所述硼酸缓冲液经 0.22 m 滤膜过滤。 5. 如权利要求 1 所述的一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法， 其特征在于 ： 所述的外源多肽为 DQ2 的抗原多肽 Pep1 和 / 或和 / 或 ； 所述 Pep1、 Pep2 和 Pep3。

5、 的序列 分别如 SEQ ID NO.1-3 所示。 权 利 要 求 书 CN 102890074 A 2 1/3 页 3 一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物分析领域， 特别涉及一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方 法。 背景技术 0002 主要组织相容性复合体蛋白 （MHC） 由主要组织相容性复合体编码， 广泛存在于脊 椎动物细胞表面的一个糖蛋白分子大家族。MHC 表面有一沟， 可与外来抗原的肽链结合， 将 其提呈给 T 细胞引起免疫反应。因此研究 MHC 与蛋白的相互作用对于研究一些疾病的致病 机制非常重要。人类白细胞抗原 DQ2 蛋白 （DQ2。

6、） 是 MHC 很重要的一种蛋白。 0003 生物分析技术在揭示 MHC 蛋白和多肽的相互作用中起到了至关重要的作用。目 前研究 MHC 蛋白与多肽相互作用的方法主要有高效凝胶过滤色谱法 （HPSEC） （B. J. McFarland, J. F. Katz, A. J. Sant, et al. J. Mol. Biol. 2005, 350, 170-183） ， 荧 光偏振法 （S. L. De Wall, C. Painter, J. D. Stone, et al. Nat. Chem. Biol. 2006, 2, 197-201） ， 核磁共振法 （L. Schmitt, J.。

7、 J. Boniface, M. M. Davis, et al. J. Mol. Biol. 1999, 286, 207-218） 等。然而， 现在大多数的分析方法只能测量单个多肽和 MHC 蛋 白的结合过程， 而无法反应在生物体内的抗原递呈过程的复杂性细胞内源多肽和外源抗 原同时存在的这种竞争关系。 0004 毛细管电泳 （CE） 具有高效、 高速、 微量、 低消耗、 操作模式多， 分离方法开发容易等 优点， 由于具备如此多的优点以及分离生物大分子的能力， CE 成为近年来发展最迅速的分 离分析方法之一。尤其是将荧光检测与毛细管电泳相结合， 大大提高了检测限， 拓展了毛 细管电泳的应用。。

8、本试验建立的多肽配体和 HLA-DQ2 蛋白相互作用的检测方法， 克服了已 有方法存在的缺陷， 可满足大批量检测需要， 适用范围较广， 有较高的精确性及较好的稳定 性。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是 ： 为了克服现有技术对蛋白多肽相互作用检测的不 足， 本发明提供一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法。 0006 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是 ： 一种毛细管电泳检测蛋白多肽 相互作用的方法， 首先将 DQ2 与凝血酶混合， 切除 DQ2 上的 I 多肽 （LQPFPQPELPY， SEQ IDNO.1） 。将外源多肽 1 荧光标记后与 DQ2 混合， 然后进行毛细管。

9、电泳检测， 同时检测蛋白 多肽复合物和荧光多肽的出峰时间及荧光强度 ； 将SDQ2-Pep/STotal作为Y轴， 以时间为X轴， 得 到 DQ2 与多肽结合的曲线。其中 SDQ2-Pep是 DQ2 多肽复合物的荧光峰面积积分， STotal是整个 电泳普通的荧光峰面积积分。 0007 本发明方法中所述的毛细管电泳检测中， 电泳缓冲液优选为 25 mM 硼酸缓冲液， pH9.3。所述硼酸缓冲液经 0.22 m 滤膜过滤。 0008 本发明的方法还可以同时检测不同外源多肽及不同外源多肽与 DQ2 的竞争关系。 说 明 书 CN 102890074 A 3 2/3 页 4 例如， 当外源多肽为两种。

10、时， 将两种不同荧光分子标记的外源多肽 1 和外源多肽 2 与 DQ2 混 合， 进行毛细管电泳检测， 分别记录两种荧光标记物的荧光变化。 0009 将蛋白与多肽混合后， 可根据毛细管电泳谱图的变化检测蛋白多肽相互作用。该 方法还可以检测两种外源多肽与蛋白相互作用的竞争过程。 实验证明， 该方法操作简单， 检 测灵敏度高， 所需时间短 ； 可同时检测多个荧光波长， 从而减少了误差， 提高了检测的准确 性。该方法是对传统蛋白多肽相互作用检测技术进行改进， 结合多波长荧光检测灵敏度高 等优点， 建立的一种新的高灵敏蛋白多肽相互作用检测技术。 附图说明 0010 下面结合附图和实施例对本发明进一步说。

11、明。 0011 图 1 DQ2 与外源多肽相互作用示意图。 0012 图 2 毛细管电泳荧光检测 DQ2 与多肽 Pep2 的相互作用。其中， a 是 Pep2 的电泳 谱图 ； b 是 DQ2 与 Pep2 混合物的电泳谱图， DQ2/Pep2=1:10 ； c 是 DQ2 与 Pep2 混合物的电泳 谱图， DQ2/Pep2=10:1。激发光源 ex=490 nm。 0013 图 3 毛细管电泳荧光检测 DQ2 与多肽 Pep1 的相互作用。其中， a 是 Pep1 的电泳 谱图 ； b 是 DQ2 与 Pep1 混合物的电泳谱图， DQ2/Pep2=10:1。激发光源 ex=490 nm。

12、。 0014 图 4 毛细管电泳同时荧光检测两种外源多肽 Pep2 和 Pep3 与 DQ2 的相互作用。 Pep2 的检测波长为 520 nm （检测 FAM） ， Pep3 的检测波长为 670 nm（检测 Cy5） ， DQ2:Pep2: Pep3=10:1:1， 激发光源 ex=490 nm。 0015 图 5 毛细管电泳荧光检测 Pep3 多肽与 DQ2 相互作用的动力学。A， 是 Pep3 与 DQ2 混合后不同时间检测的毛细管电泳谱图 ； B 是 SDQ2-Pep3/STotal随时间变化的曲线。 具体实施方式 0016 现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。 0017 本发明。

13、原理如图 1 所示， 下述实施例中具体操作流程如下 ： 1、 首先将 DQ2 与凝血酶混合， 切除 DQ2 上的 I 多肽。 0018 2、 将荧光标记的外源多肽与步骤 1 中切除了 I 多肽的 DQ2 混合。 0019 3、 进行毛细管电泳检测 ： 电泳缓冲液 ： 为 25 mM 硼酸缓冲液 （pH9.3） ； 毛细管 ： 为未涂层毛细管 （内径 75 m， 长度 60 cm， 有效长度 35 cm） 。 0020 电泳检测 ： 进样电压 12 KV， 进样 10 s， 然后停止加压。分离电压 18 KV， 分离 10 min， 可同时检测多个通道的荧光强度， 收集、 分析得到相应的检测结果。

14、。 0021 4 、 将 SDQ2-Pep/STotal作为 Y 轴， 以时间为 X 轴， 得到 DQ2 与多肽结合的曲线。其中 SDQ2-Pep是 DQ2 多肽复合物的荧光峰面积积分， STotal是整个电泳普通的荧光峰面积积分。 0022 DQ2 可通过现有技术获得， 例如可按照文献的方法制备 （J Am Chem Soc 2006; 128: 1859-1867） 。 0023 也可以通过下述方法得到 ： 2 升 High-Five 细胞 （浓度为 2-2.5 106个 / 毫升） 首先用杆状病毒感染 （感染复数 MOI 为 3-5） ， 4 天后离心 30 分钟收集上清液。可溶性 DQ。

15、2 分子通过蛋白 A- 琼脂糖凝胶柱纯化， 并用 pH11.5 的缓冲液 （含有 50mM 二乙胺， 0.15M NaCl 说 明 书 CN 102890074 A 4 3/3 页 5 和 2M Tris） 洗脱。 0024 实施例 1 实例中使用的仪器及操作条件如下 ： 所用毛细管电泳为基于荧光显微镜自搭毛细管电泳系统， 高压电源为上海核物理研究 所生产 ； 荧光光谱仪为海洋光学 QE65000 ； 自制显微镜接口， 将显微镜标准口的荧光通过光 纤导入光谱仪。采用电压进样， 进样电压 12 KV， 进样时间为 10 s， 电泳电压为 18 KV， 电泳 10 min。 0025 图 2 为用。

16、毛细管电泳荧光检测 DQ2 与多肽 Pep2 的相互作用。Pep2 序列为 MATPLLMQALPMGALPQ（SEQ ID NO.3） ， 用羧基荧光素 （FAM） 标记 ； 实验结果表明， DQ2 与多肽 Pep2 的相互作用后在约 500 s 产生一个新的荧光峰， 而多肽的峰明显减弱， 因此该方法可 以用来检测 DQ2 与多肽的相互作用。 0026 实施例 2 实验条件同实施例1， 区别在用毛细管电泳检测外源多肽Pep1与DQ2的相互作用， 外源 多肽 Pep1 序列为 FAM-PVSKMRMATPLLMQA （SEQ ID NO.2） ， 用 FAM 标记。检测结果如图 3 所 示， 。

17、DQ2 与多肽 Pep1 的相互作用后产生一个新的荧光峰， 证明外源多肽 Pep1 可以与 DQ2 相 互作用。 0027 实施例 3 实验条件同实施例 1， 区别在用毛细管电泳同时检测两种外源多肽 Pep2 和 Pep3 与 DQ2 的相互作用， 外源多肽Pep2用 FAM标记 ； 外源多肽Pep3序列为LQLQPFPQPELPYPQPELPY （SEQ ID NO.4） , 用近红外菁类染料 （Cy5） 标记。如图 4 所示。实验结果表明， 在同一光源激发 下， 可同时检测两种外源多肽与 DQ2 的相互作用。 0028 实施例 4 实验条件同实施例 1， 区别在用毛细管电泳检测 Pep3 。

18、多肽 （用 Cy5 标记） 与 DQ2 相互作 用的动力学， 如图 5 所示。实验结果表明， DQ2 与 Pep3 复合物的电泳峰 （图 5A， 约 520 s） ， 随时间的增加而逐渐增加。因此可通过毛细管电泳检测 DQ2 与外源多肽的结合过程。 0029 通过上述四个实施例可以看出， 本发明的一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用 的方法可以实现蛋白多肽相互作用检测， 并且灵敏度高， 操作方便， 结果准确。 0030 以上述依据本发明的理想实施例为启示， 通过上述的说明内容， 相关工作人员完 全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内， 进行多样的变更以及修改。本项发明的技术 性范围并不局限于说明书上的内容， 必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。 说 明 书 CN 102890074 A 5 1/1 页 6 序列表 序 列 表 CN 102890074 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102890074 A 7 2/2 页 8 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102890074 A 8 。