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1、(10)申请公布号 CN 102907253 A (43)申请公布日 2013.02.06 CN 102907253 A *CN102907253A* (21)申请号 201210224637.X (22)申请日 2012.07.02 CGMCC No.5510 2011.12.05 A01G 1/04(2006.01) C12P 17/12(2006.01) (71)申请人 恩施清江生物工程有限公司 地址 445000 湖北省恩施土家族苗族自治州 恩施市施州大道 517 号 (72)发明人 向极钎 帅超群 龙澜 杨永康 覃大吉 殷红清 李红英 程新华 李亚杰 (54) 发明名称 一种蛇足石杉。
2、内生菌及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一种蛇足石杉内生菌及其应 用， 其特征在于， 该菌分类学命名为裂褶菌 （Schizophyllum commune） ， 命名为 XQYS， 于 2011 年 12 月 5 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC No. 5510 ； 所述的产石杉碱甲真菌的rRNA基因序列包括18S rRNA 片段， ITS1、 5.8S rRNA、 ITS2的全序列及28S rRNA 序列片断。一种蛇足石杉内生菌在制备石杉 碱甲中的应用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 。
3、页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种蛇足石杉内生菌， 其特征在于从蛇足石杉活体中分离的产石杉碱甲真菌， 该菌 分类学命名为裂褶菌 （Schizophyllum commune） ， 命名为XQYS， 于2011年12月5日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No. 5510 ； 所述的产石 杉碱甲真菌的 rRNA 基因序列包括 18S rRNA 片段， ITS1、 5.8S rRNA、 ITS2 的全序列及 28S rRNA 序列片断为 ： GTCAA。
4、AAGTTAGCGCACAAGTCGCTAGTCTCGGTCAAGAGACGGTTAGAAGCAGACTCCTATTGAAACTGAC TAGGTCAGCCCCGAGATGGTCAACGACGTAGAAATTATCACATCGGAGACGCGATCCCGCAAGGGAAATCCGCTAAT ACATTTAAGAGGAGCTGGCTCCGTTAGGCTCCAGCAGACCTCCACTTCCAAGCCACTCTCGAGACCGAAGTCAAAAG AGGGTTGATGGTATTTAATGACACTCAAACAGGCATGCCCCTCGGAATACCAAAGGGCGCAAGGTGCGTTCAAAGA。
5、T TCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGA GATCCGTTGTCGAAAGTTGTATTAACTTTTTAGGGTCTGTCAAGACCATGATTACATTCGTTAACATACTTTAAGGT GTGAGGTAGACGTAGTCAACCGCCGCCCGTGAAGGCTTTGGGACTACATAAGGTGCACAGGATCAGAACAAGATGAA CTTGTTTGATTCGTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTAC 。 2. 按照权。
6、利要求 1 所述的一种蛇足石杉内生菌在制备石杉碱甲中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102907253 A 2 1/3 页 3 一种蛇足石杉内生菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物工程技术领域， 特别是涉及一种蛇足石杉内生菌及其应用。 背景技术 0002 随着世界老龄人口的迅速增加， 早老性痴呆症 (AD) 患者日益增多， 已成为继心血 管疾病、 肿瘤病后威胁老年人生命的第三大疾病。 0003 我国科学家刘嘉森等于1986年从民间草药千层塔Huperzinaserrata(Thumb.)中 分离得到的一种新型石松类生物碱有效单体石杉碱甲 （Huperzine A） 。 近年来，。
7、 国内大 量临床研究已证实， 石杉碱甲是一种高效、 高选择性、 可逆性的乙酰胆碱酯酶抑制剂， 具有 促进记忆再现和增强记忆保持的作用， 对 AD、 血管性痴呆、 智力低下、 精神分裂症等患者的 学习、 记忆障碍以及神经退行性疾病有很好的治疗作用。 0004 目前， 石杉碱甲主要来源于野生蛇足石杉全草， 该植物对环境要求苛刻， 分布星 散， 生长缓慢， 资源更新周期长。 据调查， 中国作为蛇足石杉野生资源主要分布区， 天然生物 量为4656.6t， 理论可采量为1604t， 商业可采量不超过200t， 而目前每年约需要至少2000t 蛇足石杉干品， 有限的自然资源， 远不能满足市场对药源的需求，。
8、 可持续利用蛇足石杉资源 是一个急待解决的问题， 也是制约石杉碱甲开发的瓶颈。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题在于提供一种能够通过微生物发酵产生石杉碱甲类 似物。 0006 本发明提供一种蛇足石杉内生真菌分类学命名为裂褶菌 （Schizophyllum commune） ， 命名为 XQYS。 0007 本发明所述的蛇足石杉内生真菌是从石杉科植物蛇足石杉植物活体中采用内生 真菌分离纯化技术分离获得。 经微生物分类学鉴定为裂褶菌 （Schizophyllum commune） ； 该 菌株己保藏， 于 2011 年 12 月 5 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，。
9、 保藏号为 CGMCC No. 5510。保藏地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微 生物研究所， 邮编 ： 100101。 0008 本发明所述菌株固体培养特征 ： 在 PDA 琼脂培养基上菌落生长较快， 25黑暗条 件下培养 7 天， 菌落直径 45-50 mm， 白色， 絮状， 隆起， 背面浅褐色， 无水溶性色素 ； 0009 本发明所述菌株液体培养特征 ： 挑取少许菌丝接种于 PD 培养基， 摇瓶培养， 培养 温度 281； 培养第 1-2 天， 有少许白色菌丝出现 ； 培养第 3-4 天， 形成直径 1-3mm 白色菌 丝球 ； 培养第5-6天， 形成直径5。
10、-8mm白色菌丝球 ； 培养第7天菌球直径增大到12-18mm ； 培 养 5-6 天后发酵液有浓郁酒香味。 0010 本发明所述菌株显微特征 ： 菌丝壁平滑或稍粗糙， 分枝较少， 具分隔， 2.0-5.0m 宽， 无锁状联合现象。未见无性型产孢结构及孢子。 0011 本发明所述菌株rRNA基因序列 （包括18S rRNA 片段， ITS1、 5.8S rRNA、 ITS2的全 说 明 书 CN 102907253 A 3 2/3 页 4 序列及 28S rRNA 序列片断） 为 ： 0012 GTCAAAAGTTAGCGCACAAGTCGCTAGTCTCGGTCAAGAGACGGTTAGAA。
11、GCAGACTCCTATTGAAACT GACTAGGTCAGCCCCGAGATGGTCAACGACGTAGAAATTATCACATCGGAGACGCGATCCCGCAAGGGAAATCCGCT AATACATTTAAGAGGAGCTGGCTCCGTTAGGCTCCAGCAGACCTCCACTTCCAAGCCACTCTCGAGACCGAAGTCAA AAGAGGGTTGATGGTATTTAATGACACTCAAACAGGCATGCCCCTCGGAATACCAAAGGGCGCAAGGTGCGTTCAAA GATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCAT。
12、TTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCA AGAGATCCGTTGTCGAAAGTTGTATTAACTTTTTAGGGTCTGTCAAGACCATGATTACATTCGTTAACATACTTTAA GGTGTGAGGTAGACGTAGTCAACCGCCGCCCGTGAAGGCTTTGGGACTACATAAGGTGCACAGGATCAGAACAAGAT GAACTTGTTTGATTCGTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTAC 0013 本发明的另一目的是提供了蛇足石杉内生真菌的应用。 0014 本发明所述菌株， 经发酵可得石杉碱甲。
13、类似化合物， 其工艺包括菌种活化、 种子培 养、 发酵培养、 总生物碱的提取、 HPLC 分析、 石杉碱甲类似化合物步骤。各工艺步骤参数如 下 ： 0015 （1） 菌种活化 ： 培养基为 PDA 培养基， 平板活化培养 72 小时， 温度为 281 ； 0016 （2） 种子培养 ： 培养基为 PD 培养基， 摇瓶培养 72 小时， 温度为 281 ； 0017 （3） 发酵培养 ： 培养基为改良 PD 培养基， 摇床培养 14 天， 温度为 281 ； 0018 （4） 总生物碱的提取 ： 发酵完毕， 超声处理发酵液， 用常规提取方法提取总生物 碱 ； 0019 （5） HPLC 分析 ：。
14、 提取总生物碱后， 对总提取物进行 HPLC 分析， 色谱条件色谱 柱 KromasilC18 反相柱， 柱温 25， 流动相 CH3CN ： KH2PO4（0.02mol/L） =15:85， 流速 1.0mL/ min， 检测波长 310nm。 0020 （6） 石杉碱甲类似化合物 ： HPLC 分析后， 获得石杉碱甲类似化合物。 0021 本发明从石杉科植物蛇足石杉植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得 一株生长快、 产石杉碱甲稳定的裂褶菌 （Schizophyllum commune） XQYS。该菌株液体发酵 能够产生石杉碱甲类似化合物， 提供了石杉碱甲的微生物发酵生产的新方式，。
15、 为寻找治疗 早老性痴呆活性成分石杉碱甲资源提供了新途径， 具有良好的应用前景。 附图说明 ： 0022 图 1 为本发明所述裂褶菌菌落形态及显微特征 ; 0023 图 2 为本发明所述裂褶菌液态发酵菌球形态 ； 0024 图 3 为本发明所述裂褶菌发酵液 HPLC 检测结果 具体实施方式 0025 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述， 但发明的实施方式不限于此。 0026 实施例 1: 本发明裂褶菌株的富集和筛选 0027 （1） 采集蛇足石杉全草若干， 包括茎段、 叶片、 不定根等， 用保鲜膜包裹， 保持其鲜 活状态。 0028 （2） 将采集的新鲜蛇足石杉用自来水洗净， 去除泥垢，。
16、 再用流水冲洗30min。 滤纸吸 干外植体表面水渍后， 将外植体放入干燥广口瓶中， 移入无菌操作间进行操作。 在无菌操作 说 明 书 CN 102907253 A 4 3/3 页 5 间， 用 70乙醇浸泡外植体 10-15S， 无菌水冲洗 3-4 次， 无菌滤纸吸干外植体表面水渍， 再 用 0.1升汞溶液浸泡外植体 15 min， 无菌水冲洗 3-4 次， 无菌滤纸吸干外植体表面水渍。 处理完后， 将外植体置于无菌广口瓶中备用。 0029 （3） 接种培养。茎段 ： 剪去茎段两端裸露截面少许， 再将茎段切成有 2-3 个节间的 小段， 接入培养基中。叶片 ： 选取完整无损叶片， 剪去叶片外。
17、缘， 接入培养基中。不定根 ： 剪 去不定根两端裸露截面少许， 再将不定根切成约 1.5cm 的小段， 接入培养基中。将接种后的 外植体转入培养室内进行培养， 培养温度 281。 0030 （4） 菌种分离。 在外植体培养过程中选取长菌外植体， 采用平板划线法进行内生菌 的分离。将划好的培养皿置于 25下恒温培养， 3-5 天后挑取单菌落菌种， 采用划线法重复 分离纯化 3 次， 得到纯化菌种。将纯化菌种转入 PDA 试管斜面中保存备用。 0031 （5） 取从蛇足石杉植株中富集分离到的内生真菌， 无菌条件下， 转接入已灭菌的液 体 PD 培养基中， 28下 100rpm 摇床培养 14 天 。
18、； 0032 （6） 发酵完毕， 发酵液超声处理 30min 后， 取发酵液过 0.45m 滤膜进行 HPLC 检 测， 色谱条件 ： 色谱柱 KromasilC18 反相柱， 柱温 25， 流动相 CH3CN ： KH2PO4（0.02mol/L） =15:85， 流速 1.0mL/min， 检测波长 310nm。检查结果与石杉碱甲标准品图谱进行对比分析， 表明本发明的蛇足石杉内生真菌菌种液体发酵能够产生石杉碱甲类似化合物。 0033 实施例 2 ： 本发明裂褶菌株发酵可得石杉碱甲类似化合物 0034 （1） 取本发明的裂褶菌 （Schizophyllum commune） XQYS， 在无。
19、菌条件下， 用接种针 挑取少量菌丝， 接入 PDA 平板， 活化培养 72 小时， 培养温度为 281 ； 0035 （2）活化培养 72 小时后， 转接入 PD 培养基， 摇瓶培养 72 小时， 培养温度为 281 ； 0036 （3） 将种子发酵 72 小时后的菌种， 转接入改良 PD 培养基， 摇床培养 14 天， 培养温 度为 28 士 1 ； 0037 （4） 发酵完毕， 超声处理发酵液 30min 后， 用常规提取方法提取发酵液中总生物 碱 ； 0038 （5） 提取总生物碱后， 对总提取物进行 HPLC 分析。色谱条件 ： 色谱柱 KromasilC18 反相柱， 流动相 CH3CN ： KH2PO4=15:85， 流速 1.0mL/min， 检测波长 310nm。检查结果与石杉碱 甲标准品图谱进行对比分析。 0039 （6） 通过 HPLC 检测， 检查结果与石杉碱甲标准品图谱进行对比分析， 表明本发明 的蛇足石杉内生真菌菌种液体发酵能够产生石杉碱甲类似化合物。 说 明 书 CN 102907253 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102907253 A 6 。