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1、(10)申请公布号 CN 102575977 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102575977 A *CN102575977A* (21)申请号 201080046308.X (22)申请日 2010.10.14 0904966 2009.10.16 FR G01N 15/14(2006.01) (71)申请人 原子能和能源替代品委员会 地址 法国巴黎 (72)发明人 C阿利耶 (74)专利代理机构 北京戈程知识产权代理有限 公司 11314 代理人 程伟 王锦阳 (54) 发明名称 光学上检测溶解的微米级物体的方法 (57) 摘要 本发明的主要领域为接触成像装置。该方法。
2、 涉及通过该接触成像装置对微米级或亚微米级粒 子或生物进行的光学检测， 所述粒子或生物沉浸 在液滴 (G) 中， 并且该检测通过光敏单元或像点 的矩阵来执行。该方法包括在液滴蒸发期间所执 行的一个检测步骤或一系列检测步骤。其还可以 包括在液滴蒸发之后所执行的检测步骤。在一些 条件下， 该方法允许重构蒸发前的初始液滴中粒 子或生物的三维分布。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.04.13 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2010/065382 2010.10.14 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/045360 FR 2011.04.21 (51。
3、)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种光学检测方法， 其通过接触成像装置来检测微米级或亚微米级粒子或生物， 所 述粒子 (P) 或生物沉浸在液滴 (G) 中， 并且该检测通过光敏单元或像点的矩阵 (3) 来执行， 其特征在于， 所述方法包括至少一个在液滴蒸发的同时所执行的第一检测步骤。 2. 根据权利要求 1 所述的光学检测方法， 其特征在于， 所述方法包括至少一个在液滴 蒸发之后所执行的第二检测步骤。 3. 根据权利要求 1 所。
4、述的光学检测方法， 其特征在于， 在液滴外围， 液滴与其被蒸发部 分分离的界面 (Z) 处执行检测。 4. 根据以上权利要求中的任一项所述的光学检测方法， 其特征在于， 所述方法包括在 液滴蒸发的同时以一定时间间隔所执行的一系列检测步骤。 5. 根据权利要求 4 所述的光学检测方法， 其特征在于， 每一个检测步骤允许测量在预 定平面中发现的粒子或生物的分布， 所述平面根据蒸发时间而与像点矩阵相隔一定距离， 将所获得的所述粒子或生物的分布组合在一起允许重构在初始未蒸发液滴中粒子或生物 的三维分布。 6. 根据以上权利要求中任一项所述的光学检测方法， 其特征在于， 液体为水或生物缓 冲液。 7. 。
5、根据以上权利要求中任一项所述的光学检测方法， 其特征在于， 生物缓冲液为 “Tris” ， 即三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷的缩写。 8. 根据以上权利要求中任一项所述的光学检测方法， 其特征在于， 液体通过添加润湿 剂来润湿。 9. 根据权利要求 8 所述的光学检测方法， 其特征在于， 液体中润湿剂的体积浓度在万 分之几与百分之几之间。 10. 根据以上权利要求中任一项所述的光学检测方法， 液滴放置在透明载片上或传感 器的表面上。 11. 根据以上权利要求中任一项所述的光学检测方法， 其特征在于， 承载液滴的载片是 功能化的。 12.根据权利要求10或11所述的光学检测方法， 液滴放置在相对于。
6、周围环境冷却的保 持件上。 权 利 要 求 书 CN 102575977 A 2 1/7 页 3 光学上检测溶解的微米级物体的方法 技术领域 0001 本发明领域在于， 用于生物诊断和分析的接触成像装置和检测方法。 背景技术 0002 在用于生物诊断的光学成像领域， 如果关注除接触成像以外的特定检测， 则通常 使用两种方法。这些方法是流式细胞测量术和荧光分子成像。 0003 流式细胞测量术是对拦截激光光束的各种细胞进行计数、 特征化并且分类的有效 技术。通过分析所产生的衍射图， 可以确定细胞的尺寸。荧光测量还允许区分细菌的各种 族。该技术的缺点在于， 需要昂贵且复杂的设备。另一个缺点在于， 被。
7、扫描的立体角相对较 小， 从而限制了可研究区域。 0004 荧光分子成像因其非常有效， 因此是广泛用于生物诊断的方法。荧光测量对以下 单事件敏感 ： 即使用荧光标记利用显微镜可以检测各个分子。 为了获得较好的结果， 必须将 用于激发荧光分子的能量 ( 称为 “激发” 能量 ) 与由荧光分子发出的能量 ( 称为 “发射” 能 量 ) 完全分开。尽管目前存在极好的滤光器， 但这些滤光器对光束有限制， 具体而言要求滤 光器具有较小的光束孔径。从而， 本方法使用的光学系统较复杂且庞大。荧光成像还需要 预先为待分析介质添加荧光团， 从而该方法是入侵的。 0005 从而， 希望用具有广泛观察区域的非入侵接。
8、触成像装置来代替这些复杂且昂贵的 技术。 0006 这些技术不断发展， 因为它们允许在不需要上述先进光学系统的情形下对细胞、 细菌或更一般地讲微米级粒子进行检测。图 1 示出了接触成像装置的示意图。该装置包 括 ： 光源1， 其可以是小型光源， 例如发光二级管 ； 光阑2， 其限制光源的孔径 ； 以及成像器或 传感器3， 其可以是CCD(电荷耦合器件)或CMOS(互补型金属氧化物半导体)像点的矩阵。 该成像器主要包括与每一个像点相关的微型透镜。光阑 2 不是必要的， 但其存在是有益的。 在该矩阵 3 与光源 1 之间插有承载待研究的对象 5 的透明显微镜载片 4。 0007 该对象是包含微米级。
9、粒子的溶液， 这些粒子可以是生物粒子， 诸如细胞或细菌， 或 者诸如微球体的其它粒子。被分析液滴放在透明载片 4 上， 并且液滴的弯月面与周围气体 接触， 该气体可以是空气。矩阵 3 连接至图像显示器和 / 或处理系统， 图 1 中未示出。二极 管 1 与物体载片 4 相距的距离优选大于 1cm， 并且可以为例如几 cm， 典型地在 2cm 与 5cm 之 间。对象与传感器表面之间的距离在 0.1mm 与 2mm 之间。尽管这被称为接触成像， 但待研 究物体没有放置成与传感器直接接触， 而是相隔上述距离。载片由诸如二氧化硅或石英的 透明材料制成， 并且载片的厚度在几十微米与 1mm 之间变化。。
10、在一些情形中， 该没有放大光 学系统的极简单装置可以是诸如流式细胞测量术、 高分辨率光学显微镜或荧光分子成像的 常规光学计数方法的替代。 0008 过去几年， 几个团队已使用接触成像取得了惊人的成果。如此， 设在美国大学 UCLA( 加州大学洛杉矶分校 ) 的团队使用接触成像来检测并且识别细菌。该方法在下述公 开物中进行了描述 ： Sungkyu Seo 等人的 “Lensfree holographic imaging for on-chip 说 明 书 CN 102575977 A 3 2/7 页 4 cytometry and diagnostics( 用于片上细胞计数和诊断的无透镜全息。
11、成像 )” ， The Royal Society of Chemistry， Dec.5， 2008-2009， 9， 777-787。在该公开物所描述的装置中， 细菌 置于两个板之间的液体中， 该组件放置在像点矩阵上。用直径为 100m 的光阑过滤单色光 源， 以获得较好的空间相干性。如此， 在像点矩阵中获取每一个被沉浸细胞的衍射图。根据 作者所述， 所获得的衍射图足于对菌种进行很好的分辨进而彼此区分开来， 从而能够对各 个细菌进行具体计算。 0009 UCLA 团队提出的方法非常好。然而， 存在以下缺点 ： 需要使用高灵敏度 CCD 传感 器， 从而成本必然很高。如此， 所使用的传感器为。
12、 Kodak Kai-10002 高灵敏度 CCD 传感器。 0010 如果使用诸如低成本的CMOS或CCD传感器的标准传感器， 仍可以观察直径为1m 的各种微米级粒子 ( 诸如硅醇微球体、 乳液微球体或大肠杆菌 ) 的衍射图。然而， 检测效率 非常低， 最好约 1。如此， 图 2 示出了沿传感器轴线 x 获取的且经过粒子 P 的中心的信号 S。在此， 信号 S 表示由各个像素测得的沿纵坐标轴的灰度级， 像素构成横坐标轴， 即图 2 示 出了曲线图。可以看出， 信噪比非常低， 刚好允许检测粒子。 0011 根据本发明的方法不具有这些缺点。实际上， 其允许利用接触成像装置而不需要 高灵敏度传感器。
13、来检测微米级粒子。根据本发明的方法的主要特征在于， 在具有待被检测 的微米级粒子 ( 细菌、 细胞、 微球体等 ) 的液滴蒸发时或所述液滴蒸发之后进行测量。如 此， 与现有技术中的测量不一样， 液滴没有位于两个板之间。另外， 液滴必须与气体 ( 例如， 空气 ) 接触， 以使液滴能够蒸发。这是因为， 已经发现在蒸发期间或蒸发后进行检测将很有 效。 发明内容 0012 更具体而言， 本发明主题是通过接触成像装置检测微米级或亚微米级粒子或生物 的光学检测方法， 所述粒子或生物沉浸在液滴中， 并且通过光敏单元或像点的矩阵来执行 检测， 其特征在于所述方法包括至少一个在液滴蒸发的同时所执行的第一检测步。
14、骤。液滴 可以放在载片上或直接放在成像器上， 所述载片与成像器接触或与成像器相距一小段距 离。 0013 有利地， 所述方法包括至少一个在液滴蒸发之后所执行的第二检测步骤。 0014 有利地， 在液滴外围， 液滴与其被蒸发部分分离的界面处执行检测。 0015 有利地， 所述方法包括在液滴蒸发时和 / 或液滴蒸发之后以一定时间间隔执行的 一系列检测步骤， 每一个检测步骤允许测量在预定平面中发现的粒子或生物的分布， 所述 平面根据蒸发时间而与像点矩阵相隔一定距离， 将所获得的所述粒子或生物的分布组合在 一起允许重构在初始未蒸发液滴中粒子或生物的三维分布。 0016 有利地， 液体为水或当待被检测粒。
15、子为细菌时为生物缓冲液， 例如 “Tris” ， 即三 (羟甲基)氨基甲烷的缩写。 根据优选实施例， 液体包括润湿剂， 例如Tween 20(即， 聚氧乙 烯 (20) 山梨糖醇酐单月桂酸酯 )。 0017 最后， 可以对液滴保持件， 即透明载片或传感器表面进行功能化。 可以使保持件为 亲水性。也可以将保持件冷却至周围温度以下。 附图说明 说 明 书 CN 102575977 A 4 3/7 页 5 0018 在阅读由非限制性实例给出的以下说明的基础上， 通过附图来更好地理解本发 明， 并且其它优点将变得清楚， 其中 ： 0019 - 图 1 示出了接触成像装置 ； 0020 - 图 2 示出。
16、了利用低灵敏度像点矩阵所获得的检测信号 ； 0021 - 图 3 示出了根据本发明的检测方法的原理 ； 0022 - 图 4 示出了使用根据本发明的方法利用低灵敏度像点矩阵获得的检测信号 ； 0023 - 图 5 示出了实现根据本发明的方法的连续检测步骤 ； 0024 - 图 6 示出了表示在生理盐水缓冲液滴中并且在由液滴蒸发所形成的膜中的细菌 的观测结果的示意图。曲线图 ( 图 6a 和图 6d) 示出了作为沿水平轴 x 的位置的函数的被 检测强度 ； 0025 - 图 7 示出了表示在蒸发之前和之后生理盐水缓冲液滴中的细菌的观测结果的示 图， 所述液滴堆放在亲水或疏水载片上。曲线图 7a 。
17、和 7c 示出了作为与液滴重合的点处的 时间的函数的被检测强度 ； 以及 0026 - 图 8 示出了直径为 500nm 的聚苯乙烯粒子的图像和该图像沿轴 x 的水平剖面。 具体实施方式 0027 从以上可以看出， 使用低灵敏度传感器不能够获得较高的信噪比。根据本发明的 方法能够使信噪比明显增加， 从而使检测效率明显增加。根据现有技术的检测系统检测液 滴中的微粒或微生物。然而， 当粒子被沉浸时， 很难对粒子进行检测， 除非使用高灵敏度传 感器。如此， 图 3 的左方示图示出了， 在时间 T 处包含粒子 P 的液滴 G 的局部图像。上述接 触成像装置的传感器用于采集该图像。如果传感器的灵敏度太低。
18、， 则不能辨认粒子。 0028 然而， 当液滴蒸发时， 在空气 - 液体界面上， 更具体而言粒子位于液滴的弯月面中 时， 粒子、 细菌或微球体非常清晰地显现。如此， 图 3 右方的示图示出了在时间 T+T 处上 述液滴 G 在部分蒸发之后的局部图像。粒子 P 在液滴已经蒸发的区域 Z 中清晰地显现。字 母 L 所标示的位于右上角的部分与载片中初始没有溶液覆盖的部分对应。 0029 如此， 图 4 示出了沿传感器的轴线 x 所获得的且经过粒子 P 的中心的信号 S 的剖 面图。可以看出， 此时信噪比足够高， 以允许粒子被检测。信噪比足够高， 以便可以设想大 部分 ( 大约百分之几十 ) 被沉浸细。
19、胞的检测。该方法可重现。因此， 根据本发明的方法非 常易于实现。其特征在于， 在液滴蒸发的同时进行测量。一个测量或检测步骤的特征在于， 记录接触成像装置的成像器的像点所检测的信号并且分析信号的振幅。 0030 蒸发期间被照射粒子之间的对比度增加在物理上解释很复杂。 如实验实例的以下 描述所示， 该增加可以归因于覆盖粒子的残留薄膜结构， 该膜在液滴蒸发之后保留一段时 间。 根据形成液滴的液体在支撑液滴的载片上的润湿性， 该膜或较短暂， 在几秒甚至更少时 间内消失， 或者该薄膜持续保留若干秒， 甚至几十秒或分钟。 覆盖粒子的残留膜似乎起到微 型透镜的作用， 从而允许在信噪比异常高的情形下检测细菌。。
20、 实际上， 当粒子处于蒸发线上 时信号强度最大化， 并且当粒子处于液滴的弯月面中时信号强度增强三倍。 0031 在一些情况下可能出现， 当液滴蒸发时， 减小的实质上是液滴的高度， 蒸发从液滴 的顶部向底部进行， 而非从液滴的边缘向中心进行。这在例如当载片倾斜几度时出现。该 效应可以用于重构在初始未蒸发的液滴中粒子或生物的三维分布。为达到该目的， 只需在 说 明 书 CN 102575977 A 5 4/7 页 6 液滴蒸发的同时以固定的时间间隔执行一系列检测步骤。 每一个检测步骤允许测量预定平 面中粒子或生物的分布， 所述平面根据蒸发时间而与像点矩阵保持一定距离， 将所获得的 粒子或生物的所述。
21、分布组合起来， 允许重构在初始未蒸发液滴中粒子或生物的三维分布。 图 5 示出了该原理。在该图中示出了包含粒子的液滴的蒸发期间的三个不同时间点， 一侧 示出了一部分液滴的三维示图， 另一侧示出了由接触成像装置的矩阵检测器采集的相应图 像。 应当注意， 三维示图不表示液滴的实际尺寸或者液滴的分布。 在时间T0处， 仅有两个粒 子从液滴中露出， 并且能够在检测图像中辨认。它们由白色圆圈表示。在时间 T1 处， 在蒸 发 30 秒之后， 更多粒子从液滴中露出， 并且能够在检测图像中辨认。最后， 在时间 T2 处， 在 蒸发 45 秒之后， 蒸发实际上已结束， 所有粒子都露出， 并且能够在检测图像中辨。
22、认。如此， 根据在时刻 T0、 T1、 T2 等采集的各个连续图像， 可以知道粒子在液滴中的三维分布。 0032 如果希望完全控制该方法， 则蒸发可以通过红外二极管或电热器来调节或通过将 气体吹过液滴的弯月面进行调节。加热装置也可以集成在衬底内。衬底可以是例如沉积有 ITO 薄膜 ( 铟锡氧化物 ) 的石英载片， 而该膜能够形成电阻。为了给出数量级， 根据液滴的 大小、 所使用液体和实验条件， 液滴蒸发所花费的时间从几秒至几十秒不等， 液滴的体积在 1l 和 20l 之间， 甚至更大。 0033 可以使用各种液体， 如 Tris( 三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷 ) 或净化水。Tris 具有以下。
23、 优点 ： 其是使细菌能够保存数天的盐溶液。因此 Tris 广泛用作生物缓冲液。优选地， 如后 文所述， 承载液滴的载片不能太疏水， 甚至可亲水。该方法用于各种粒子。通过实例来说明 直径为 1m 的硅醇微球体、 直径为 1m 的乳液微球体和细菌。最后， 对大肠杆菌或枯草杆 菌 (Bacillus subtilus) 执行确证测试。该方法用于广泛地浓度范围， 从每个液滴包含一 个粒子至每个液滴包含十万个粒子。 0034 当然， 优选地来自光源的照明尽可能均匀。 换句话说， 以每一个点的强度大致相等 的方式照射弯月面的表面。 优选地， 照明具有一定的空间相干性， 就是说位于光源前方的光 阑具有较小。
24、的尺寸。例如， 可以使用直径为 100m 的光阑。 0035 在网络摄像机、 发光二极管、 光阑和玻璃载片的情形下， 图像捕捉装置因其仅仅包 括用于从低成本 CCD 传感器或 CMOS 传感器的像点上捕捉数字图像的电子卡而比较简单且 便宜。传感器的像素或像点的平均大小可以为约两微米至十微米。这些传感器比像素大小 不超过两微米的高灵敏度传感器花费更少。传感器为低成本 CMOS 或 CCD 传感器。 0036 可以利用功能化玻璃载片通过将特定细菌与细菌媒介隔离的抗体来改善检测。 然 后， 可以检测并识别被检测细菌， 识别依靠载片的功能化。 0037 使用诸如图 1 所示的装置来执行检测测试。光源 。
25、1 是所发出波长集中在 555nm 的 1.7W的发光二极管(K1Luxeon III)。 光源放置在衬底4上方10cm处。 衬底4是 70mm25mm0.15mm 的玻璃显微镜载片。传感器 3 是具有 8 比特动态范围的 800600 像 素的CMOS图像传感器。 每一个像素的大小为3m3m。 该传感器从网络摄像机(V-Gear TalkCam 2000) 上获取。为了将衬底 4 放置成尽可能接近光检测器 3， 将覆盖检测器的塑料 薄膜移除。 0038 将体积大约为 1l 的液体样品堆放在与传感器 3 对置的衬底 4 上。然后， 使液滴 能够在几分钟的时间段内蒸发。在实验中， 所使用溶液是 。
26、pH 值为 8 的 10mM Tris-HCl 盐 溶液。优选地， 可以添加 0.1 ( 体积 ) 且商标名为 Tween 20 的聚山梨醇酯 20( 聚氧乙烯 说 明 书 CN 102575977 A 6 5/7 页 7 (20) 山梨糖醇酐单月桂酸酯 )。 0039 图6a、 图6b和图6c分别示出了通过在光源和液体样品之间放置直径为100m的 光阑而产生空间相干性的光束来照射样品时所获得的水平剖面 PI、 图像和所述图像的三维 表示。希望， 通过这种方式来观察存在于液滴中的细菌所生成的衍射图。液滴的体积为约 1l。 0040 然后， 如 S.Su Seo 的 “Lensfree holo。
27、graphic imaging for on-chip cytometry and diagnostics( 用于片上细胞计数和诊断的无透镜全息成像 )” ， Lab Chip 9(6)， 777-87(2009) 所述， 观察全息衍射图。 0041 图 6d、 图 6e 和图 6f 分别示出了在未使用光阑的情形下用同一光源照射样品时所 获得的水平剖面 PI、 图像和所述图像的三维表示。液滴在生成这些图像之前蒸发。衬底足 够亲水， 以便在液滴蒸发的同时保持润湿膜覆盖衬底和堆放在衬底上的细菌。由于衬底亲 水并且样品溶液是润湿的且具有低表面张力， 因此该膜保持得更长， 因此被称为超润湿膜 结构。 。
28、0042 因使用亲水载片， 从而测试期间所实施的构造是有利的， 在该情形中， 玻璃在乙醇 中进行超声清洁和漂洗， 并且上述生物缓冲液通过添加润湿剂 (0.1的 Tween) 进行润湿。 观察到， 在诸如图 7 所示的构造中， 所形成的超润湿膜随着液滴的蒸发， 在适当位置保持很 长一段时间， 即几分钟， 甚至几小时。 0043 将图 6d、 图 6e 和图 6f 分别与图 6a、 图 6b 和图 6c 比较。可以看出， 从由润湿膜 覆盖的细菌的接触图像所获得的信噪比相对于沉浸在液滴中的细菌的接触图像增加了 20 倍， 从而能够准确地检测这些细菌。 0044 由溶液蒸发而产生的膜结构， 是根据本发。
29、明的方法的关键点之一。该膜用作形成 在细菌上方的一个或多个微型透镜。这解释了为什么可以用如此高 ( 约 45) 的信噪比来检 测细菌的原因。 0045 在这些实例中， 信噪比 (SNR) 定义如下 ： 0046 0047 其中 ： 0048 I 由图像的每一个像素测得的振幅 ； 0049 被视为代表噪声的区域中的像素的平均振幅 ； 以及 0050 被视为代表噪声的区域中的像素的振幅的标准偏差。 0051 当液滴蒸发时， 在细菌表面上观察到该膜结构。 根据所使用的溶液， 特别是溶液的 润湿性和表面张力性质， 膜保持更长或更短的时长。 为了确定该膜的厚度， 在直径不同的聚 合物微球体上执行测试。然。
30、后， 观察到， 当微球体的直径大于 5m 时， 膜经常破裂。从而， 断定该膜的厚度小于几微米， 甚至 5m。利用示意在图 1 中的上述装置生成图像可容易地 检测形成在衬底表面上的膜的破裂。 0052 利用上述缓冲液执行两个测试， 一个在疏水衬底上而另一个在亲水衬底上 ( 对于 所使用的缓冲溶液 )。措辞 “疏水” 和 “亲水” 理解为， 表示液滴与衬底接触时的接触角度分 别大于 90和小于 90， 这是普遍接受的定义。 0053 图 7a 和图 7b 示出了衬底疏水时所得到的结果。图 7a 示出了图 7b 中所示的细菌 说 明 书 CN 102575977 A 7 6/7 页 8 图像的水平剖。
31、面的时间进程， 剖面经过细菌图像的中心。在 t 48s( 图 7b-1) 时， 液滴蒸 发并且没有检测到明显的信号。在 t 48s 与 t 49s 之间 ( 图 7b-2)， 液滴的蒸发产生覆 盖细菌的短暂膜结构。实际上， 对应于该形成在细菌上的膜的影响， 观察到信号增加。由于 衬底疏水， 因此膜迅速消失， 这解释了被观察信号的强度在 t 48.5s( 图 7b-3) 时迅速减 小的原因。 0054 图 7c 和图 7d 示出了当支撑液滴的衬底亲水时所得到的结果。图 7c 示出了图 7d 中所示细菌图像的水平剖面 P 的时间进程， 剖面经过细菌图像的中心。在 t 7s 时， 液滴 蒸发并且没有。
32、检测到明显的信号 ( 图 7d-1)。在时间 t 7s 时， 细菌仅覆盖有薄膜 ( 图 7d-2)。由于衬底亲水， 因此膜在衬底表面上和细菌表面上保持很长一段时间 ( 图 7d-3)。 从而， 在比上述情形更长的时间段内观察到高强度信号， 此处时间段为几十秒。 在液滴完全 蒸发以后， 膜消失， 并且检测不到细菌。 0055 这些图证实， 根据本发明的方法允许在包含细菌的液滴蒸发的时刻， 特别在液滴 / 外部媒介界面到达细菌时即细菌仅仅覆盖有薄膜的时刻， 检测溶液中的细菌。根据溶液的 润湿性， 膜结构或短暂 ( 保持 1s 或 2s) 或持久。认为， 衬底上溶液的润湿性越好， 膜结构就 越持久。。
33、措辞 “持久” 理解为， 表示膜持续几十秒或甚至几分钟或数小时。 0056 从而， 当希望获取持久膜时， 优选地向溶液中添加润湿剂。 该添加剂例如为以上限 定浓度为 0.1 ( 体积 ) 的 Tween 20。 0057 测试中所选用的溶液为， 用蒸馏水稀释至10mM、 pH值为8的缓冲液Tris HCl， 采用 该缓冲液将获得尤其令人满意的结果。Tris 是三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷或 2- 氨 -2 羟基 -1， 3- 丙二醇的缩写。 0058 可以使用其它缓冲液。 当希望识别细菌时， 优选使用使细菌存活的生物缓冲液。 普 遍证明， 添加诸如 Tween 的润湿剂非常有用并且允许形成更持。
34、久的微型膜。该添加剂的体 积浓度例如从约万分之几至百分之几， 优选地从万分之几至千分之几。可以使用的其它缓 冲液可能涉及 PBS( 磷酸盐缓冲盐水 )， 或者用于非生物的蒸馏水。 0059 以上实例描述了对细菌的观察， 但本发明可应用于观察比细菌更小的粒子或生物 体。图 8 示出了对覆盖有超润湿膜的聚苯乙烯微球体进行观察所得到的图像 ( 图 8a) 和剖 面 PI( 图 8b)， 所述超润湿膜在如以上实例所述的同一生理盐水缓冲液的液滴蒸发之后形 成。该微球体的直径为 500nm。所检测到的信噪比仍然较高 ( 约 20)。 0060 此外， 通过将液滴保持件冷却到周围温度以下， 则液滴的蒸发将减。
35、慢并且残留膜 更持久。例如， 当周围温度为 20时， 保持件可以冷却至 5至 10之间的温度。 0061 如此， 还可以使用允许被检测信号的信噪比增加的被冷却成像器。 0062 作为非限制性实例， 与根据本发明的方法相关的工业应用涉及 ： 0063 - 在医院、 制药或食品加工环境中根据细菌和真菌含量来监测空气质量 ； 0064 - 用于涉及微生物、 细胞生物学和病理学的临床前研究的诊断测量和诊断工具 ； 以及 0065 - 测量体液中生物粒子的浓度。 0066 还可能涉及， 例如细菌尿路感染。对细菌进行尿检， 当发现单株细菌 ( 单种细菌 ) 菌尿症 (bactriurie monomicr。
36、obienne(une seule espce de bactrie) 具有大于 100 个细菌 /l 的大量细菌菌落并且伴随有大于 10 个白细胞 /l 的白细胞尿 ( 尿液中出现 说 明 书 CN 102575977 A 8 7/7 页 9 白血球 ) 或脓尿时能够确诊尿路感染。 0067 该测量可以利用根据本发明的方法来容易地执行。 说 明 书 CN 102575977 A 9 1/5 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102575977 A 10 2/5 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102575977 A 11 3/5 页 12 图 5 说 明 书 附 图 CN 102575977 A 12 4/5 页 13 图 6a 图 6b 图 6c 图 6d 图 6e 图 6f 图 7a 图 7b 说 明 书 附 图 CN 102575977 A 13 5/5 页 14 图 7c 图 7d 图 8a 图 8b 说 明 书 附 图 CN 102575977 A 14 。