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一种具有抗糖尿病肾病作用的香椿子提取物制备方法.pdf

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文档编号：4640938

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1、(10)申请公布号 CN 102526203 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102526203 A *CN102526203A* (21)申请号 201210024221.3 (22)申请日 2012.02.05 A61K 36/58(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 13/12(2006.01) G01N 33/15(2006.01) A61K 131/00(2006.01) (71)申请人田景振地址 250355 山东省济南市长清大学科技园山东中医药大学申请人李万忠 (72)发明人田景振李万忠 (54) 发明名称一种具有。

2、抗糖尿病肾病作用的香椿子提取物制备方法 (57) 摘要本发明公开了一种具有抗糖尿病肾病作用的香椿子提取物，主要采用系统溶剂法提取香椿子中不同的极性部位，运用糖尿病肾病动物模型，按照 “等剂量不等强度原则” 进行评价，提供了一种具有抗糖尿病肾病作用的有效部位，从而为进一步从香椿子中寻找治疗糖尿病肾病的活性成分或先导化合物，也为下一步综合开发利用我国香椿子天然植物资源提供资料，所以具有一定的科学意义和实用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 4 页。

3、 1/1 页 2 1. 一种具有抗糖尿病肾病作用的香椿子提取物的制备方法，其特征在于，该提取方法的步骤如下：称取干燥香椿子，粉碎，分别用8倍量55%95%乙醇热回流提取3次，每次2小时，过滤后合并提取液，减压浓缩至无醇味；浓缩液以水混悬，依次用石油醚( 6090)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取剩余的部分为水部分；分别减压回收溶液至干，依次得到香椿子的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位与水部位。 2. 根据权利要求 1 所述的香椿子极性部位，运用糖尿病肾病动物模型进行筛选，得到了具有抗糖尿病肾病作用的香椿子提取物，其特征在于该香椿子提取物是由。

4、正丁醇部位和乙酸乙酯部位组成。权利要求书 CN 102526203 A 2 1/4 页 3 一种具有抗糖尿病肾病作用的香椿子提取物制备方法技术领域 0001 本发明属于中药提取技术领域，是一种从香椿子中提取抗糖尿病肾病作用的极性部位的方法。背景技术 0002 糖尿病肾病 (Diabetic nephropathy， DN) 是糖尿病 (diabetes mellitus， DM) 患者常见而难治的远期慢性微血管并发症之一，也是引起 DM 患者死亡的重要原因。目前我国 DM 患者达 4000 余万， DN 发病率逐年递增，临床上 40% 50% 的 1 型、 10% 2。

5、0% 的 2 型 DM 患者伴有明显的 DN，约 1/3 患者发展为晚期 DN 和终末期肾脏病，已成为严重威胁人类生命健康的疾病。迄今医学界尚无有效治疗方法阻止 DN 发生与发展，近年来中药在 DN 治疗方面倍受关注并取得了一定成绩。 0003 香椿子，性温，味辛苦，无毒，入肝、肺经，具祛风、散寒、止痛功效，主治风寒外感、心胃气痛、风湿关节痛、疝气等。香椿分布于华北、西北、西南、华东等地，尤以山东、河北两省为多。香椿以栽植最多，加上广泛分布的野生香椿，整体资源非常丰富。山东省临沂、聊城等地区群众使用香椿子泡水或煎服，对 DN 具有较好疗效。

6、, 属于民间用药。美国专利（US2005175716）提及香椿子中含有治疗 DM 的天然活性成分，加之香椿子较低的使用毒性，所以香椿子不失为一种具有市场潜力的防治 DN 的物质来源。 0004 香椿是一种用途较广、来源丰富、成本低廉、药食两用的植物 , 具有很好的开发利用价值。目前已发现香椿子具有降血糖、抗氧化、抗凝血、抗血栓、提高纤溶活性、保护心肌缺血再灌注损伤、改善心肌缺血再灌注的血流动力学变化、保护神经细胞、保护活化和损伤的内皮细胞等作用。香椿子药理研究相对较少，尤其是香椿子提取物在抗 DN 作用方面尚未见报道。发明内容 0005 本发明所要解决。

7、的技术问题是提供一种具有抗 DN 作用的香椿子提取物，为解决此问题，从香椿子的不同极性部位入手，运用动物模型筛选抗 DN 作用的有效部位。 0006 由于香椿子成分复杂，有些成分本身可能无活性，但经体内代谢所得产物具备活性，故寻找香椿子中抗 DN 作用的极性部位宜采用动物模型筛选，即应用雄性 Wistar 大鼠，注射链脲佐菌素（STZ）建立 DN 模型，观察香椿子不同极性部位对 DN 大鼠肾脏的保护作用，从而筛选香椿子中治疗 DN 的物质基础。 0007 为了达到上述目的，本发明通过下列措施实现：称取干燥香椿子，粉碎，分别用8倍量55%95%乙醇热回流提取。

8、3次，每次2小时，过滤后合并提取液，减压浓缩至无醇味。 0008 浓缩液以水混悬，依次用石油醚( 6090)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取剩余的部分为水部分。 0009 分别减压回收溶液至干，依次得到香椿子的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁说明书 CN 102526203 A 3 2/4 页 4 醇部位与水部位。 0010 运用动物模型筛选抗 DN 作用的极性部位，最终得到由香椿子正丁醇部位和乙酸乙酯部位组成的提取物。 0011 本发明方法采用系统溶剂法提取不同极性部位，运用 DN 动物模型，按照 “等剂量不等强度原则” 进行评价，得到一种具有抗 DN 作用。

9、的香椿子提取物。该发明为进一步从香椿子中寻找治疗糖尿病肾病的活性成分或先导化合物，也为下一步综合开发利用我国香椿子天然植物资源提供资料，所以具有一定的科学意义和实用价值。 0012 下面结合具体实施方式对本发明的技术方案进一步的说明。具体实施方式 0013 实施例 1 不同极性部位的香椿子提取物制备 1. 热回流法提取称取干燥香椿子10 kg，适当粉碎，分别用8倍量95%、 75%、 55%乙醇热回流提取1次，每次 2 小时，过滤后合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩至提取液无乙醇味。 0014 2. 系统溶剂法萃取浓缩后的提取液以水混悬，依次用石油醚( 6090 )、乙。

10、酸乙酯、正丁醇萃取，各自萃取 3 次，合并各萃取溶液，萃取剩余的部分为水部分。 0015 3. 香椿子不同极性部位的提取物制备系统溶剂法萃取的 4 个不同极性溶液，各自减压回收溶剂至干，依次得到香椿子石油醚部位 (89.4 g)、乙酸乙酯部位 (72.5 g)、正丁醇部位 (163.2 g)、水部位 (320.6 g)。 0016 实施例 2 不同极性部位香椿子提取物对 DN 大鼠肾脏的保护作用 1. 材料与试剂采用实施例1制备的香椿子极性部位； SPF级Wistar雄性大鼠，体重(20020)g ； STZ，为 Sigma 公司产品； BT-3000 全自动。

11、生化分析仪，意大利德尔曼；尿素氮、肌酐、微量白蛋白试剂盒，为南京建成生物公司产品；其它试剂均为国产分析纯。 0017 2. 实验方法 2.1 试样制备分别称取实施例1中的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水四个极性部位适量，采用DMSO溶液溶解，配制成 40 mg/ml 备用。 0018 2.2 DN 大鼠模型制备 180 220 g SPF 级雄性 Wistar 大鼠，适应性喂养 1 周。按体重编号，随机取 10 只为空白对照组，用普通饲料喂养。造模大鼠 75 只喂以高脂高糖饲料，第 6 周禁食 12 h 后， STZ 60 mg/kg 左侧下腹部腹腔注射，。

12、空白组注射相同容量的柠檬酸缓冲液。造模后，选取连续 3 天空腹血糖介于 16.7 25.0 mmol/L、尿量原尿量 150% 的大鼠，继续喂养 1 周，用代谢笼收集 24 h 尿液，记录 24 h 尿量，检测尿白蛋白含量，以尿白蛋白排泄率 20 g/min 者，确定 DN 模型建立成功。 0019 2.3 分组与给药将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、给药组（石油醚部位组、乙酸乙酯部位组、正丁醇部位组和水部位组），模型组 15 只，其余每组 14 只。给药组灌胃给药，每日 2 次，空白说明书 CN 102526203 A 4 3/4 页 5 组。

13、和模型组动物给予同容积蒸馏水，连续给药 8 周。实验动物在同一条件下，室温保持在 20 24 ，相对湿度 70%， 12 h 交替照明，自由饮水，标准饮食。 0020 2.4 指标检测停止给药后将大鼠置于代谢笼中收集 24 h 尿液，冷冻备用。收集尿液后禁食 12 h，称重。用 10% 水合氯醛腹腔注射麻醉，股动脉取血，立即离心 (3 000 r/min， 15 min)，分离血清，分装后 20 密封保存备用。剖腹取出左肾，去除包膜称取肾重。实验期间观察大鼠的一般状况、体重变化，计算肾脏肥大指数、 24 h尿量、 24 h尿微量白蛋白(24 h UMA)，。

14、测定肾功能指标。 0021 3. 实验结果 3.1 实验大鼠的一般情况实验期间，正常组生长良好，饮食与反应正常。模型组大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食、消瘦等症状，活动减少，精神萎靡，皮毛凌乱，色枯无泽。实验后期出现腹水、白内障等并发症，以模型组最重，高血糖衰竭死亡 5 只；其余各药物组由于相互撕咬或其它原因受伤或感染致死 2 只，但大鼠体重有所增加，并发症相对减少，活动、毛色等有所改善。 0022 3.2 香椿子提取物对 DN 大鼠体重及肾重的影响情况表 1 香椿子提取物对 DN 大鼠体重及肾重的影响情况 ( ) 组。

15、别动物数（只）体重（g）肾重体重比（103）空白对照组10326.724.53.610.92 模型对照组10 172.416.8 6.250.71 石油醚部位组12185.517.66.330.64 乙酸乙酯部位组12 191.318.2 5.520.44 正丁醇部位组12 261.819.3 4.700.52 水部位组12186.216.75.830.60 注 : 与空白对照组比较， P 0.01 ；与模型组比较，P 0.05，P 0.01 3.3 香椿子提取物对 DN 大鼠 24 h 尿量、 24 h UMA 的影响情况表 2 香椿子提取物对 DN 大鼠 24 h 尿量、 2。

16、4 h UMA 的影响情况 () 组别动物数（只）24h 尿量（ml）24hUMA（mg）空白对照组109.633.2014.761.85 模型对照组10 131.524.6 50.294.73 石油醚部位组12 130.418.7 50.1130.69 乙酸乙酯部位组12 109.812.6 46.323.15 正丁醇部位组12 105.210.1 43.864.07 水部位组12 129.613.349.545.05 注 : 与空白对照组比较， P 0.01 ；与模型组比较，P 0.05，P 0.01 3.4 香椿子提取物对 DN 大鼠尿素氮、肌酐的影响情况表 3 香椿子提取。

17、物对 DN 大鼠尿素氮、肌酐的影响情况 () 组别动物数（只）BUN(mmol/L)Cr(mol/L) 空白对照组106.390.5864.359.47 模型对照组10 18.473.56 98.7212.34 石油醚部位组12 15.822.84 90.2611.05 乙酸乙酯部位组12 14.513.73 87.659.78 正丁醇部位组12 10.061.85 78.546.83 说明书 CN 102526203 A 5 4/4 页 6 水部位组12 16.242.25 89.7110.17 注 : 与空白对照组比较， P 0.01 ；与模型组比较，P 0.05，P 0.01 从以上实验结果可以看出：正丁醇部位组能够显著增加 DN 大鼠体重，减少 DN 大鼠 24 h 尿量及肾重体重比，减轻 DN 大鼠 24 h 尿蛋白排泄量，改善大鼠尿素氮及血肌酐情况，从而改善 DN 大鼠肾功能（P 0.01）；乙酸乙酯部位组具有保护 DN 大鼠肾功能作用（P 0.05）；石油醚部位组和水部位组对 DN 大鼠肾功能的保护无统计学意义（P 0.05）。说明书 CN 102526203 A 6 。

摘要
申请专利号：	CN201210024221.3	申请日：	2012.02.05
公开号：	CN102526203A	公开日：	2012.07.04
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|专利申请权的转移IPC(主分类):A61K 36/58变更事项:申请人变更前权利人:田景振变更后权利人:潍坊医学院变更事项:地址变更前权利人:250355 山东省济南市长清大学科技园山东中医药大学变更后权利人:261053 山东省潍坊市潍城区宝通西街7166号潍坊医学院科研处变更事项:申请人变更前权利人:李万忠登记生效日:20140130\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A61K 36/58申请日:20120205\|\|\|公开
IPC分类号：	A61K36/58; A61P3/10; A61P13/12; G01N33/15; A61K131/00(2006.01)N	主分类号：	A61K36/58
申请人：	田景振; 李万忠
发明人：	田景振; 李万忠
地址：	250355 山东省济南市长清大学科技园山东中医药大学
优先权：
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内容摘要

本发明公开了一种具有抗糖尿病肾病作用的香椿子提取物，主要采用系统溶剂法提取香椿子中不同的极性部位，运用糖尿病肾病动物模型，按照“等剂量不等强度原则”进行评价，提供了一种具有抗糖尿病肾病作用的有效部位，从而为进一步从香椿子中寻找治疗糖尿病肾病的活性成分或先导化合物，也为下一步综合开发利用我国香椿子天然植物资源提供资料，所以具有一定的科学意义和实用价值。

权利要求书

1.一种具有抗糖尿病肾病作用的香椿子提取物的制备方法，其特征在于，该提取方法的步骤如下：⑴ 称取干燥香椿子，粉碎，分别用8倍量55%～95%乙醇热回流提取3次，每次2小时，过滤后合并提取液，减压浓缩至无醇味；⑵ 浓缩液以水混悬，依次用石油醚( 60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取剩余的部分为水部分；⑶ 分别减压回收溶液至干，依次得到香椿子的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位与水部位。2.根据权利要求1所述的香椿子极性部位，运用糖尿病肾病动物模型进行筛选，得到了具有抗糖尿病肾病作用的香椿子提取物，其特征在于该香椿子提取物是由正丁醇部位和乙酸乙酯部位组成。

说明书

一种具有抗糖尿病肾病作用的香椿子提取物制备方法

技术领域

本发明属于中药提取技术领域，是一种从香椿子中提取抗糖尿病肾病作用的极性部位的方法。

背景技术

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病 (diabetes mellitus，DM)患者常见而难治的远期慢性微血管并发症之一，也是引起DM患者死亡的重要原因。目前我国DM患者达4000余万，DN发病率逐年递增，临床上40%～50%的1型、10%～20%的2型DM患者伴有明显的DN，约1/3患者发展为晚期DN和终末期肾脏病，已成为严重威胁人类生命健康的疾病。迄今医学界尚无有效治疗方法阻止DN发生与发展，近年来中药在DN治疗方面倍受关注并取得了一定成绩。

香椿子，性温，味辛苦，无毒，入肝、肺经，具祛风、散寒、止痛功效，主治风寒外感、心胃气痛、风湿关节痛、疝气等。香椿分布于华北、西北、西南、华东等地，尤以山东、河北两省为多。香椿以栽植最多，加上广泛分布的野生香椿，整体资源非常丰富。山东省临沂、聊城等地区群众使用香椿子泡水或煎服，对DN具有较好疗效, 属于民间用药。美国专利（US2005175716）提及香椿子中含有治疗DM的天然活性成分，加之香椿子较低的使用毒性，所以香椿子不失为一种具有市场潜力的防治DN的物质来源。

香椿是一种用途较广、来源丰富、成本低廉、药食两用的植物, 具有很好的开发利用价值。目前已发现香椿子具有降血糖、抗氧化、抗凝血、抗血栓、提高纤溶活性、保护心肌缺血再灌注损伤、改善心肌缺血再灌注的血流动力学变化、保护神经细胞、保护活化和损伤的内皮细胞等作用。香椿子药理研究相对较少，尤其是香椿子提取物在抗DN作用方面尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抗DN作用的香椿子提取物，为解决此问题，从香椿子的不同极性部位入手，运用动物模型筛选抗DN作用的有效部位。

由于香椿子成分复杂，有些成分本身可能无活性，但经体内代谢所得产物具备活性，故寻找香椿子中抗DN作用的极性部位宜采用动物模型筛选，即应用雄性Wistar大鼠，注射链脲佐菌素（STZ）建立DN模型，观察香椿子不同极性部位对DN大鼠肾脏的保护作用，从而筛选香椿子中治疗DN的物质基础。

为了达到上述目的，本发明通过下列措施实现：

⑴ 称取干燥香椿子，粉碎，分别用8倍量55%～95%乙醇热回流提取3次，每次2小时，过滤后合并提取液，减压浓缩至无醇味。

⑵ 浓缩液以水混悬，依次用石油醚( 60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取剩余的部分为水部分。

⑶ 分别减压回收溶液至干，依次得到香椿子的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位与水部位。

⑷ 运用动物模型筛选抗DN作用的极性部位，最终得到由香椿子正丁醇部位和乙酸乙酯部位组成的提取物。

本发明方法采用系统溶剂法提取不同极性部位，运用DN动物模型，按照“等剂量不等强度原则”进行评价，得到一种具有抗DN作用的香椿子提取物。该发明为进一步从香椿子中寻找治疗糖尿病肾病的活性成分或先导化合物，也为下一步综合开发利用我国香椿子天然植物资源提供资料，所以具有一定的科学意义和实用价值。

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案进一步的说明。

具体实施方式

实施例1 不同极性部位的香椿子提取物制备

1.热回流法提取

称取干燥香椿子10 kg，适当粉碎，分别用8倍量95%、75%、55%乙醇热回流提取1次，每次2小时，过滤后合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩至提取液无乙醇味。

2.系统溶剂法萃取

浓缩后的提取液以水混悬，依次用石油醚( 60～90 ℃)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各自萃取3 次，合并各萃取溶液，萃取剩余的部分为水部分。

3.香椿子不同极性部位的提取物制备

系统溶剂法萃取的4个不同极性溶液，各自减压回收溶剂至干，依次得到香椿子石油醚部位(89.4 g)、乙酸乙酯部位(72.5 g)、正丁醇部位(163.2 g)、水部位(320.6 g)。

实施例2 不同极性部位香椿子提取物对DN大鼠肾脏的保护作用

1.材料与试剂

采用实施例1制备的香椿子极性部位；SPF级Wistar雄性大鼠，体重(200±20)g；STZ，为Sigma公司产品；BT-3000全自动生化分析仪，意大利德尔曼；尿素氮、肌酐、微量白蛋白试剂盒，为南京建成生物公司产品；其它试剂均为国产分析纯。

2.实验方法

2.1试样制备

分别称取实施例1中的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水四个极性部位适量，采用DMSO溶液溶解，配制成40 mg/ml备用。

2.2 DN大鼠模型制备

180～220 g SPF级雄性Wistar大鼠，适应性喂养1周。按体重编号，随机取10只为空白对照组，用普通饲料喂养。造模大鼠75只喂以高脂高糖饲料，第6周禁食12 h后，STZ 60 mg/kg左侧下腹部腹腔注射，空白组注射相同容量的柠檬酸缓冲液。造模后，选取连续3天空腹血糖介于16.7～25.0 mmol/L、尿量>原尿量×150%的大鼠，继续喂养1周，用代谢笼收集24 h尿液，记录24 h尿量，检测尿白蛋白含量，以尿白蛋白排泄率＞20 μg/min者，确定DN模型建立成功。

2.3分组与给药

将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、给药组（石油醚部位组、乙酸乙酯部位组、正丁醇部位组和水部位组），模型组15只，其余每组14只。给药组灌胃给药，每日2次，空白组和模型组动物给予同容积蒸馏水，连续给药8周。实验动物在同一条件下，室温保持在20～24 ℃，相对湿度70%，12 h交替照明，自由饮水，标准饮食。

2.4指标检测

停止给药后将大鼠置于代谢笼中收集24 h尿液，冷冻备用。收集尿液后禁食12 h，称重。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，股动脉取血，立即离心(3 000 r/min，15 min)，分离血清，分装后–20 ℃密封保存备用。剖腹取出左肾，去除包膜称取肾重。实验期间观察大鼠的一般状况、体重变化，计算肾脏肥大指数、24 h尿量、24 h尿微量白蛋白(24 h UMA)，测定肾功能指标。

3. 实验结果

3.1 实验大鼠的一般情况

实验期间，正常组生长良好，饮食与反应正常。模型组大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食、消瘦等症状，活动减少，精神萎靡，皮毛凌乱，色枯无泽。实验后期出现腹水、白内障等并发症，以模型组最重，高血糖衰竭死亡5只；其余各药物组由于相互撕咬或其它原因受伤或感染致死2只，但大鼠体重有所增加，并发症相对减少，活动、毛色等有所改善。

3.2 香椿子提取物对DN大鼠体重及肾重的影响情况

表1 香椿子提取物对DN大鼠体重及肾重的影响情况( )

组别动物数（只）体重（g）肾重体重比（×103）空白对照组10326.7±24.53.61±0.92模型对照组10 172.4±16.8▲▲ 6.25±0.71▲▲石油醚部位组12185.5±17.66.33±0.64乙酸乙酯部位组12 191.3±18.2★ 5.52±0.44★★正丁醇部位组12 261.8 ±19.3★★ 4.70±0.52★★水部位组12186.2±16.75.83±0.60

注: 与空白对照组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01

3.3 香椿子提取物对DN大鼠24 h尿量、24 h UMA的影响情况

表2 香椿子提取物对DN大鼠24 h尿量、24 h UMA的影响情况()

组别动物数（只）24 h尿量（ml）24 h UMA（mg）空白对照组109.63±3.2014.76±1.85模型对照组10 131.5±24.6▲▲ 50.29±4.73▲▲石油醚部位组12 130.4±18.7 50.11±30.69乙酸乙酯部位组12 109.8±12.6★ 46.32±3.15★正丁醇部位组12 105.2±10.1★★ 43.86±4.07★★水部位组12 129.6±13.349.54±5.05

注: 与空白对照组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01

3.4 香椿子提取物对DN大鼠尿素氮、肌酐的影响情况

表3 香椿子提取物对DN大鼠尿素氮、肌酐的影响情况()

组别动物数（只）BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)空白对照组106.39±0.5864.35±9.47模型对照组10 18.47±3.56▲▲ 98.72±12.34▲▲石油醚部位组12 15.82±2.84 90.26±11.05乙酸乙酯部位组12 14.51±3.73★ 87.65±9.78★正丁醇部位组12 10.06±1.85★★ 78.54±6.83★★水部位组12 16.24±2.25 89.71±10.17

注: 与空白对照组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01

从以上实验结果可以看出：正丁醇部位组能够显著增加 DN大鼠体重，减少DN大鼠24 h尿量及肾重体重比，减轻DN大鼠 24 h尿蛋白排泄量，改善大鼠尿素氮及血肌酐情况，从而改善DN大鼠肾功能（P＜0.01）；乙酸乙酯部位组具有保护DN大鼠肾功能作用（P＜0.05）；石油醚部位组和水部位组对DN大鼠肾功能的保护无统计学意义（P＞0.05）。