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1、(10)申请公布号 CN 102539713 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102539713 A *CN102539713A* (21)申请号 201010584220.5 (22)申请日 2010.12.13 G01N 33/52(2006.01) G01N 21/31(2006.01) G01N 21/33(2006.01) C12Q 1/48(2006.01) C12Q 1/527(2006.01) C12Q 1/32(2006.01) (71)申请人 苏州艾杰生物科技有限公司 地址 215006 江苏省苏州市工业园区宏业路 128 号 B2 栋 (72)发明人 。
2、王尔中 (54) 发明名称 氨 ( 氨离子 ) 的测定方法与氨 ( 氨离子 ) 诊 断 / 测定试剂盒 (57) 摘要 本发明涉及利用酶比色法及酶联法技术的氨 ( 氨离子 ) 含量的测定方法、 试剂的组成及成分， 其测定的技术原理是依据氨激酶、 丙酮酸羧化酶、 苹果酸脱氢酶的系列催化反应完成， 本发明还涉 及一种氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒。本发明 的测定方法灵敏度高、 误差小， 因此本发明的测定 方法与试剂盒可以广泛地应用于临床医学 / 食品 检验。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求。
3、书 3 页 说明书 10 页 1/3 页 2 1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的氨 ( 氨离子 ) 浓度测定方法， 其测定的技术原理 是根据下述氨激酶、 丙酮酸羧化酶、 苹果酸脱氢酶的系列催化反应完成 ： 氨 + 腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸 + 磷酰胺 腺苷二磷酸 + 磷酸根 + 草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸 + 丙酮酸 + 二氧化碳 丙酮酸 + 二氧化碳 + 还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸 + 辅酶 2. 一种氨 ( 氨离子 ) 的测定方法， 其特征在于该方法的步骤如下 ： 2.1 样品准备 ： 2.1.1 标准样品的制备 将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中， 再将其浓度调整到 100 微摩尔。
4、 / 升 ； 2.1.2 待测样品的制备 待测液体样品直接测试， 无须预处理 ； 将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样 溶于水或缓冲液中 ； 2.1.3 空白样品 所述的水或缓冲液作为空白样品， 其氨 ( 氨离子 ) 浓度为 0 微摩尔 / 升 ； 2.2 试剂溶液的制备 ： 分别移取或称取缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 氨激酶、 丙酮酸羧化酶、 苹果酸脱氢 酶、 腺苷三磷酸、 草酰乙酸、 单价磷酸盐与碳酸氢盐， 然后将它们混合均匀， 用水溶解得 到所述的试剂溶液， 它们的浓度分别是 20-500mmol/L、 0.001-7mol/L、 0.1-0.35mmol/L、 1000-800。
5、00U/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L、 1-100mmol/L、 1-100mmol/L、 1-100mmol/L 与 1-100mmol/L ； 2.3待测样品与在步骤2.2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合， 在温 度 15-45下反应 5-60 分钟， 在主波长 340nm 与副波长 405nm( 如果受仪器限制， 可以不设 副波长 ) 下进行测定， 测定其吸光度随时间的变化 ； 2.4 在与步骤 2.3) 同样的条件下测定步骤 2.1.1) 标准样品的吸光度随时间的变化 ； 2.5 在与步骤 2.3) 同样的条件下测定在步骤 2.1。
6、.3) 使用的水或缓冲液作为空白溶液 的吸光度随时间的变化 ； 2.6 数据处理 由步骤2.3-2.5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化， 根据下式计算得到 氨的含量 ： 式中 ： A( 样品 ) 表示步骤 2.3) 得到的待测样品的吸光度变化 ； A( 空白 ) 表示步骤 2.5) 得到的空白溶液的吸光度变化 ； A( 标准 ) 表示步骤 2.4) 标准样品的吸光度变化。 3. 根据权利要求 1、 2 所述的测定方法， 其特征在于使用全自动生化分析仪测定时， 待 测样品、 所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样， 然后在下述条 权 利 要 求 书 CN 102。
7、539713 A 2 2/3 页 3 件下进行测定 ： 测定方法为终点法， 温度 37， 反应时间 10 分钟， 测试主波长 340nm， 测试 副波长 405nm， 被测氨样品与试剂的体积比例为 1/10-1/500， 反应方向为负反应， 延迟时间 1/0 分钟， 检测时间 4/5 分钟。 4.根据权利要求1、 2或3所述的测定方法， 其特征在于， 所述的稳定剂是一种或多种选 自氯化钠、 乙二醇、 丙二醇、 甘油或双乙酸钠、 叠氮钠等防腐剂的稳定剂 ； 所述的缓冲液是一 种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液、 磷酸盐缓冲液、 咪唑 - 盐酸缓冲液、 磷 酸氢二钠 - 柠檬。
8、酸缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 甘氨酸 - 氢氧化钠缓冲液、 巴比妥钠 - 盐酸 缓冲液、 硼酸 - 硼砂缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或 “PBS” 缓冲液的缓冲液 ； 所述的还原型辅酶 是一种或多种选自 NADPH、 NADH 或 thio-NADH 的还原型辅酶。 5. 根据权利要求 1、 2 或 3 所述的测定方法， 其特征在于 ： 5.1 所述的试剂溶液配制成如下单剂试剂 ： 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 腺苷三磷酸、 草酰乙酸、 单价磷酸盐、 碳酸 氢盐、 氨激酶、 丙酮酸羧化酶与苹果酸脱氢酶组成的 ； 5.2 所述的试剂溶液配制成如下双剂试剂 ： 试剂 1， 它是由。
9、所述的缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 腺苷三磷酸、 草酰乙酸、 单价磷酸盐 与碳酸氢盐组成的 ； 试剂 2， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 氨激酶、 丙酮酸羧化酶与苹果酸脱氢酶组成的 ； 其中还原型辅酶、 氨激酶、 丙酮酸羧化酶、 苹果酸脱氢酶、 腺苷三磷酸、 草酰乙酸、 单价 磷酸盐、 碳酸氢盐在试剂 1 或试剂 2 中的位置是不限定的 ； 5.3 所述的试剂配制成如下三剂试剂 ： 试剂 1， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 腺苷三磷酸、 草酰乙酸、 单价磷酸盐 与碳酸氢盐组成的 ； 试剂 2， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 丙酮酸羧化酶与苹果酸脱氢酶组成的 ； 试剂 3。
10、， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂与氨激酶组成的 ； 其中还原型辅酶、 氨激酶、 丙酮酸羧化酶、 苹果酸脱氢酶、 腺苷三磷酸、 草酰乙酸、 单价 磷酸盐、 碳酸氢盐在试剂 1、 试剂 2 或试剂 3 中的位置是不限定的。 6. 一种氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒， 其特征在于 ： 6.1 它由下述粉状试剂组成， 在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直 接使用的液体试剂 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L 氨激酶 1000-80000U/L 丙酮酸羧化酶 1000-80000U/L 苹果酸脱氢酶 10。
11、00-80000U/L 腺苷三磷酸 1-100mmol/L 草酰乙酸 1-100mmol/L 单价磷酸盐 1-100mmol/L 碳酸氢盐 1-100mmol/L ； 权 利 要 求 书 CN 102539713 A 3 3/3 页 4 6.2 根据权利要求 6.1 所述的氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒， 其特征在于它有 ： 组成如下的试剂 1 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L 腺苷三磷酸 1-100mmol/L 草酰乙酸 1-100mmol/L 单价磷酸盐 1-100mmol/L 碳酸氢盐 1-100m。
12、mol/L ； 组成如下的试剂 2 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 氨激酶 1000-80000U/L 丙酮酸羧化酶 1000-80000U/L 苹果酸脱氢酶 1000-80000U/L ； 6.3 根据权利要求 6.1 所述的氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒， 其特征在于它有 ： 组成如下的试剂 1 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L 腺苷三磷酸 1-100mmol/L 草酰乙酸 1-100mmol/L 单价磷酸盐 1-100mmol/L 碳酸氢盐 1-100mmol。
13、/L ； 组成如下的试剂 2 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 丙酮酸羧化酶 1000-80000U/L 苹果酸脱氢酶 1000-80000U/L ； 组成如下的试剂 3 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 氨激酶 1000-80000U/L。 权 利 要 求 书 CN 102539713 A 4 1/10 页 5 氨 ( 氨离子 ) 的测定方法与氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂 盒 技术领域 0001 本发明涉及医学 / 食品检验测定技术领域， 更具体地， 本发明涉及氨 ( 氨离子 ) 诊 断 / 测定方法及其试。
14、剂盒。 背景技术 0002 氨测定的方法有微量扩散法、 离子交换法、 酶法和氨电极法等。 目前应用最多的方 法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。 0003 扩散法是标本碱化后， 释放出 NH3， 用酸滴定释放出的氨， 或用 Nessler 反应形成 棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化， 内源性的氨形成造成影响， 使其准确性 和精密度受到影响， 目前已很少应用 ； 离子交换法比扩散法更准确， CV 为 8 13 ； 离子 选择电极法是利用 NH3扩散到电极表面， 引起电极的 pH 发生变化进行测定， 该方法的 CV 为 3.5 4.8， 回收率高。结合具体实际， 应以酶法测定为。
15、实用。 0004 检索中国专利， 仅查出 87105593.7 专利申请公开了一种血氨测定速冻杯， 却未发 现比较理想的血氨测定方法。 发明内容 0005 要解决的技术问题 0006 本发明的目的是提供一种氨 ( 氨离子 ) 的测定方法。 0007 本发明的另一个目的是提供一种氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒。 0008 技术方案 0009 本发明是通过下述技术方案实现的。 0010 本发明的方法是一种采用酶比色法 (Enzymatic Colorimetric Method) 与酶 (偶)联法(Couple Reaction)的联用技术， 利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在 3。
16、40nm 波长处的吸光度变化测定氨 ( 氨离子 ) 的方法。 0011 本发明氨(氨离子)测定方法的的技术原理是根据下述氨激酶、 丙酮酸羧化酶、 苹 果酸脱氢酶的系列催化反应完成 ： 0012 氨 + 腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸 + 磷酰胺 0013 腺苷二磷酸 + 磷酸根 + 草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸 + 0014 丙酮酸 + 二氧化碳 0015 丙酮酸 + 二氧化碳 + 还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸 + 辅酶 0016 本发明的方法利用氨激酶 (ammonia kinase ； EC 2.7.3.8) 酶 ( 偶 ) 联丙酮酸羧 化酶 (pyruvate carboxylase ； 。
17、EC 6.4.1.1)、 苹果酸脱氢酶 (malate dehydrogenase ； EC 1.1.1.38 ； EC 1.1.1.39 ； EC 1.1.1.40 ； EC 1.1.1.83)酶促反应比色终点法。 氨激酶酶解氨 反应产生腺苷二磷酸， 再通过 ( 偶 ) 联合丙酮酸羧化酶、 苹果酸脱氢酶的作用， 最终将还原 型辅酶 ( 在 340nm 处有吸收峰 ) 氧化成为辅酶 ( 在 340nm 处没有吸收峰 )， 从而得以测定还 说 明 书 CN 102539713 A 5 2/10 页 6 原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度， 这样可以通过测量340nm处吸光度下降的程度， 可 。
18、以测算氨 ( 氨离子 ) 的浓度大小。 0017 本发明是通过下述技术方案实现的。 0018 本发明涉及一种氨 ( 氨离子 ) 的测定方法。该氨 ( 氨离子 ) 测定方法的步骤如 下 ： 0019 A、 样品准备 ： 0020 A.1 标准样品的制备 0021 将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中， 再将氨浓度调整到100微摩尔/升， 得到的溶 液作为标准样品 ； 0022 A.2 待测样品的制备 0023 待测液体样品直接测试， 无须预处理 ； 将一定量的待测固体样品像制备标准样品 一样溶于水或缓冲液中 ； 0024 A.3 空白样品 0025 所述的水或缓冲液作为空白样品， 其氨 ( 氨离子 )。
19、 浓度为 0 微摩尔 / 升 ； 0026 B、 试剂溶液的制备 ： 0027 分别移取或称取缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 氨激酶、 丙酮酸羧化酶、 苹果酸脱 氢酶、 腺苷三磷酸、 草酰乙酸、 单价磷酸盐与碳酸氢盐， 然后将它们混合均匀， 用水溶解得 到所述的试剂溶液， 它们的浓度分别是 20-500mmol/L、 0.001-7mol/L、 0.1-0.35mmol/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L、 1-100mmol/L、 1-100mmol/L、 1-100mmol/L 与 1-100mmol/L ； 0028 C、 待测。
20、样品与在步骤 B) 得到的试剂溶液按照体积比 1/10 至 1/500 进行混合， 在 温度15-45下反应5-60分钟， 在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设 副波长 ) 下进行测定， 测定其吸光度随时间的变化 ； 0029 D、 在与步骤 C) 同样的条件下测定步骤 A) 标准样品的吸光度随时间的变化 ； 0030 E、 在与步骤 C) 同样的条件下测定在步骤 A) 空白样品的吸光度随时间的变化 ； 0031 F、 数据处理 0032 由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化， 根据下式计算得到 氨的含量 ： 0033 0034 式中 ： 003。
21、5 A( 样品 ) 表示步骤 C) 得到的待测样品的吸光度变化 ； 0036 A( 空白 ) 表示步骤 E) 得到的空白样品的吸光度变化 ； 0037 A( 标准 ) 表示步骤 D) 标准样品的吸光度变化。 0038 根据本发明， 在所述的氨(氨离子)测定方法中， 所述的缓冲液应该理解是能够使 其测定介质的 pH 基本保持稳定 ( 一般是 6.0-9.0) 的溶液。如果该 pH 高于 9.0 或 pH 低 于 6.0， 则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果， 因此需要添加更多的介质与 说 明 书 CN 102539713 A 6 3/10 页 7 酶， 才有可能达到预期的活性效果。 。
22、0039 在本发明中， 所述的缓冲液是一种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲 液、 磷酸盐缓冲液、 咪唑 - 盐酸缓冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 甘 氨酸 - 氢氧化钠缓冲液、 巴比妥钠 - 盐酸缓冲液、 硼酸 - 硼砂缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或 “PBS” 缓冲液的缓冲液。 0040 优选地， 所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或 “PBS” 缓冲液。 0041 更优选地， 所述的缓冲液例如选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸 (Tris-HCl) 缓冲 液或磷酸盐缓冲液。 004。
23、2 根据本发明， 在所述的氨(氨离子)测定方法中， 所述的稳定剂应该理解是一种能 保护试剂中的介质(底物)与酶， 使其不会随着时间推移而改变其性质， 进而失去活性的物 质， 它会使得试剂具备很长的活性寿命， 通常长达数月， 甚至一、 二年。 如果没有所述的稳定 剂， 则试剂的活性在溶液中只能维持数十小时， 顶多数天， 就会逐渐失去活性而不再具备检 测性能。在本发明中， 所述的稳定剂使用量是 0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不 够， 则试剂活性的寿命就会缩短 ； 如果所述的稳定剂使用量过高， 则会增加成本。 0043 在本发明中， 所述的稳定剂是一种或多种选自氯化钠、 乙二醇、 丙。
24、二醇、 甘油或双 乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。 0044 优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自氯化钠、 丙二醇、 甘油或双乙酸钠或 叠氮钠的稳定剂。 0045 更优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油或双乙酸钠的稳定剂。 0046 在本发明中， 所述的还原型辅酶是一种或多种选自NADPH、 NADH或thio-NADH的还 原型辅酶。 0047 根据一种本发明的优选实施方式， 本发明使用全自动生化分析仪测定氨 ( 氨离 子 ) 时， 待测样品、 所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下 ( 参数 ) 自动取 样， 然后在下述条件下进行测定 ： 测定方法为二点终点法 / 。
25、终点法， 温度 37， 反应时间 10 分钟， 测试主波长 340nm， 测试副波长 405nm， 被测氨 ( 氨离子 ) 样品与试剂的体积比例为 1/10-1/500， 反应方向为负反应， 延迟时间 1/0 分钟， 检测时间 4/5 分钟。 0048 根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明使用的试剂溶液配制成如下双剂试 剂 ： 0049 由所述的缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 腺苷三磷酸、 草酰乙酸、 单价磷酸盐与碳酸 氢盐组成的试剂 1 ； 0050 由所述的缓冲液、 稳定剂、 氨激酶、 丙酮酸羧化酶与苹果酸脱氢酶组成的试剂 2 ； 0051 其中还原型辅酶、 氨激酶、 丙酮酸羧化酶、。
26、 苹果酸脱氢酶、 腺苷三磷酸、 草酰乙酸、 单价磷酸盐、 碳酸氢盐在试剂 1 或试剂 2 中的位置是不限定的。 0052 根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明使用的试剂配制成如下三剂试剂 ： 0053 由所述的缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 腺苷三磷酸、 草酰乙酸、 单价磷酸盐与碳酸 氢盐组成的试剂 1 ； 0054 由所述的缓冲液、 稳定剂、 丙酮酸羧化酶与苹果酸脱氢酶组成的试剂 2 ； 0055 由所述的缓冲液、 稳定剂与氨激酶组成的试剂 3 ； 说 明 书 CN 102539713 A 7 4/10 页 8 0056 其中还原型辅酶、 氨激酶、 丙酮酸羧化酶、 苹果酸脱氢酶、 腺苷。
27、三磷酸、 草酰乙酸、 单价磷酸盐、 碳酸氢盐在试剂 1、 试剂 2 或试剂 3 中的位置是不限定的。 0057 在本发明氨 ( 氨离子 ) 测定方法中使用的测定仪器可以是紫外 / 可见光分析仪， 例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、 天津喀纳斯光学分析仪器有 限公司销售的 723 可见分光光度计 ； 半自动生化分析仪， 例如上海伟思医用设备有限公司 的 BTS-330 半自动生化分析仪 ； 全自动生化分析仪， 例如 ： 由迈瑞公司以商品名 BS-300、 奥 林帕斯公司以商品名 AU400、 东芝公司以商品名 120、 日立公司以商品名 7600、 雅培公司以 商品名 CB8。
28、000 或贝克曼公司以商品名 CX20 销售的全自动生化分析仪。 0058 本发明还涉及氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒。该氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂 盒由下述粉状试剂组成， 在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的 液体试剂 ： 0059 缓冲液 20-500mmol/L 0060 稳定剂 0.001-7mol/L 0061 还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L 0062 氨激酶 1000-80000U/L 0063 丙酮酸羧化酶 1000-80000U/L 0064 苹果酸脱氢酶 1000-80000U/L 0065 腺苷三磷酸 1-100mmol/。
29、L 0066 草酰乙酸 1-100mmol/L 0067 单价磷酸盐 1-100mmol/L 0068 碳酸氢盐 1-100mmol/L。 0069 根据一种本发明的优选实施方式， 本发明的氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒有 ： 0070 试剂 1 ： 0071 缓冲液 100mmol/L 0072 稳定剂 500mmol/L 0073 还原型辅酶 0.25mmol/L 0074 腺苷三磷酸 5mmol/L 0075 草酰乙酸 5mmol/L 0076 单价磷酸盐 5mmol/L 0077 碳酸氢盐 5mmol/L ； 0078 组成如下的试剂 2 ： 0079 缓冲液 100mmol。
30、/L 0080 稳定剂 500mmol/L 0081 氨激酶 16000U/L 0082 丙酮酸羧化酶 18000U/L 0083 苹果酸脱氢酶 12000U/L。 0084 根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒有 ： 0085 试剂 1 ： 0086 缓冲液 100mmol/L 说 明 书 CN 102539713 A 8 5/10 页 9 0087 稳定剂 500mmol/L 0088 还原型辅酶 0.25mmol/L 0089 腺苷三磷酸 5mmol/L 0090 草酰乙酸 5mmol/L 0091 单价磷酸盐 5mmol/L 0092 碳酸氢盐 5mm。
31、ol/L ； 0093 组成如下的试剂 2 ： 0094 缓冲液 100mmol/L 0095 稳定剂 500mmol/L 0096 丙酮酸羧化酶 18000U/L 0097 苹果酸脱氢酶 12000U/L ； 0098 组成如下的试剂 3 ： 0099 缓冲液 100mmol/L 0100 稳定剂 500mmol/L 0101 氨激酶 16000U/L。 0102 根据另一种本发明的优选实施方式， 在本发明的氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒 中， 所述的缓冲液是一种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液、 磷酸盐缓冲液、 咪唑 - 盐酸缓冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸。
32、缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 甘氨酸 - 氢氧化钠缓 冲液、 巴比妥钠 - 盐酸缓冲液、 硼酸 - 硼砂缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或 “PBS” 缓冲液的缓冲 液。 0103 优选地， 所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或 “PBS” 缓冲液。 0104 更优选地， 所述的缓冲液例如选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸 (Tris-HCl) 缓冲 液或磷酸盐缓冲液。 0105 在本发明中， 所述的稳定剂是一种或多种选自氯化钠、 乙二醇、 丙二醇、 甘油或双 乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。 0106 优选地， 所述的稳定剂例如是一种或。
33、多种选自氯化钠、 丙二醇、 甘油、 双乙酸钠或 叠氮钠的稳定剂。 0107 更优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油或双乙酸钠的稳定剂。 0108 在本发明中， 无论是单剂试剂、 双剂试剂或三剂试剂， 在本发明测定氨 ( 氨离子 ) 的方法中， 所述的还原型辅酶可以是一种或多种选自NADPH、 NADH或thio-NADH的还原型辅 酶。 0109 使用本发明的氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒时， 可以使用紫外 / 可见光分析仪， 例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、 天津喀纳斯光学分析仪器有 限公司销售的 723 可见分光光度计 ； 半自动生化分析仪， 例如。
34、上海伟思医用设备有限公司 的 BTS-330 半自动生化分析仪 ； 全自动生化分析仪， 例如 ： 由迈瑞公司以商品名 BS-300、 奥 林帕斯公司以商品名 AU400、 东芝公司以商品名 120、 日立公司以商品名 7600、 雅培公司以 商品名 CB8000 或贝克曼公司 以商品名 CX20 销售的全自动生化分析仪。 0110 在采用本发明方法测定氨(氨离子)时， 根据实验要求进行多次试验， 然后将得到 说 明 书 CN 102539713 A 9 6/10 页 10 的这些试验结果按照下式计算出精密度 (CV) ： 0111 0112 式中 ： 0113 - 试验结果平均值 ； 0114。
35、 Xi- 各次试验结果 ； 0115 n- 试验次数 .N 10 0116 0117 将得到的这些试验结果按照下式计算出相对极差 ： 0118 0119 第一批各次试验结果平均值 0120 第二批各次试验结果平均值 0121 第三批各次试验结果平均值 0122 为 X， Y， Z 中的最大值 0123 为 X， Y， Z 中的最小值 0124 每批试样数取 n 3 0125 经过大量试验确定， 对于氨 ( 氨离子 ) 含量为 0-1000mol/L 的样品， 其分析误差 可以达到 5。 0126 本发明方法的灵敏度可以达到 1mol/L。 0127 通过大量试验确定， 本发明方法测定氨 ( 氨。
36、离子 ) 含量范围是 0-1000mol/L， 本 发明方法适合于医学临床 / 食品诊断 / 检测。 具体实施方式 0128 下述实施例说明本发明而不限制本发明的保护范围。 0129 实施例 1 ： 血浆中氨 ( 氨离子 ) 含量的测定 0130 1) 标准样品的制备 0131 将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中， 再将氨浓度调整到 100 微摩尔 / 升 ； 0132 2) 待测样品预处理 0133 血浆样品作为待测样品， 无须预处理 ； 0134 3) 空白样品 0135 所述的水或缓冲液作为空白样品， 其氨浓度为 0 微摩尔 / 升 ； 0136 B、 试剂溶液的制备 ： 0137 本实施例。
37、的氨诊断 / 测定试剂为单剂试剂， 它含有 ： 0138 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0139 甘油 1mol/L 0140 NADPH 0.25mmol/L 说 明 书 CN 102539713 A 10 7/10 页 11 0141 氨激酶 16000U/L 0142 丙酮酸羧化酶 18000U/L 0143 苹果酸脱氢酶 12000U/L 0144 腺苷三磷酸 5mmol/L 0145 草酰乙酸 5mmol/L 0146 单价磷酸盐 5mmol/L 0147 碳酸氢盐 4mmol/L。 0148 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。。
38、 0149 C、 待测血浆样品， 与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/20进行混合， 在温度 37下反应 5 分钟， 在主波长 340nm 与副波长 405nm 下进行测定， 测定其吸光度随时间的变 化 A( 样品 ) 为 0.0277 ； 0150 D、 在与步骤 C) 同样的条件下测定步骤 A) 标准样品的吸光度随时间的变化 A( 标准 ) 为 0.0523 ； 0151 E、 在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)使用的水作为空白溶液的吸光度随时 间的变化 A( 空白 ) 为 0.0106 ； 0152 F、 数据处理 0153 由步骤 C-E) 所述测定的主波长 340nm 的吸光。
39、度随时间的变化， 根据下式 计算得 到氨 ( 氨离子 ) 的含量 ： 0154 0155 式中 ： 0156 A( 样品 ) 表示步骤 C) 得到的待测样品的吸光度变化 ； 0157 A( 空白 ) 表示步骤 E) 得到的空白样品的吸光度变化 ； 0158 A( 标准 ) 表示步骤 D) 标准样品的吸光度变化。 0159 通过上式计算得到该血浆样品的氨 ( 氨离子 ) 含量为 82mol/L， 其误差是 2mol/L。 0160 实施例 2 ： 血浆中氨 ( 氨离子 ) 含量的测定 0161 1) 标准样品的制备 0162 将一定量的氨盐溶于水中， 再将氨 ( 氨离子 ) 浓度调整到 100 。
40、微摩尔 / 升， 作为标 准样品 ； 0163 2) 待测样品的制备 0164 血浆样品作为待测样品， 无须预处理 ； 0165 3) 空白样品 0166 所述的水作为空白样品， 其氨 ( 氨离子 ) 浓度为 0 微摩尔 / 升 ； 0167 B、 试剂溶液的制备 ： 0168 氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂为双剂试剂， 它含有 ： 0169 组成如下的试剂 1 ： 说 明 书 CN 102539713 A 11 8/10 页 12 0170 磷酸盐缓冲液 100mmol/L 0171 NADH 0.25mmol/L 0172 腺苷三磷酸 5mmol/L 0173 草酰乙酸 5mmol。
41、/L 0174 碳酸氢盐 5mmol/L ； 0175 组成如下的试剂 2 ： 0176 磷酸盐缓冲液 100mmol/L 0177 乙二醇 5mol/L 0178 氨激酶 16000U/L 0179 丙酮酸羧化酶 32000U/L 0180 苹果酸脱氢酶 40000U/L。 0181 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 0182 C、 样品使用日立 7080 全自动生化分析仪测定 0183 该全自动生化分析仪主要操作参数如下 ： 0184 计量方法 ： 两点终点法 0185 测试计量时间点 ： 21， 31 0186 主波长 ： 340 0187 副波长 ： 405 01。
42、88 反应温度 ： 37 0189 样品体积 ： 20 0190 试剂 1(R1) 体积 ： 200 0191 试剂 2(R3) 体积 ： 50 0192 反应方向 ： 负 0193 标准样品 1 ： 0 0194 标准样品 2 ： 100 0195 定标结果显示 K 值为 -5011， 换算成灵敏度为 0.00020A/mol/L。 0196 测试结果显示该血浆中含有氨 ( 氨离子 ) 为 21mol/L。其误差是 1mol/L。 0197 实施例 3 ： 血浆样品中氨 ( 氨离子 ) 含量的测定 0198 该实施例的操作方式与实施例 2 相同， 只是本实施例 ： 0199 B、 试剂溶液的。
43、制备 ： 0200 氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂为三剂试剂， 它含有 ： 0201 组成如下的试剂 1 ： 0202 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0203 NADH 0.25mmol/L 0204 腺苷三磷酸 6mmol/L 0205 草酰乙酸 5mmol/L 0206 单价磷酸盐 5mmol/L 0207 碳酸氢盐 4mmol/L ； 0208 组成如下的试剂 2 ： 说 明 书 CN 102539713 A 12 9/10 页 13 0209 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0210 氯化钠 2mol/L 0。
44、211 丙酮酸羧化酶 28000U/L 0212 苹果酸脱氢酶 50000U/L ； 0213 组成如下的试剂 3 ： 0214 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0215 氯化钠 2mol/L 0216 氨激酶 26000U/L。 0217 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 0218 C、 样品使用日立 7080 全自动生化分析仪测定 0219 该全自动生化分析仪主要操作参数如下 ： 0220 计量方法 ： 两点终点法 0221 测试计量时间点 ： 21， 31 0222 主波长 ： 340 0223 副波长 ： 405 0224 反应温。
45、度 ： 37 0225 样品体积 ： 20 0226 试剂 1(R1) 体积 ： 20 0227 试剂 2(R2) 体积 ： 180 0228 试剂 3(R3) 体积 ： 50 0229 反应方向 ： 负 0230 标准样品 1 ： 0 0231 标准样品 2 ： 100 0232 定标结果显示 K 值为 -4705， 换算成灵敏度为 0.00021A/mol/L。 0233 测试结果显示该血浆中含有氨 ( 氨离子 ) 为 78mol/L。其误差是 2mol/L。 0234 实施例 4 ： 稳定性试验 0235 该实施例的操作方式与实施例 1 相同， 只是在实施例 1 实施后， 实施例 1 使。
46、用的试 剂在密闭试剂瓶中在 2-8下存放了半年与一年。 0236 使用同样的标准样品， 使用与实施例 2 同样的新试剂与上述存放半年与一年的试 剂分别进行了测定， 其它条件都与实施例 2 相同， 其测定结果如下 ： 0237 表 1 0238 氨 ( 氨离子 ) 含量 分析误差 新试剂 201mol/L 4mol/L 存放半年的试剂 202mol/L 4mol/L 存放一年的试剂 205mol/L 4mol/L 0239 表 1 结果表明， 使用本发明的试剂盒， 采用本发明的测定方法可以保证获得稳定 的结果， 其稳定性至少一年以上。 0240 实施例 5 ： 线性试验 0241 该实施例的操作方式与实施例 2 相同， 只是配制新的标准样品浓度达到 说 明 书 CN 102539713 A 13 10/10 页 14 1200mol/L， 将800mol/L的氨(氨离子)依倍比稀释， 然后进行测试。