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1、(10)申请公布号 CN 102818898 A (43)申请公布日 2012.12.12 CN 102818898 A *CN102818898A* (21)申请号 201210281588.3 (22)申请日 2012.08.09 G01N 33/68(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/558(2006.01) (71)申请人 河南省农业科学院 地址 450002 河南省郑州市金水区花园路 116 号 (72)发明人 张改平 杨苏珍 卢清侠 职爱民 杨继飞 乔松林 邓瑞广 (74)专利代理机构 郑州金成知识产权事务所 ( 普通合伙 ) 41121 。
2、代理人 郭增欣 (54) 发明名称 一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的 试纸条及其制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种快速鉴别口蹄疫病毒感染和 疫苗免疫动物的试纸条及其制备方法， 含有支撑 层和吸附层， 吸附层附着在支撑层上， 吸附层从测 试端依次为样品吸附纤维层、 金标抗体纤维层、 纤 维素膜层和手柄端的吸水材料层， 在纤维素膜层 上设有检测印迹和对照印迹， 金标抗体纤维层上 吸附有胶体金标记的葡萄球菌蛋白 A， 检测印迹 用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒 结构蛋白 VP1 抗原和非结构蛋白 3ABC 抗原中的 一种或两种印制， 对照印迹用羊或兔抗SPA的IgG 抗体溶液印。
3、制。 本发明的试纸条特异性强， 灵敏度 高， 简便， 直观， 准确， 适用范围广， 成本低， 专业和 非专业人士均可随时随地实时检测， 易于推广应 用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 8 页 序列表 1 页 附图 1 页 1/2 页 2 1. 一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条， 含有支撑层和吸附层， 吸附层 附着在支撑层上， 吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、 金标抗体纤维层、 纤维素膜层和 手柄端的吸水材料层， 在纤维素膜层上设有检。
4、测印迹和对照印迹， 其特征是 ： 所述金标抗体 纤维层上吸附有胶体金标记的葡萄球菌蛋白 A 即 SPA， 所述检测印迹用大肠杆菌表达系统 表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白 VP1 抗原和非结构蛋白 3ABC 抗原中的一种或两种印 制， 对照印迹用羊或兔抗 SPA 的 IgG 抗体印制。 2. 根据权利要求 1 所述的试纸条， 其特征是 ： 所述支撑层用不吸水的硬质塑胶条或硬 纸条制成 ； 样品吸附纤维层用玻璃棉、 尼龙纤维或聚酯纤维制成 ； 金标抗体纤维层用玻璃 棉制成。 3. 根据权利要求 1 所述的试纸条， 其特征是 ： 所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、 纤维素 膜、 羧甲基纤维素膜或聚偏二。
5、氟乙烯 PVDF 纤维素膜制成 ； 所述吸水材料层用吸水纸制成。 4. 根据权利要求 1 所述的试纸条， 其特征是 ： 所述纤维素膜层上含有一条 / 个检测印 迹时， 检测印迹、 对照印迹的排列形式为 “” 、“十十” 、“ ” 、“ ” 、“” 、“” 和 “ ” 中的任一种 ； 纤维素膜层上含有两条 / 个检测印迹时， 检测印迹、 对照印迹的排 列形式为 “” 、“十十十” 、“ ” 、“ ” 、“” 、“” 和 “ ” 中的任一种。 5. 根据权利要求 1 4 任一项所述的试纸条， 其特征是 ： 在所述样品吸附纤维层、 金标 抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜， 在样品吸附纤维层与金标。
6、抗体纤维层交界处对 应的保护膜上印制有样品标记线。 6. 权利要求 1 所述试纸条的制备方法， 其特征是 ： 该方法包括以下步骤 ： （1） 大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原的 制备 ； （2） 胶体金标记的葡萄球菌蛋白 A 的制备 ： 以柠檬酸钠还原法制备胶体金， 进而获得胶 体金标记的 SPA ； （3） 羊抗或兔抗 SPA 的 IgG 抗体的制备 ： 用所得的大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白 VP1 抗原和非结构蛋白 3ABC 抗原中的一种或两种分别在纤维素膜层上制成检测印迹， 用羊抗或兔抗小鼠 IgG 抗体在纤 维素膜层上制成对照印迹 。
7、； 将胶体金标记的葡萄球菌蛋白 A 用于制备金标抗体纤维层， 然 后将支撑层、 吸附层和保护层依次组装成试纸条。 7. 根据权利要求 6 所述试纸条的制备方法， 其特征是 ： 其中大肠杆菌表达并纯化的猪 口蹄疫病毒结构蛋白 VP1 抗原的制备方法如下 ： 根据 O 型 FMDV VP1 模板基因序列设计一对特异性引物 ： 上游引物 5 ATAGGATCCA TGACCACTGCTACCGGGGAGTC3 引入酶切位点BamHI， 下游引物 5 ATAAAGCTTCAAGAGCTGC TTTGCGGGTG3 引入酶切位点HindIII ； 以重组质粒 pMD18T-VP1 为模板， 进行 PCR。
8、 扩增， 获 得VP1 基因 ； PCR 产物经BamHI 和HindIII 双酶切消化克隆到PET-28a 载体中， 转化大肠 杆菌， 将重组菌在 LB 培养基中培养至 OD600 达到 0.6 时， 加入异丙基 -D- 硫代吡喃半 乳糖苷诱导剂， 使其浓度为0.5mmol/L， 在37诱导表达6小时， 将表达菌液离心， 收获细菌 沉淀 ； 将得到的菌体重悬于 20 毫升缓冲液中， 超声破碎后离心收集沉淀， 用洗液洗涤包涵体 权 利 要 求 书 CN 102818898 A 2 2/2 页 3 5 次， 将沉淀悬于 20 毫升悬浮液中洗涤 1 次， 最后离心沉淀得到纯化后的包涵体 ； 将纯化。
9、后 的包涵体溶于 pH 为 8.0 的变性剂中， 于 4搅拌 10 小时， 离心去除不溶物， 得到变性蛋白 ； 取 90 毫升变性蛋白装入透析袋， 并将透析袋放入 1.8 升复性缓冲液中， 4条件下搅拌透 析， 每 5 小时换液一次， 换液 4 次后用 1.8 升 PBS 透析 4 次， 前两次透析 12 小时 / 次， 后两 次透析 6 小时 / 次 ； 收集透析袋内的液体， 经 10000 转 / 分钟、 4 离心 10 分钟， 弃去沉淀， 将上清用 0.45 微米滤膜过滤 ； 用 20KD 的浓缩管浓缩， 3000 转 / 分钟、 4离心 30 分钟， 收 集浓缩蛋白， 于 -20冷冻保。
10、存。 8. 根据权利要求 6 所述试纸条的制备方法， 其特征是 ： 大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄 疫病毒非结构蛋白 3ABC 抗原的制备方法如下 ： 将重组质粒 pGEM-T-3ABC 用 SalI 和 BglII 酶切消化， 回收目的片段 3ABC ； 用 XholI 和 BglII 对表达载体 pTriEx-4Neo 进行消化， 用 T4 DNA Ligase 连接后， 转化大肠杆菌菌 株， 得到重组菌， 将重组菌接种到 LB 培养液中， 37、 250 r/ min 摇至 OD600 达 0.5 ； 加入 异丙基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷诱导剂， 使其浓度为 0.5mmol/L， 37诱导。
11、表达 6 小时， 将 表达菌液离心， 收获细菌沉淀 ； 将得到的菌体重悬于 20 毫升缓冲液中， 超声破碎后离心收集沉淀， 用洗液洗涤包涵体 5 次， 将沉淀悬于 20 毫升悬浮液中洗涤 1 次， 最后离心沉淀得到纯化后的包涵体 ； 将纯化后 的包涵体溶于 pH 为 8.0 的变性剂中， 于 4搅拌 10 小时， 离心去除不溶物， 得到变性蛋白 ； 取 90 毫升变性蛋白装入透析袋， 并将透析袋放入 1.8 升复性缓冲液中， 4条件下搅拌透 析， 每 5 小时换液一次， 换液 4 次后， 用 1.8 升 PBS 透析 4 次， 前两次透析 12 小时 / 次， 后两 次透析 6 小时 / 次 。
12、； 收集透析袋内的液体， 经 10000 转 / 分钟、 4 离心 10 分钟， 弃去沉淀， 将上清用 0.45 微米滤膜过滤 ； 用 20KD 的浓缩管浓缩， 3000 转 / 分钟、 4离心 30 分钟， 收 集浓缩蛋白， 于 -20冷冻保存。 9. 根据权利要求 7 或 8 所述试纸条的制备方法， 其特征是 ： 所述缓冲液的组成为 ： 10 mmol/L 的 Tris-HCl、 150 mmol/L NaCl、 10 mmol/L EDTA、 10 % 体积的甘油、 2 mmol/L DTT ； 所述洗液的组成为 ： 1 % 体积的Triton-100、 50 mmol/L Tris-H。
13、Cl、 100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L EDTA、 2 mmol/L DTT ； 所述悬浮液的组成为 ： 50 mmol/L Tris-HCl、 100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L EDTA、 2 mmol/L DTT。 10. 根据权利要求 7 或 8 所述试纸条的制备方法， 其特征是 ： 所述变性剂的组成为 ： 尿 素 8mol/L、 NaCl 0.5mol/L、 Tris-HCl 20mmol/L、 EDTA 20mmol/L、 SDS 2% ； 所述复性缓冲液 的组成为 ： Tris-HCl 50mmol/L pH 8.0、 NaCl 10mmo。
14、l/L、 EDTA 10 mmol/L、 DTT 2mmol/L、 氧 化型谷胱甘肽 1 mmol/L、 还原型谷胱甘肽 1 mmol/L、 PMSF 0.5 mmol/L。 权 利 要 求 书 CN 102818898 A 3 1/8 页 4 一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条及其制 备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种检测口蹄疫病毒的器具， 特别是涉及一种快速鉴别口蹄疫病毒感 染和疫苗免疫动物的试纸条及其制备方法。 背景技术 0002 口蹄疫 （Foot-and-mouth-disease， FMD） 是由口蹄疫病毒 （FMDV） 引起偶蹄动物的 一种烈性传染性疫病。FMD。
15、V 具有多型性、 易变性、 宿主广泛性、 传染力极强等特点， 一旦发 病即呈流行性、 大爆发性。 FMD 的爆发和流行常给发病地区造成巨大损失， 除动物死亡造成 的直接经济损失外， 还有动物患病期间肉和奶的生产停滞、 病愈后肉和奶的产量长期下降 以及种用价值丧失等较大损失。更为严重的是， FMD 是一种烈性传染病， 具有极强的传染 性， 对于发病动物以及接触病原的同群动物， 必需进行严格隔离、 封锁、 禁止动物移动和畜 产品上市等。因此， FMD 导致发病地区甚至发病国家的畜产品进出口贸易停止， 除造成巨大 的经济损失外， 还产生一定的政治影响。 0003 疫苗接种是发展中国家控制 FMD 的。
16、主要策略， 由于 FMD 固有的特点， 目前国内外 的疫苗只能保护免疫动物不发生 FMD， 但是这种方法不能防止免疫动物再次发生 FMDV 的 感染。 在疫区的免疫动物群中， 有一定数量的动物是病毒携带者， 这些动物有可能持续向外 排毒， 在牛、 羊体内形成持续性感染的病毒可长期存在。 这些隐性感染或带毒的动物不但可 能引发新的疫情， 还为病毒变异和产生新毒株提供了环境。因此， FMDV 疫苗免疫动物抗体 水平以及如何区分免疫动物和病毒感染动物是控制 FMDV 的关键问题。 0004 目前使用的 FMDV 疫苗主要是灭活疫苗和合成肽疫苗。灭活疫苗免疫动物后， 动 物体内不会有病毒增殖， 疫苗生。
17、产中在病毒纯化过程中已经去除了绝大部分的非结构蛋白 （NSP） ， 没有了非结构蛋白的表达， 因而在免疫动物体内就不会有非结构蛋白抗体的产生， 多肽疫苗本身就是 FMDV 结构蛋白 VP1 上的一个主要抗原表位， 更没有非结构蛋白的存在。 而 FMDV 感染的动物体内， 在病毒装配过程中有大量非结构蛋白的表达， 刺激机体产生相应 的非机构蛋白抗体。结构蛋白抗体检测可以监控动物的免疫状态和抗体产生水平， 非结构 蛋白抗体检测技术为区分感染动物和免疫动物提供依据， 结构蛋白和非结构蛋白检测技术 的结合可以达到一步检测FMDV免疫抗体水平以及区分FMDV感染动物和疫苗免疫动物的目 的。 0005 目。
18、前实验室检测 FMDV 抗体的方法有 ：（1） 病毒分离 ： 从患病动物的病料中分离出 病毒， 再对分离到的病毒进行培养鉴定做出诊断， 确定是否FMDV 感染。 这种技术准确可靠， 但敏感性差， 而且有些样品中存在补体活性， 影响检测效果， 并且需要专门的实验室。 （2） 病 毒中和试验 ： 利用病毒与特异性血清中和抗体的相互作用， 从而使病毒失去对易感动物和 敏感细胞的感染能力， 这一方法必须使用活病毒， 普通实验室不能操作。 （3） 酶联免疫吸附 试验 （ELISA） ： 主要有区分感染与免疫的非结构蛋白 ELISA（I-ELISA） 和检测疫苗免疫动 物的血清抗体水平的液相阻断 ELIS。
19、A。ELISA 方法测定时具有特异、 敏感等优势， 但操作复 说 明 书 CN 102818898 A 4 2/8 页 5 杂、 费时、 费力， 需要特定的仪器设备和专业技术人员， 很难在基层普及推广。同时， 液相阻 断 ELISA 方法需要灭活病毒的参与， 因此， 还存在病毒灭活不全或病毒逃逸等风险。此外， 近年来随着猪O型FMD合成肽疫苗的推广应用， 已经逐步占据了主要市场， 传统的液相阻断 ELISA 很难对多肽疫苗抗体做出准确的检测结果。因此， 研究一种简便快速、 一步可以检测 疫苗免疫和病毒感染的实时在线检测技术， 非常重要而迫切。 发明内容 0006 本发明要解决的技术问题 ： 克。
20、服现有技术中检测口蹄疫病毒抗体和疫苗抗体存在 的缺陷， 提供一种特异性强、 敏感性高、 简便、 快速鉴别口蹄疫病毒抗体和疫苗抗体的免疫 金标试纸条， 该试纸条具有特异性强、 敏感性高、 使用简便、 成本低的优点 ； 本发明还提供了鉴别口蹄疫病毒抗体和疫苗抗体的免疫金标试纸条的制备方法。 0007 本发明采用的技术方案 ： 一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条， 含有支撑层和吸附层， 吸附层附 着在支撑层上， 吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、 金标抗体纤维层、 纤维素膜层和手 柄端的吸水材料层， 在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹， 所述金标抗体纤维层上吸 附有胶体金标记的葡萄球菌。
21、蛋白 A 即 SPA， 所述检测印迹用大肠杆菌表达系统表达并纯化 的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原中的一种或两种印制， 对照印迹 用羊或兔抗 SPA 的 IgG 抗体印制。 0008 所述支撑层用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成 ； 样品吸附纤维层用玻璃棉、 尼 龙纤维或聚酯纤维制成 ； 金标抗体纤维层用玻璃棉制成。 0009 所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、 纤维素膜、 羧甲基纤维素膜或聚偏二氟乙烯 PVDF 纤维素膜制成 ； 所述吸水材料层用吸水纸制成。 0010 所述纤维素膜层上含有一条 / 个检测印迹时， 检测印迹、 对照印迹的排列形式为 “” 、“十十” 、“ ”。
22、 、“ ” 、“” 、“” 和 “ ” 中的任一种 ； 纤维素膜层上 含有两条 / 个检测印迹时， 检测印迹、 对照印迹的排列形式为 “” 、“十十十” 、“ ” 、“ ” 、“” 、“” 和 “ ” 中的任一种。 0011 在所述样品吸附纤维层、 金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜， 在样品 吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线。 0012 所述试纸条的制备方法， 其特征是 ： 该方法包括以下步骤 ： （1） 大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原的 制备 ； （2） 胶体金标记的葡萄球菌蛋白 A 的制备 ： 以柠檬酸钠还原。
23、法制备胶体金， 进而获得胶 体金标记的 SPA ； （3） 羊抗或兔抗 SPA 的 IgG 抗体的制备 ： 用所得的大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白 VP1 抗原和非结构蛋白 3ABC 抗原中的一种或两种分别在纤维素膜层上制成检测印迹， 用羊抗或兔抗小鼠 IgG 抗体在纤 维素膜层上制成对照印迹 ； 将胶体金标记的葡萄球菌蛋白 A 用于制备金标抗体纤维层， 然 后将支撑层、 吸附层和保护层依次组装成试纸条。 0013 所述试纸条的制备方法中， 大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白 VP1 抗 说 明 书 CN 102818898 A 5 3/8 页 6 原的制备方法如下 ： 根据 。
24、O 型 FMDV VP1 模板基因序列设计一对特异性引物 ： 上游引物 5 ATAGGATCCA TGACCACTGCTACCGGGGAGTC3 引入酶切位点BamHI， 下游引物 5 ATAAAGCTTCAAGAGCTGC TTTGCGGGTG3 引入酶切位点HindIII ； 以重组质粒 pMD18T-VP1 为模板， 进行 PCR 扩增， 获 得VP1 基因 ； PCR 产物经BamHI 和HindIII 双酶切消化克隆到PET-28a 载体中， 转化大肠 杆菌， 将重组菌在LB培养基中培养至OD600 达到0.6 时， 加入终浓度为0.5mmol/L 的异丙 基-D-硫代吡喃半乳糖苷诱。
25、导剂， 在37诱导表达6小时， 将表达菌液离心， 收获细菌沉 淀 ； 将得到的菌体重悬于 20 毫升缓冲液中， 超声破碎后离心收集沉淀， 用洗液洗涤包涵体 5 次， 将沉淀悬于 20 毫升悬浮液中洗涤 1 次， 最后离心沉淀得到纯化后的包涵体 ； 将纯化后 的包涵体溶于 pH 为 8.0 的变性剂中， 于 4搅拌 10 小时， 离心去除不溶物， 得到变性蛋白 ； 取 90 毫升变性蛋白装入透析袋， 并将透析袋放入 1.8 升复性缓冲液中， 4条件下搅拌透 析， 每 5 小时换液一次， 换液 4 次后用 1.8 升 PBS 透析 4 次， 前两次透析 12 小时 / 次， 后两 次透析 6 小时。
26、 / 次 ； 收集透析袋内的液体， 经 10000 转 / 分钟、 4 离心 10 分钟， 弃去沉淀， 将上清用 0.45 微米滤膜过滤 ； 用 20KD 的浓缩管浓缩， 3000 转 / 分钟、 4离心 30 分钟， 收 集浓缩蛋白， 于 -20冷冻保存。 0014 所述试纸条的制备方法中， 大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒非结构蛋白 3ABC 抗原的制备方法如下 ： 将重组质粒 pGEM-T-3ABC 用 SalI 和 BglII 酶切消化， 回收目的片段 3ABC ； 用 XholI 和 BglII 对表达载体 pTriEx-4Neo 进行消化， 用 T4 DNA Ligase 连接后，。
27、 转化大肠杆菌菌 株， 得到重组菌， 将重组菌接种到 LB 培养液中， 37、 250 r/ min 摇至 OD600 达 0.5 ； 加入 异丙基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷诱导剂， 使其浓度为 0.5mmol/L， 37诱导表达 6 小时， 将 表达菌液离心， 收获细菌沉淀 ； 将得到的菌体重悬于 20 毫升缓冲液中， 超声破碎后离心收集沉淀， 用洗液洗涤包涵体 5 次， 将沉淀悬于 20 毫升悬浮液中洗涤 1 次， 最后离心沉淀得到纯化后的包涵体 ； 将纯化后 的包涵体溶于 pH 为 8.0 的变性剂中， 于 4搅拌 10 小时， 离心去除不溶物， 得到变性蛋白 ； 取 90 毫升变性蛋白。
28、装入透析袋， 并将透析袋放入 1.8 升复性缓冲液中， 4条件下搅拌透 析， 每 5 小时换液一次， 换液 4 次后， 用 1.8 升 PBS 透析 4 次， 前两次透析 12 小时 / 次， 后两 次透析 6 小时 / 次 ； 收集透析袋内的液体， 经 10000 转 / 分钟、 4 离心 10 分钟， 弃去沉淀， 将上清用 0.45 微米滤膜过滤 ； 用 20KD 的浓缩管浓缩， 3000 转 / 分钟、 4离心 30 分钟， 收 集浓缩蛋白， 于 -20冷冻保存。 0015 所述缓冲液的组成为 ： 10 mmol/L 的 Tris-HCl、 150 mmol/L NaCl、 10 mmo。
29、l/L EDTA、 10 % 体积的甘油、 2 mmol/L DTT ； 所述洗液的组成为 ： 1 % 体积的 Triton-100、 50 mmol/L Tris-HCl、 100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L EDTA、 2 mmol/L DTT ； 所述悬浮液的组成 为 ： 50 mmol/L Tris-HCl、 100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L EDTA、 2 mmol/L DTT。 0016 所述变性剂的组成为 ： 尿素 8mol/L、 NaCl 0.5mol/L、 Tris-HCl 20mmol/L、 EDTA 20mmol/L、 SDS 2% 。
30、； 所述复性缓冲液的组成为 ： Tris-HCl 50mmol/L pH 8.0、 NaCl 10mmol/ L、 EDTA 10 mmol/L、 DTT 2mmol/L、 氧化型谷胱甘肽 1 mmol/L、 还原型谷胱甘肽 1 mmol/L、 PMSF 0.5 mmol/L。 说 明 书 CN 102818898 A 6 4/8 页 7 0017 本发明的积极有益效果 ： 1、 联合检测， 高效实用 ： 本发明的试纸条首次利用原核表达的口蹄疫病毒结构 蛋白和非结构蛋白作为检测线， 达到了一步检测口蹄疫病毒感染抗体和疫苗免疫抗体的目 的。其中结构蛋白抗体检测能够监控动物的免疫状态和抗体水平， 。
31、非结构蛋白抗体检测技 术为区分感染动物和免疫动物提供依据， 结构蛋白和非结构蛋白检测技术的结合达到了一 步检测 FMDV 免疫抗体水平以及区分 FMDV 感染动物和疫苗免疫动物的目的。因此本发明的 试纸条检测效率高， 具有重要的实际应用价值。 0018 2、 检测特异性强、 敏感性高 ： 本发明试纸条以胶体金标记的 SPA 为基础制备而成， 金标 SPA 中的金颗粒与抗原或 SPA 分子之间无共价键形成， 二者通过异性电荷间的范德华 力相结合， 胶体金对大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白 VP1 抗原和非 结构蛋白 3ABC 抗原的特异性影响很小， 也不影响 SPA 与抗体的结合。
32、及抗体与抗原的结合， 且具有较高的标记率。因此， 本发明的试纸条具有较高的特异性和敏感性， 可检测到 2 纳克 的相应抗体蛋白。 0019 3、 操作简便、 快速 ： 本发明的试纸条检测过程中无需附加其它仪器和试剂， 只要将 其测试端插入待检血清中 30 秒左右， 等 5 分钟左右即可判定检测结果。 0020 4、 结果显示直观、 准确 ： 试纸条以显示棕红色的检测印迹和对照印迹作为检测的 阳性和阴性标记， 即在纤维素膜层上只显示一条棕红色对照印迹 C， 表示在被检血清中既无 FMDV 感染抗体也无 FMDV 疫苗免疫抗体， 即被检动物无 FMDV 感染也无 FMDV 免疫或免疫不 合格 ； 。
33、若在纤维素膜层上显示一条棕红色对照印迹 C 和两条棕红色检测印迹 P、 J， 则表示被 检动物有FMDV感染 ； 若在纤维素膜层上显示一条棕红色对照印迹C和一条棕红色检测印迹 P， 则表示在被检血清中含有 FMDV 疫苗免疫抗体 ； 结果判定直观、 准确、 简单明了， 不易出现 假阴性和假阳性的误判。 0021 5、 生产系统可靠 ： 本发明中的检测印迹采用大肠杆菌表达系统作为生产系统， 该 表达系统的研究较为深入， 已经过反复验证， 作为生产系统时培养条件简单、 基因操作容 易， 从构建到产物纯化周期较短， 成本低， 产量高， 适合于工业化应用。 0022 6、 投资少， 成本低 ： 使用本。
34、发明试纸条不需要另配其它仪器、 设备和试剂， 节省大 量仪器、 设备和附加试剂费用 ； 一条试纸条一次可以检测一种或两种抗体， 专业和非专业人 士均可随时随地进行实时在线检测， 无需支付专家诊断费及相关费用， 可节省检测成本， 降 低检测费用。 0023 7、 应用范围广， 便于推广 ： 本发明的试纸条操作简单成 “一步式” 、“傻瓜式” ， 而且 方便携带和保存， 能满足不同层次人员的需要， 包括专业化验、 海关检疫、 卫生防疫、 质量监 测、 畜产品加工、 集约化养殖到个体养殖等， 具有广阔的市场前景和较好的经济、 社会效益。 附图说明 0024 图 1 本发明试纸条的结构示意图 ； 图 。
35、2 本发明试纸条的俯视结构示意图。 具体实施方式 0025 以下实施例是为了进一步说明本发明， 并不表示对本发明的限制。文中如没有特 说 明 书 CN 102818898 A 7 5/8 页 8 别说明， 其中的百分含量均为质量百分含量。 0026 要制备一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条， 先制备大肠杆菌表达 系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白 VP1 抗原和非结构蛋白 3ABC 抗原， 以及抗 SPA 的 IgG 抗体， 然后制备金标抗体纤维层、 检测印迹和对照印迹。 0027 1、 羊抗或兔抗 SPA 的 IgG 抗体的制备 ： 以每公斤体重 50 微克 SPA 的用量， 经。
36、皮下和肌肉注射阴性健康羊 （或家兔） 3 4 次， 末次免疫20天后静脉采血， 以ELISA测定其血清抗体效价在1 ： 2000以上， 心脏采血或颈动 脉放血， 收集其高免血清。取 1 份血清加 2 份 PBS 液混匀， 加等体积的饱和硫酸铵液混匀， 置 4冰箱内 2 小时， 在 4、 10000 转 / 分钟离心 15 分钟， 弃上清液 ； 以适量 PBS 液溶解沉 淀， 加饱和硫酸铵溶液至其最终浓度为 33%， 置 4冰箱内 2 小时， 在 4、 10000 转 / 分钟条 件下离心15分钟， 弃上清液， 以少量PBS液溶解沉淀， 置4冰箱内用PBS液过夜透析， 换液 2 3 次， 在 4。
37、、 10000 转 / 分钟离心 15 分钟， 收集上清液， 以紫外分光光度计测定其蛋白 浓度。以饱和硫酸铵法提取的羊 （或兔） 抗 SPA 的 IgG 抗体， 用于制备对照印迹。 0028 2、 大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白 VP1 抗原和非结构蛋白 3ABC 抗 原的制备 ： （1） 猪口蹄疫病毒结构蛋白 VP1 在大肠杆菌中的表达及纯化 根据O 型FMDV VP1模板基因序列设计一对特异性引物 ： 上游引物为5 ATAGGATCCATGA CCACTGCTACCGGGGAGTC3 引入酶切位点BamHI， 下游引物为 5 ATAAAGCTTCAAGAGCTGCTTTGCG G。
38、GTG3 引入酶切位点HindIII。 以含VP1 基因的重组质粒pMD18T-VP1为模板， 经PCR 扩增 获得 VP1 基因。其中 PCR 反应体系为 ： 模板 pMD18T -VP1 0.5 微升， 上游引物 0.8 微升， 下游引物 0.8 微升， Ex Taqase 预混酶 25 微升， 双蒸水 22.9 微升。扩增程序 ： 94 预变 性 4 分钟， 循环一次 ； 94变性 45 秒， 60退火 45 秒， 72延伸 1 分钟， 共循环 35 次 ； 72 延伸 10 分钟。PCR 扩增所得的 VP1 基因经BamHI 和HindIII 双酶切消化克隆到 PET-28a 载体中，。
39、 转化大肠杆菌菌株， 将重组菌在含有氨苄青霉素的 LB 培养基 （胰蛋白胨 10g/L、 酵 母提取物 5g/L、 氯化钠 10g/L、 氨苄青霉素 mg/L） 中培养至 OD600 达到 0.6 时， 加入异丙 基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷诱导剂， 使其终浓度为 0.5mmol/L， 37诱导表达 6 小时， 将表 达菌液离心， 收获细菌沉淀。 0029 将菌体重悬于 20 毫升缓冲液中 （缓冲液成分 ： 10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、 150 mmol/L NaCl、 10 mmol/L EDTA、 10 % 甘油、 2 mmol/L DTT、 0.5 mmol/L 。
40、PMSF） 超声破碎后， 离心收集沉淀， 用洗液 （洗液成分 ： 1 % 体积的 Triton-100、 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、 100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L EDTA、 2 mmol/L DTT） 洗涤包涵体5次 ； 然后将沉淀于20毫升 悬浮液中洗涤1次 （悬浮液成分 ： 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、 100 mmol/L NaCl、 10 mmol/ L EDTA、 2 mmol/L DTT） ， 最后离心沉淀即为纯化后的包涵体。 0030 将纯化后的包涵体溶于 pH 为 8.0 的变性剂中 （变性剂成分 ： 。
41、尿素 8mol/L、 NaCl 0.5mol/L、 Tris-HCl 20mmol/L、 EDTA 20mmol/L、 2% 的 SDS） ， 于 4 搅拌约 10 小时， 溶解 变性， 离心去除不溶物， 得到变性蛋白 ； 将 90 毫升变性蛋白装入透析袋中， 放入 1.8 升复性 缓冲液 （缓冲液成分 ： 50mmol/L Tris-HCl pH 8.0、 10mmol/L NaCl、 10 mmol/L EDTA、 2mmol/ L DTT、 1 mmol/L 氧化性谷胱甘肽、 1 mmol/L 还原性谷胱甘肽、 0.5 mmol/L PMSF） 中， 4 下磁力搅拌透析， 每 5 小时换。
42、液一次， 换液 4 次后用 1.8 升 PBS 透析 4 次， 前两次 12 小时 / 说 明 书 CN 102818898 A 8 6/8 页 9 次， 后两次 6 小时 / 次。收集透析袋内液体， 10000 转 / 分钟、 4 离心 10 分钟， 弃去沉淀， 将上清液用 0.45 微米滤膜过滤 ； 然后用 20KD 浓缩管浓缩， 3000 转 / 分钟、 4 离心 30 分 钟， 收集浓缩蛋白， -20 冻存， 用于制备检测印迹。 0031 （2） 猪口蹄疫病毒非结构蛋白 3ABC 在大肠杆菌中的表达及纯化 将含 3ABC 基因的重组质粒 pGEM-T-3ABC 用 SalI 和 Bgl。
43、II 酶切消化， 回收目的基因 片段 3ABC。用 XholI 和 BglII 对表达载体 pTriEx-4Neo 进行消化， 使其产生两个与目的 片段相同的粘性末端 ； 用 T4 DNA Ligase 连接两粘性末端， 转化大肠杆菌菌株， 将 30 微升 重组菌接种到 30 毫升含有羧苄青霉素的 LB 培养基 （胰蛋白胨 10g/L、 酵母提取物 5g/L、 氯化钠 10g/L、 羧苄青霉素 50mg/L) 中， 37、 250 转 / 分钟摇至 OD600 达 0.5 ； 加入异丙 基-D- 硫代吡喃半乳糖苷诱导剂， 使其终浓度为 0.5mmol/L， 于 37诱导表达 6 小时， 将 表。
44、达菌液离心， 收获细菌沉淀。 0032 将菌体重悬于 20 毫升缓冲液中 （缓冲液成分 ： 10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、 150 mmol/L NaCl、 10 mmol/L EDTA、 10 % 甘油、 2 mmol/L DTT、 0.5 mmol/L PMSF） 超声破碎 后， 离心收集沉淀， 用洗液洗涤包涵体 5 次 （洗液成分 ： 1 % 体积的 Triton-100、 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、 100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L EDTA、 2 mmol/L DTT） ； 然后将沉淀于 20 毫升悬浮液中洗涤 1 。
45、次 （悬浮液成分 ： 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、 100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L EDTA、 2 mmol/L DTT） ， 最后离心沉淀即为纯化后的包涵体。 0033 将洗涤纯化后的包涵体溶于 pH 为 8.0 的变性剂中 （变性剂成分 ： 尿素 8mol/L、 NaCl 0.5mol/L、 Tris-HCl 20mmol/L、 EDTA 20mmol/L、 2% SDS） ， 于 4 搅拌约 10 小时， 溶解变性， 离心去除不溶物， 得到变性蛋白 ； 将 90 毫升变性蛋白装入透析袋中， 放入 1.8 升 复性缓冲液 （缓冲液成分 ： 50。
46、mmol/L Tris-HCl pH 8.0、 10mmol/L NaCl、 10 mmol/L EDTA、 2mmol/L DTT、 1 mmol/L 氧化性谷胱甘肽、 1 mmol/L 还原性谷胱甘肽、 0.5 mmol/L PMSF） 中， 4下磁力搅拌透析， 每 5 小时换液一次， 换液 4 次后用 1.8 升 PBS 透析 4 次， 前两次 12 小时 / 次， 后两次 6 小时 / 次。收集透析袋内液体， 10000 转 / 分钟、 4 离心 10 分钟， 弃 去沉淀， 将上清用 0.45 微米滤膜过滤 ； 用 20KD 浓缩管浓缩， 3000 转 / 分钟、 4 离心 30 分 。
47、钟， 收集浓缩蛋白， -20 冻存， 用于制备检测印迹。 0034 3、 金标 SPA 玻璃棉的制备 ： 以柠檬酸钠还原法制备金溶胶 ： 在50100毫升沸腾的0.010.05%氯金酸水溶液中 加入24毫升0.52%的柠檬酸三钠溶液， 获得直径15纳米左右的胶体金 ； 以0.1mol/L 的K2CO3调胶体金pH至8.59.5， 以1:10001300的标记比将待标记的SPA加入pH8.5 9.5 的金溶胶中， 标记 10 分钟后加入 20% 的 PEG10000 至其最终浓度为 0.05%， 4、 1500 3000 转 / 分钟离心 20 分钟， 除去未结合的胶体金颗粒， 4、 15000。
48、 转 / 分钟离心 1 小时， 弃 上清液， 获得胶体金标记的 SPA ； 将 1:100 500 稀释的胶体金标记 SPA 吸附于精制玻璃棉 中， 4低温真空干燥， 制备出金标 SPA 玻璃棉。 0035 4、 本发明试纸条的检测原理 ： 将试纸条测试端插入待测血清， 待检血清通过虹吸带动待检抗体及金标 SPA 玻璃棉中 的金标 SPA 一起向纤维素膜层扩散， 最终渗入手柄端的吸水材料层， 扩散过程中待检抗体 与金标 SPA 相结合， 该结合物进而与纤维素膜上的表达原检测印迹结合， 从而显示出棕红 色的检测印迹 P 和 / 或 J ； 而羊 （兔） 抗 SPA 的 IgG 抗体可与金标 SP。
49、A 结合， 形成棕红色对照 说 明 书 CN 102818898 A 9 7/8 页 10 印迹 C。如果待检血清中没有 FMDV 病毒抗体和疫苗抗体， 试纸条只显示一条棕红色对照印 迹 C ； 如果血清中含有抗 FMDV 病毒抗体和 / 或疫苗抗体， 则分别与其金标 SPA 结合， 再与纤 维素膜上的相应抗原检测印迹 P 和 / 或 J 结合， 显示棕红色检测印迹， 为阳性标记 ； 如果纤 维素膜上没有任何棕红色印迹显示， 则表明试纸条已失效或操作失误。 0036 5、 本发明试纸条的检测方法 ： （1） 检测样品的制备 ： 无菌取被检动物的血液， 并分离血清， 以生理盐水作 1: 200 倍的 稀释血清， 得到待测样品。 0037 （2） 检测步骤 ： 将试纸条测试端插入待检测血清中， 插入深度不超过标记线， 约 30。