用于抗微生物剂抗性测定的方法 相关申请的交叉引用
本 申 请 要 求 于 2009 年 5 月 7 日 提 交 的 标 题 为 “Methods for AntimicrobialResistance Determination( 用于抗微生物剂抗性测定的方法 )” 的美国临 时专利申请第 61/215,594 号的权益， 其在本文中并入。
发明领域
本发明涉及用于测定微生物的抗生素抗性状况的方法和系统。 本发明还提供了用 于在单个系统内原位测定微生物的抗生素抗性状况的方法。
发明背景
血流感染伴有高发病率和高死亡率， 然而目前的诊断方法 ： 培养、 随后生化鉴定和 抗生素敏感性检验， 可需要数天来进行。通常， 基于临床症状启动经验疗法， 且检验结果仅 在起始疗法失败时影响临床决策。阳性血液培养结果之后 1 小时内鉴定血流感染的能力将 显著地提高所提供的诊断信息的临床相关性。已提出了分子扩增方法来满足该需求， 但对 于该方法存在严重的挑战。阳性血液培养物肉汤本身代表具有用于多种快速鉴定 (ID) 检 验的可能性的微生物的天然扩增群体。
甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)(MRSA) 是可以甚至在 健康患者中快速导致感染的危险的社区获得性和医院获得性病原体。 其也常作为正常菌群 存在于大量年老的和患病的患者中， 并在健康护理环境中具有快速交叉感染多个患者的能 力。 “甲氧西林抗性” 的机制基本上由称作 PBP2a 的改变的青霉素结合蛋白 2 的产生来介 导， 其保留了功能性酶活性但对于 β- 内酰胺抗生素具有显著降低的亲和力。万古霉素抗 性肠球菌 (enterococci)(VRE) 是需要立即鉴定的另一组危险的病原体。以与甲氧西林抗 性相似的方式， 万古霉素抗性也是由抗生素对其细胞膜靶标的降低的亲和力来介导。
目前鉴定 MRSA 和 VRE 的方法是劳动强度大的且由于可能导致使用者的气溶胶暴 露的步骤而可能是不安全的。 迫切需要快速且安全和可靠的方法以分离血液培养物肉汤中 所含的微生物， 其适合快速测定抗性。本发明提供了这样的方法。
发明概述
本发明提供了用于测定微生物的抗生素抗性状况的方法。 该方法允许比现有技术 更快地测定微生物的抗生素抗性状况， 导致更快的诊断 ( 例如， 在患有或怀疑患有败血症 和 / 或其他感染的受试者中 ) 和受污染物质 ( 例如， 食品、 供水和药品 ) 的表征。包括在本 发明方法中的步骤——从获得样品至微生物的抗生素抗性状况的测定， 可在非常短的时间 范围中进行以产生临床相关的可操作的信息， 例如， 在少于约 240 分钟之内。此外， 本发明 的方法可以完全自动化， 从而降低了操作传染性材料的风险和 / 或污染样品的风险。
本发明的第一方面涉及测定微生物的抗生素抗性状况的方法， 包括 ：
(a) 在可形成微生物 / 抗性测定亲和配体复合物的条件下， 将微生物与抗性测定 亲和配体相接触 ；
(b) 将 (a) 中形成的微生物 / 抗性测定亲和配体复合物与未结合的抗性测定亲和配体相分离 ；
(c) 测定微生物 / 抗性测定亲和配体复合物中与微生物结合的抗性测定亲和配体 的量 ； 和
(d) 将微生物 / 抗性测定亲和配体复合物中与微生物结合的抗性测定亲和配体的 量与被同样的微生物的已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株或已知的抗生素敏感性或 抗生素抗性菌株的群体所结合的抗性测定亲和配体的量相比较 ；
其中如果微生物 / 抗性测定亲和配体复合物中的微生物结合的抗性测定亲和配 体的量与被抗生素敏感性微生物结合的抗性测定亲和配体的量不同， 或微生物 / 抗性测定 亲和配体复合物中的微生物结合的抗性测定亲和配体的量与被抗生素敏感性微生物结合 的抗性测定亲和配体的量相同， 那么将该微生物鉴定为抗生素抗性的。
在另一方面， 本发明涉及用于测定微生物的抗生素抗性状况的方法， 包括 ：
(a) 获得已知含有或可能含有微生物的检验样品 ；
(b) 在可形成微生物 / 抗性测定亲和配体复合物的条件下将检验样品中的微生物 与抗性测定亲和配体相接触 ；
(c) 任选地添加测量细胞新陈代谢或膜完整性的一种或多种荧光染料 ；
(d) 任选地选择性地裂解可能存在于样品中的任何非微生物细胞以产生裂解的样 品；
(e) 将微生物与所述检验样品或所述裂解的样品中的其他组分相分离， 以形成微 生物的沉淀物 (pellet) ；
(f) 探测该沉淀物以产生微生物的测量结果 ；
(g) 通过将该测量结果与针对同种的抗生素抗性和 / 或抗生素敏感性微生物所取 得的或预测的测量结果相比较而在所基于的检验样品中测定微生物的抗生素抗性状况。
在一个实施方案中， 分离步骤通过以下来进行 ： 将微生物 / 抗性测定亲和配体复 合物层叠 (layering) 在容器 ( 例如， 气密密封的容器 ) 中的密度垫层 (density cushion) 上并离心该容器以沉淀该微生物 / 抗性测定亲和配体复合物， 同时含有未结合的配体的培 养基保留在密度垫层的顶部。在另一个实施方案中， 容器在底部和 / 或侧部具有光学窗口 从而可对微生物 / 抗性测定亲和配体复合物沉淀物进行分光镜探测以用于测定步骤。可通 过将沉淀物的光谱与已知抗生素抗性状况的微生物的一个或多个光谱相比较而测定微生 物的抗生素抗性状况。无需进一步操作而直接在沉淀物中和 / 或气密密封的容器中测定微 生物的抗生素抗性状况的能力增强了微生物鉴定的安全性。
在一个实施方案中， 测定步骤通过回收微生物 / 抗性测定亲和配体复合物沉淀 物、 在适宜的培养基中重悬微生物和诸如利用分光镜方法探测该重悬的微生物来进行。在 另一个实施方案中， 方法还包括对重悬的微生物进行进一步的鉴定和 / 或表征检验 ( 例如， 药物抗性、 毒力因子、 抗菌谱 )。
在另一方面， 本发明涉及用于测定微生物的抗生素抗性状况的系统， 包括 ：
(a) 容器， 所述容器包括微生物或含有微生物的样品、 和抗性测定亲和配体 ；
(b) 密度垫层 ； 和
(c) 提供测量结果的分光计 ；
其中所述测量结果测定已通过在所述系统内原位分离而在所述容器中浓缩的微生物的抗生素抗性状况。在另一个实施方案中， 系统包括用于将微生物与未结合的抗性测 定亲和配体相分离的离心机。
本文的附图和以下所列的描述中更详细地解释了本发明。
附图简述
图 1 显示了用 BOCILLINTM-FL(BODIPY FL- 标记的青霉素 ) 进行的甲氧西林敏感性 金黄色葡萄球菌 (MSSA) 菌株和甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 (MRSA) 菌株的代谢标记。
图 2 显示了 BOCILLINTM-FL 与 MSSA 菌株和 MRSA 菌株结合的时间过程。
图 3 显示了 BOCILLINTM-FL 与 MSSA 菌株和 MRSA 菌株结合的滴定。
图 4 显示了 BOCILLINTM-FL 与不同的 MSSA 菌株和 MRSA 菌株的结合。
发明详述
本发明能够以不同形式具体实施， 并且不应理解为被本文所述实施方案所限制。 相反， 提供这些实施方案以使得本公开内容将是透彻和完整的， 且这些实施方案将完全地 将本发明范围传达给本领域技术人员。例如， 就一个实施方案阐述的特征可以并入到其他 实施方案中， 且就一个特定的实施方案阐述的特征可以从该实施方案中删除。 另外， 针对本 文建议的实施方案的多种变化和添加， 从本公开内容的角度来说， 将对本领域技术人员是 明显的， 并不背离本发明。 除非另外定义， 本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域技术 人员通常理解的相同含义。 在此用于描述本发明的术语仅仅是用于描述特定的实施方案的 目的， 而并非旨在限制本发明。
定义
如本文所用， “一” 、 “一个” 或 “该” 可指一个或多于一个。例如， “一个” 细胞可以 指一个单独的细胞或是多个细胞。
另如本文所用， “和 / 或” 是指并且涵盖所列相关事项中的一个或多个的任何和所 有可能的组合， 以及当二选一说明时的不组合 (“或” )。
此外， 如本文所用的术语 “大约” 当涉及可测量的数值时， 例如本发明的化合物或 剂的量、 剂量、 时间、 温度等等， 意在涵盖指定量的 ±20％、 ±10％、 ±5％、 ±1％、 ±0.5％、 或者甚至 ±0.1％的变化。
如本文所用的， 术语 “微生物”旨在涵盖可以在实验室中繁殖和操作的通常是 单细胞的生物， 包括但不限于， 任何组合的革兰氏阳性菌、 革兰氏阴性菌、 酵母、 霉菌、 寄生物和柔膜体。本发明的革兰氏阴性菌的非限制性例子包括以下的属的细菌 ： 假 单 胞 菌 属 (Pseudomonas)、 埃 希 氏 菌 属 (Escherichia)、 沙 门 氏 菌 属 (Salmonella)、 志 贺 氏 菌 属 (Shigella)、 肠 杆 菌 属 (Enterobacter)、 克 雷 白 氏 菌 属 (Klebsiella)、 沙雷 氏 菌 属 (Serratia)、 变 形 菌 属 (Proteus)、 弯 曲 杆 菌 属 (Campylobacter)、 嗜血杆菌属 (Haemophilus)、 摩 根 氏 菌 属 (Morganella)、 弧 菌 属 (Vibrio)、 耶 尔 森 菌 属 (Yersinia)、 不 动 杆 菌 属 (Acinetobacter)、 募 养 单 胞 菌 属 (Stenotrophomonas)、 短波单胞菌属 (Brevundimonas)、 劳 尔 氏 菌 属 (Ralstonia)、 无 色 杆 菌 属 (Achromobacter)、 梭形杆菌 属 (Fusobacterium)、 普 雷 沃 氏 菌 属 (Prevotella)、 布 兰 汉 氏 球 菌 属 (Branhamella)、 奈 瑟菌属 (Neisseria)、 伯克霍尔德菌属 (Burkholderia)、 柠檬酸杆菌属 (Citrobacter)、 哈 夫 尼 菌 属 (Hafnia)、 爱 德 华 菌 属 (Edwardsiella)、 气 单 胞 菌 属 (Aeromonas)、 莫拉菌
属 (Moraxella)、 布 氏 菌 属 (Brucella)、 巴 斯 德 菌 属 (Pasteurella)、 普罗威登斯菌属 (Providencia) 和军团菌属 (Legionella)。本发明的革兰氏阳性菌的非限制性例子包 括下列属的细菌 ： 肠 球 菌 属 (Enterococcus)、 链 球 菌 属 (Streptococcus)、 葡萄球菌属 (Staphylococcus)、 芽 孢 杆 菌 属 (Bacillus)、 类 芽 孢 杆 菌 属 (Paenibacillus)、 乳杆菌 属 (Lactobacillus)、 李 斯 特 菌 属 (Listeria)、 消 化 链 球 菌 属 (Peptostreptococcus)、 丙 酸 杆 菌 属 (Propionibacterium)、 梭 菌 属 (Clostridium)、 拟 杆 菌 属 (Bacteroides)、 加 德 纳 菌 属 (Gardnerella)、 库 克 菌 属 (Kocuria)、 乳 球 菌 属 (Lactococcus)、 明串珠菌 属 (Leuconostoc)、 微球菌属 (Micrococcus)、 分枝杆菌属 (Mycobacteria) 和棒状杆菌属 (Corynebacteria)。本发明的酵母和霉菌的非限制性例子包括下列属的那些 ： 念珠菌属 (Candida)、 隐球菌属 (Cryptococcus)、 诺卡氏菌属 (Nocardia)、 青霉属 (Penicillium)、 链 格 孢 属 (Alternaria)、 赤 酿 母 属 (Rhodotorula)、 曲 霉 属 (Aspergillus)、 梭霉菌属 (Fusarium)、 酵母属 (Saccharomyces) 和毛孢子菌属 (Trichosporon)。本发明的寄生物 的非限制性例子包括下列属的那些 ： 锥虫属 (Trypanosoma)、 巴贝虫属 (Babesia)、 利什曼 原虫属 (Leishmania)、 疟原虫属 (Plasmodium)、 吴策线虫属 (Wucheria)、 布鲁格氏丝虫属 (Brugia)、 盘尾属 (Onchocerca) 和耐格里原虫属 (Naegleria)。本发明的柔膜体的非限制 性例子包括下列属的那些 ： 支原体属 (Mycoplasma) 和脲原体属 (Ureaplasma)。 如本文所用的， 术语 “分离” 旨在涵盖已从其原始状态或从其生长介质或培养介质 中取出、 浓缩或以其他方式分开的微生物的任何样品。例如， 根据本发明， 微生物可与可能 另外干扰表征和 / 或鉴定的非微生物或非微生物组分分开 ( 例如， 作为分离的样品 )。 该术 语可包括夹在两个其他层之间的微生物层， 例如， 离心之后在高密度垫层的顶部收集的微 生物， 或在固体表面 ( 例如， 滤膜 ) 收集的微生物层。该术语还可包括已部分地穿过层 ( 例 如， 密度垫层 ) 的微生物的集合。这样， 分离的微生物样品可包括比原始样品更为浓缩的、 或与原始样品分开的微生物和 / 或其组分的任何集合或层， 且范围可以从微生物的紧密堆 积的集簇到微生物的弥漫的层。可包括在分离的形式或样品中的微生物组分包括， 但不限 于， 任何组合的菌毛、 鞭毛、 纤毛和荚膜。与微生物分离的非微生物组分可包括非微生物细 胞 ( 例如， 血细胞和 / 或其他组织细胞 ) 和 / 或其任何组分。
如本文所用的， 术语 “沉淀物” 旨在涵盖已压缩成或沉积成微生物的团块 (mass) 的任何微生物样品。例如， 通过离心或本领域中其他已知方法可将来自样品的微生物压缩 或沉积成管底部的团块。该术语包括离心后容器的底部和 / 或侧部的微生物 ( 和 / 或其组 分 ) 的集合。可包括在沉淀物中的微生物组分包括但不限于， 任何组合的菌毛、 鞭毛、 纤毛 和荚膜。根据本发明， 微生物可以从可能另外干扰表征和 / 或鉴定的非微生物或非微生物 组分中沉淀出来 ( 例如， 作为基本上纯化的微生物沉淀物 )。 与微生物分离的非微生物组分 可包括非微生物细胞 ( 例如， 血细胞和 / 或其他组织细胞 ) 和 / 或其任何组分。
如本文所用的， 术语 “密度垫层” 指整体上具有均一密度的溶液。
如本文所用的， 术语 “抗性测定亲和配体” 指与抗生素抗性微生物结合的程度 ( 例 如， 结合的配体的量、 结合度、 和 / 或结合的亲和力， 等等 ) 与同样的微生物的抗生素敏感性 菌株相比不同的任何可检测化合物或分子。如本文所用的， 该术语包括未标记的配体和已 与可检测的标记物轭合的配体。在一些实施方案中， 抗性测定亲和配体以与抗生素敏感性 菌株结合的程度相比较低的程度与抗生素抗性菌株结合。在其他实施方案中， 抗性测定亲
和配体以与抗生素敏感性菌株结合的程度相比较高的程度与抗生素抗性菌株结合。
如本文所用的， 当术语 “结合” 用于抗性测定亲和配体时， 指该配体与微生物的物 理缔合。该术语包括配体与微生物的实际物理结合， 例如， 与微生物的结构 ( 例如胞内或表 面蛋白、 核酸、 细胞器、 细胞膜、 细胞壁， 等等 ) 的共价或非共价结合。该术语还包括配体与 微生物不涉及物理结合的缔合， 例如， 配体捕获 (trapping) 到微生物的内部。例如， 抗性测 定亲和配体可包括胞内酶的酶底物， 且当酶作用于配体之后配体被捕获到细胞内部。
如本文所用的， 术语 “同样的微生物” 指与感兴趣的微生物同样的属和种的微生 物。
如本文所用的， 术语 “结合不同的量” 、 “结合的配体的量的差异” 及其变化形式指 两个微生物之间的抗性测定亲和配体的结合的量的统计学显著的差异。结合的 “统计学显 著” 的差异为至少约 5％， 例如， 至少约 10％、 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 100％、 150％、 200％或更多。术语 “结合相同的量” 和其变化形式指两个微生物之间的抗性 测定亲和配体的结合的量的差异小于约 15％、 10％、 5％、 1％或更少。结合的配体的量可通 过本领域中的技术人员已知的任何方法来测定， 例如， 通过测量配体的固有性质或与配体 连接的可检测标记物的性质来测定。 如本文所用的， 术语 “不同的结合亲和力” 、 “配体的结合亲和力的差异” 及其变化 形式指两个微生物之间的抗性测定亲和配体的结合亲和力的差异为至少约 5％， 例如， 至少 约 10％、 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 100％、 150％、 200％或更多。术语 “相同的结合亲和力” 和其变化形式指两个微生物之间的抗性测定亲和配体的结合亲和力 的差异小于约 20％， 例如， 小于约 15％、 10％、 5％、 1％或更少。配体的结合亲和力可通过本 领域中技术人员已知的任何方法来测定， 例如， 通过测量配体的固有性质或与配体连接的 可检测标记物的性质来测定。
本发明提供了用于测定微生物的抗生素抗性状况的方法。 该快速方法允许比现有 技术更快地测定微生物的抗生素抗性状况， 导致更快速的诊断 ( 例如， 在患有或怀疑患有 败血症和 / 或其他感染的受试者中 ) 和受污染材料 ( 例如， 食品、 供水和药品 ) 的表征。本 发明的方法中包括的步骤， 从获得样品至测定微生物的抗生素抗性状况， 可在非常短的时 间范围中进行以获得临床相关的可操作信息。在某些实施方案中， 本发明的方法可在少于 约 240 分钟内进行， 例如， 在少于约 180、 120、 110、 100、 90、 80、 70、 60、 50、 40、 30、 20、 15、 10、 5、 4、 3、 2 或 1 分钟内进行。本发明的方法的极快速性显示了超越现有方法的改进。本方法 可用于测定本文所描述的任何微生物的抗生素抗性状况。在一个实施方案中， 微生物是细 菌。在另一个实施方案中， 微生物是酵母。在另一个实施方案中， 微生物是霉菌。在另一个 实施方案中， 微生物是寄生物。在另一个实施方案中， 微生物是柔膜体。此外， 本发明的方 法可以部分地或完全地自动化， 从而降低了处理传染性材料和 / 或污染样品的风险。
本发明的第一方面涉及测定微生物的抗生素抗性状况的方法， 包括 ：
(a) 在可形成微生物 / 抗性测定亲和配体复合物的条件下， 将微生物与抗性测定 亲和配体相接触 ；
(b) 将 (a) 中形成的微生物 / 抗性测定亲和配体复合物与未结合的抗性测定亲和 配体相分离 ；
(c) 测定微生物 / 抗性测定亲和配体复合物中的与微生物结合的抗性测定亲和配
体的量 ； 和
(d) 将微生物 / 抗性测定亲和配体复合物中的与微生物结合的抗性测定亲和配体 的量与被同样的微生物的已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株或已知的抗生素敏感性 或抗生素抗性菌株的群体所结合的抗性测定亲和配体的量相比较 ；
其中如果微生物 / 抗性测定亲和配体复合物中的微生物结合的抗性测定亲和配 体的量与抗生素敏感性微生物结合的抗性测定亲和配体的量不同， 或微生物 / 抗性测定亲 和配体复合物中的微生物结合的抗性测定亲和配体的量与抗生素抗性微生物结合的抗性 测定亲和配体的量相同， 那么则将微生物鉴定为抗生素抗性的。
在另一方面， 本发明涉及用于测定微生物的抗生素抗性状况的方法， 包括 ：
(a) 获得已知含有或可能含有微生物的检验样品 ；
(b) 在可形成微生物 / 抗性测定亲和配体复合物的条件下将检验样品中的微生物 与抗性测定亲和配体相接触 ；
(c) 任选地添加一种或多种测量细胞新陈代谢或膜完整性的荧光染料 ；
(d) 任选地选择性地裂解可能存在于样品中的任何非微生物细胞以产生裂解的样 品；
(e) 将微生物与所述检验样品或所述裂解的样品中的其他组分相分离， 以形成微 生物的沉淀物 ；
(f) 探测该沉淀物以产生微生物的测量结果 ；
(g) 通过将该测量结果与针对同种的抗生素抗性和 / 或抗生素敏感性微生物所取 得的或预测的测量结果相比较而在所基于的检验样品中测定微生物的抗生素抗性状况。
本发明的方法的一个优点是快速性， 该方法可被快速地进行。另一个优点是该方 法可对完整的微生物进行。 可进行抗生素抗性微生物的鉴定而不需要裂解或以其他方式破 坏微生物以， 例如， 暴露胞内组分或分离细胞膜， 虽然本文所描述的方法也可利用裂解的或 其他非完整的微生物来进行。因此， 不要求严格条件， 诸如极端 pH、 去污剂、 或加热。此外， 因为微生物不一定被测定方法破坏， 它们可保持对于进一步的检验或使用的可用性。
样品
在本发明的一些实施方案中， 待检验抗生素抗性的微生物存在于一个或多个样品 中。可通过本发明的方法检验的样品包括其中怀疑或可能怀疑微生物存在和 / 或生长的临 床样品和非临床样品， 以及常规地或偶然地检验微生物的存在的材料的样品。所用的样品 的量由于方法的通用性和 / 或敏感性可极大地不同。样品制备可通过本领域中技术人员已 知的任何数目的技术来进行， 尽管本发明的优点之一是复杂的样品类型诸如例如血液、 体 液、 和 / 或其他不透明物质， 可在极少或无大量预处理时利用该系统来直接检验。
可被检验的临床样品包括在临床实验室或研究实验室中通常检验的任何类型的 样品， 包括但不限于， 血液、 血清、 血浆、 血液成分、 关节液、 尿液、 精液、 唾液、 排泄物、 脑脊 液、 胃内容物、 阴道分泌物、 组织匀浆、 骨髓抽吸物、 骨匀浆、 痰、 抽吸物、 拭子和拭子冲洗物、 其他体液， 及类似的临床样品。
本发明应用于研究中以及兽医和医疗应用中。 可以自其获得临床样品的适宜的受 试者通常为哺乳动物受试者， 但可以是任何动物。如本文所用的术语 “哺乳动物” 包括但不 限于， 人类、 非人灵长类、 牛、 绵羊、 山羊、 猪、 马、 猫、 狗、 兔、 啮齿类 ( 例如， 大鼠或小鼠 )， 等等。人类受试者包括新生儿、 婴儿、 未成年人、 成人和老龄受试者。可以自其获得样品的受 试者包括但不限于， 哺乳动物、 鸟类、 爬行动物、 两栖动物和鱼类。
可以用于检验的非临床样品还包括以下物质， 其包括但不限于， 食品、 饮料、 药物、 化妆品、 水 ( 例如， 饮用水、 非饮用水和废水 )、 海水压载物 (seawater ballasts)、 空气、 土 壤、 污水、 植物材料 ( 例如， 种子、 叶、 茎、 根、 花、 果实 )、 血液制品 ( 例如， 血小板、 血清、 血浆、 白细胞成分， 等等 )、 供体器官或组织样品、 生物武器 (biowarfare) 样品， 和类似的非临床 样品。本方法还特别适于实时检验， 以监测工业环境、 商业环境和 / 或临床环境中污染水 平、 过程控制、 质量控制、 和类似情况。
在本发明的一个实施方案中， 样品获自具有或怀疑具有微生物感染的受试者 ( 例 如， 患者 )。在一个实施方案中， 受试者患有或怀疑患有败血症， 例如， 菌血症或真菌血症。 样品可以是直接来自受试者的血液样品。 样品可来自从患者血液的样品进行培养的血液培 养物， 例如， 血液培养物。 血液培养物样品可来自阳性血液培养物， 例如， 指 示微生物的存在的血液培养物。在某些实施方案中， 样品在阳性血液培养物呈现阳性之后 的短时间内取自该阳性血液培养物， 例如， 在约 6 小时内， 例如， 在约 5、 4、 3 或 2 小时内， 或 在约 60 分钟内， 例如， 约 55、 50、 45、 40、 35、 30、 25、 20、 15、 10、 5、 4、 3、 2 或 1 分钟。在一个实 施方案中， 样品取自其中微生物为对数期生长的培养物。 在另一个实施方案中， 样品取自其 中微生物处于稳定期的培养物。
本发明提供了检测抗生素抗性微生物的高度敏感性。 这使能够进行检测而不必首 先经过通过在固体或半固体培养基上培养微生物且从培养的菌落取样而分离微生物的步 骤。然而， 在本发明的一个实施方案中， 样品来自在固体或半固体表面生长的微生物 ( 例 如， 细菌、 酵母或霉菌 ) 菌落。
样品的体积应该足够大以产生微生物的可检测的量 ( 例如， 沉淀物 )， 可在进行本 发明的方法的分离步骤之后对其进行探测。适当的体积将取决于样品的来源和样品中微 生物的预期水平。例如， 每体积阳性血液样品将含有与待检验污染的饮水样品相比较高水 平的微生物， 因此与饮水样品相比将需要较小体积的血液培养基。通常， 样本量可以小于 约 50ml， 例如， 小于约 40、 30、 20、 15、 10、 5、 4、 3 或 2ml。在某些实施方案中， 样本量可以为约 1ml， 例如， 约 0.75、 0.5 或 0.25ml。在其中以微量进行分离的某些实施方案中， 样本量可小 于约 200μl， 例如， 小于约 150、 100、 50、 25、 20、 15、 10 或 5μl。在一些实施方案中 ( 例如， 当预计样品包括少量的微生物时 )， 样本量可以为约 100ml 或更多， 例如， 约 250、 500、 750 或 1000ml 或更多。
接触步骤
在本发明的一方面， 将微生物或含有微生物的样品与抗性测定亲和配体相接触。 在一个实施方案中， 接触可发生在样品介质中， 例如， 通过向样品添加配体。在另一个实施 方案中， 接触发生在其中导入了微生物和配体的结合混合物或组合物中。在另一个实施方 案中， 抗性测定亲和配体包含在分离容器中的密度垫层内。 在一个实施方案中， 抗性测定亲 和配体是抗生素， 例如青霉素或另外的 β- 内酰胺抗生素， 万古霉素或其他糖肽抗生素、 多 粘菌素 B 或头孢托罗 (ceftobiprole)， 以及其任何组合。 在另一个实施方案中， 抗性测定亲 和配体是单克隆的或多克隆的抗体或抗体片段、 核酸探针、 适体、 配体、 酶底物、 肽模拟物、 噬菌体来源的结合蛋白、 脂质、 碳水化合物、 多糖、 或蛋白、 或其任何组合。如果抗性测定亲和配体本身不发出可检测信号， 可对配体进行标记以提供可检测信号， 诸如通过将配体与 标志物 ( 例如， 可见的或荧光的标志物 ) 轭合。标志物包括， 但不限于， 荧光的、 发光的、 发 磷光的、 放射性的、 拉曼活性的、 质谱反应性的和 / 或比色的化合物。被标记的抗性测定亲 和配体可包括但不限于， 被标记的青霉素 ( 例如， BOCILLIN FL 青霉素 ) 和被标记的万古霉 素 ( 例如， BODIPY FL 万古霉素 )(Life Technologies， Carlsbad， CA)。
抗性测定亲和配体与微生物或含有微生物的样品的接触可通过任何方法来进行， 只要在配体和微生物之间存在可检测的量的结合 ( 例如， 形成微生物 / 抗性测定亲和配体 复合物 ) 且在与抗生素敏感性微生物和抗生素抗性微生物的结合量或结合亲和力上存在 可测量的差异。 与微生物形成接触的抗性测定亲和配体的量和接触的时间长度足以发生配 体与微生物的结合， 导致微生物 / 抗性测定亲和配体复合物形成， 且该量和接触的时间长 度将取决于多种因素， 包括微生物的类型、 配体的类型、 配体对微生物的亲和力、 配体的结 合靶标是胞外的或是胞内的、 温度、 缓冲条件等， 如对于本领域中的技术人员将是熟知的。 接触时间可以是， 例如， 约 240 分钟或更少， 例如， 约 180、 120、 90、 60、 50、 40、 30、 20、 10、 10、 5、 4、 3、 2、 1 分钟或更少。接触可发生在任何适宜于配体与微生物发生结合的温度下， 例如， 约 4℃至约 50℃， 例如， 约 15℃至约 40℃， 例如， 约 37℃或约室温。接触步骤可在适宜的容 器中进行， 例如， 在其中进行分离步骤的相同容器中或在分开的容器中。 分离步骤
微生物或含有微生物的样品与抗性测定亲和配体相接触且已经发生可检测或可 测量的量的配体与微生物的结合之后， 可进行分离步骤以将微生物 / 抗性测定亲和配体复 合物与未结合的抗性测定亲和配体相分离， 以及将微生物与样品和 / 或结合混合物或组合 物的其他组分相分离。在一个实施方案中， 分离步骤将微生物 / 抗性测定亲和配体复合物 浓缩成沉淀物， 可对所述沉淀物进行探测以测定微生物的抗生素抗性状况。微生物与样品 和 / 或结合混合物或组合物的其他组分的分离不必是彻底的， 即， 不需要发生 100％分离。 所需要的就是微生物与其他组分 ( 例如， 未结合的配体 ) 的分离足以允许微生物的探测而 没有来自其他组分的明显干扰。例如， 分离可导致至少约 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 95、 96、 97、 98 或 99％纯的或更高的纯的微生物沉淀物。
在一个实施方案中， 分离通过离心步骤来进行， 其中将微生物 / 抗性测定亲和配 体复合物放置在分离容器中的密度垫层的顶部， 且容器在复合物沉淀物在容器的底部和 / 或侧部且未结合的配体以及样品和 / 或结合混合物或组合物的其他组分留在密度垫层的 顶部上或在密度垫层的顶部内的条件下离心。 该分离将微生物与诸如培养基、 细胞碎片和 / 或可能干扰检测和 / 或测量抗性测定亲和配体与微生物的结合的其他组分等材料相分离。 在一个实施方案中， 密度垫层还充当将活的微生物与死的微生物 ( 其不完全地通过密度垫 层 ) 相分离的作用。在另一个实施方案中， 密度垫层在离心之前或离心之后不包括密度梯 度。换言之， 没有将分离容器离心足够量的时间和 / 或加速度以使构成密度垫层的材料形 成密度梯度。
选择垫层的密度以使样品和 / 或结合混合物或组合物中的微生物 / 抗性测定亲和 配体复合物穿过垫层而未结合的抗性测定亲和配体以及样品和 / 或结合混合物或组合物 中的其他组分 ( 例如， 血液培养肉汤、 细胞碎片 ) 保留在垫层的顶部或不穿过密度垫层的全 部通路。还可以选择密度以将活的微生物 ( 其穿过垫 ) 与死的微生物 ( 其不穿过垫 ) 分
离。适宜的密度将取决于密度垫层中所用的材料和待分离的样品。在一个实施方案中， 垫 层的密度在约 1.025 至约 1.120g/ml 的范围， 例如， 约 1.030 至约 1.070g/ml， 约 1.040 至 约 1.060g/ml， 或在约 1.025 至约 1.120g/ml 之间的任何范围。在另一个实施方案中， 垫层 的 密 度 为 约 1.025、 1.030、 1.035、 1.040、 1.045、 1.050、 1.055、 1.060、 1.065、 1.070、 1.075、 1.080、 1.085、 1.090、 1.095、 1.100、 1.105、 1.110、 1.115 或 1.120g/ml。
用于密度垫层的材料可以是具有用于本发明的方法的适当的密度范围的任何材 料或材料的组合。可用来制备密度垫层的适宜的材料包括低粘度、 高密度的油， 诸如显微 镜浸油 ( 例如， DF 型 ； Cargille Labs， New York) 和矿物油 ( 例如， 50， 的 ( 例如，TM5， DraketexPenreco Co.， Pennsylvania)。另一种适宜的材料是胶态二氧化硅。胶态 (W.R.Grace， CT)) 或涂覆的， 例如， 用硅烷涂覆 (Irvine Scientific， Santa (Nidacon Int’ l， Sweden)，二氧化硅可以是未涂覆的 ( 例如，St.Louis， MO)) 或用聚乙烯吡咯烷酮涂覆 Ana， CA) 或 Percoll Plus (Sigma-Aldrich， TM 的 ( 例如， Percoll (Sigma-Aldrich， St.Louis， MO))。在一个实施方案中， 选择表现出对 分光镜探测最少干扰的胶态二氧化硅， 例如， 具有最低内在荧光的材料。可将胶态二氧化 硅稀释于任何适宜的介质中以形成合适的密度， 所述介质例如平衡盐溶液、 生理盐水和 / 或 0.25M 蔗糖。适宜的密度可利用约 15％至约 80％ v/v、 例如， 约 20％至约 65％ v/v 的浓 度的胶态二氧化硅来获得。另一种适宜的材料是碘化造影剂 ( 例如， 碘海醇 (OmnipaqueTM 或 NycoPrepTM， ) 和碘克沙醇 (VisipaqueTM 或 OptiPrepTM)。 对于血液培养样品， 适宜的密度可利用约 10％至约 25％ w/v、 例如， 约 14％至约 18％ w/v 的浓度的碘海醇或碘 克沙醇来获得。对于血液培养样品， 蔗糖能够以约 10％至约 30％ w/v， 例如， 约 15％至约 20％ w/v 的浓度用作密度垫层。其他用于密度垫层的适宜的材料包括但不限于 ： 硅油 ( 聚 二甲基硅氧烷 )， 氟硅油， 硅凝胶， 例如对于血液培养样品在约 75％至约 100％的浓度的甲 泛影钠 量 )， (LymphoPrepTM)， 例如对于血液培养样品在约 25％至约 50％的浓度的泛影 F127、 山梨糖醇、 F68、 ( 例如， 化合物的混合物、 聚丙烯酸、 交联的聚乙烯 400， 对于血液培养样品在约 10％至约 15％ 葡胺 - 葡聚糖 (PolymorphoPrepTM)， 羧甲基纤维素， 羟丙基甲基纤维素、 聚氧化乙烯 ( 高分子 醇、 交联的聚乙烯吡咯烷、 PEG 甲醚甲基丙烯酸酯、 果胶、 琼脂糖、 黄原胶、 吉兰糖 (gellan)、 的浓度 )、 甘油、 葡聚糖 ( 例如， 对于血液培养样品在约 10％至约 15％的浓度 )、 糖原、 氯化 铯 ( 例如， 对于血液培养样品在约 15％至约 35％的浓度 )、 全氟化碳液体 ( 例如， 全氟正辛 烷 )、 氢氟碳液体 ( 例如， Vertrel XF) 和如本领域中熟知的类似物。密度垫层也可由材料 的组合构成， 包括以上所列的材料中的任意两个或多个的组合。 在一个实施方案中， 密度垫 层由浸油和矿物油的组合制成， 例如， 以约 0.8 份至约 1.2 份浸油比约 0.7 份至约 1.0 份矿 物油的比率。在一个实施方案中， 密度垫层包括 DF 浸油和 Drakeol 5 矿物油， 例如， 1.000 份 DF 型浸油 ： 0.875 份 Drakeol 5 矿物油。在另一个实施方案中， 密度垫层由氯化铯组成 ( 例如， 24％ w/v 氯化铯 )。
密度垫层的体积 / 高度应足以实现微生物 / 抗性测定亲和配体复合物与未结合 的抗性测定亲和配体以及样品和 / 或结合混合物或组合物的其他组分的分离。体积将取 决于分离容器的尺寸和形状。通常， 可使用约 0.1ml 至约 5ml 的体积， 例如， 约 0.2ml 至约1ml， 例如， 约 0.2ml 至约 0.5ml。如果分离以微量进行， 密度垫层的体积可以为约 1μl 至 约 100μl， 例如， 约 5μl 至约 50μl。置放或层叠在密度垫层的顶部的样品和 / 或结合混 合物或组合物的体积应足以提供足够的可检测和 / 或可测量的微生物， 例如， 以产生适宜 于探测的沉淀物。通常， 可使用适合容器的任何体积。例如， 可使用约 0.1ml 至约 5ml 的体 积， 例如， 约 0.2ml 至约 1ml， 例如， 约 0.2ml 至约 0.5ml。如果以微量进行分离， 体积可以为 约 1μl 至约 100μl， 例如， 约 5μl 至约 50μl。在某些实施方案中， 在将样品和 / 或结合 混合物或组合物放置在分离容器中之前可减少体积和 / 或提高微生物的浓度以使样品和 / 或结合混合物或组合物具有适合容器的适当的体积。例如， 样品和 / 或结合混合物或组合 物可被过滤以减少体积和 / 或收集微生物。容器中用于样品和 / 或结合混合物或组合物的 可用空间将取决于容器的尺寸和形状。在一些实施方案中， 可在将样品和 / 或结合混合物 或组合物置于或层叠在顶部之前将中间层 ( 液体或固体 ) 置于密度垫层的顶部以防止密度 垫层与样品和 / 或结合混合物或组合物的任何混合。在一个实施方案中， 中间层可以是聚 丙烯珠子。在另一个实施方案中， 可在密度垫层与样品和 / 或结合混合物或组合物之间安 置小气泡以防止混合。在另一个实施方案中， 可将密度垫层层叠在高密度材料 ( 例如， 全氟 化碳液体 ) 的顶部， 使得微生物 / 抗性测定亲和配体复合物在分离过程中穿过密度垫层并 聚集在密度垫层和高密度材料之间的界面。
在本发明的一个实施方案中， 离心分离容器以使微生物 / 抗性测定亲和配体复合 物直接在容器底部形成沉淀物。以足够的加速度离心容器并持续足够的时间以使微生物 / 抗性测定亲和配体复合物沉淀和 / 或与未结合的配体以及样品和 / 或结合混合物或组合物 的其他组分相分离。离心加速度可以为约 1,000x g 至约 20,000x g， 例如， 约 2,500x g 至 约 15,000x g， 例如， 约 7,500xg 至约 12,500xg， 等等。离心时间可以为约 30 秒至约 30 分 钟， 例如， 约 1 分钟至约 15 分钟， 例如， 约 1 分钟至约 5 分钟。离心可在约 2℃至约 45℃， 例如， 约 15℃至约 40℃， 例如， 约 20℃至约 30℃的温度下进行。在一个实施方案中， 分离 容器包括封盖， 且在离心前将该封盖应用于容器以形成气密密封。封盖的存在降低了处理 传染性的和 / 或有害的或可能为传染性的和 / 或有害的微生物的风险， 以及污染样品和 / 或结合混合物或组合物的风险。本发明的方法的优点之一是在密封的容器 ( 例如， 气密密 封容器 ) 中利用微生物进行方法的任何一个或多个步骤 ( 例如， 接触、 分离、 检测和 / 或比 较 )。本方法涉及自动化系统的使用， 避免了与处理高毒性微生物有关的健康和安全风险， 例如伴随从样品回收微生物以用于直接检验所发生的。在一个实施方案中， 不将容器离心 足以在密度垫层内形成密度梯度的时间和 / 或力。本发明不涉及超速离心， 例如， 以大于约 100,000xg 的力离心。并且， 本发明不涉及等密度 ( 平衡 ) 沉降或区带 (banding)。
分离容器可以是具有足以容纳密度垫层和样品和 / 或结合混合物或组合物的体 积的任何容器。在一个实施方案中， 容器适于或可使其适于离心机转子。容器的体积可以 为约 0.1ml 至约 25ml， 例如， 约 1ml 至约 10ml， 例如， 约 2ml 至约 8ml。如果分离以微量进 行， 容器的体积可以为约 2μl 至约 100μl， 例如， 约 5μl 至约 50μl。在一个实施方案中， 容器在上部具有宽的内径以容纳样品和 / 或结合混合物或组合物以及密度垫层的大部分， 且在下部具有较狭窄的内径， 其中收集微生物 / 抗性测定亲和配体复合物的沉淀物。狭窄 部分可具有约 0.04 英寸至约 0.12 英寸的内径， 例如， 约 0.06 英寸至约 0.10 英寸， 例如， 约 0.08 英寸。宽部分可具有约 0.32 英寸至约 0.40 英寸的内径， 例如， 约 0.34 英寸至约0.38 英寸， 例如， 约 0.36 英寸。对于微量分离， 内径可甚至更小。例如， 狭窄部分的内径可 以为约 0.001 英寸至约 0.04 英寸， 例如， 约 0.002 至约 0.01 英寸。逐渐变细的内径部分 可连接上部和下部。逐渐变细的部分可具有约 20 度至约 70 度的角度， 例如， 约 30 度至约 60 度。在一个实施方案中， 下部狭窄部分小于容器的总高度的一半， 例如， 小于容器的总高 度的约 40％、 30％、 20％或 10％。容器可具有连接的封盖装置或可以是带螺纹的以接受封 盖装置 ( 例如， 盖 ) 从而使容器在离心过程中可以是气密密封的。在某些实施方案中， 设计 容器使得分离之后可容易地手动地或以自动化的方式 ( 从而技术员不暴露于容器内容物 ) 从容器回收微生物沉淀物。 例如， 容器可包括可移除部分或拆卸部分， 所述可移除部分或拆 卸部分含有沉淀物且可与容器的其余部分分离。在另一个实施方案中， 容器包括用于在分 离之后接近沉淀物的部件， 例如用于插入针头和 / 或其他取样装置和 / 或用于吸去沉淀物 的一个或多个端口或可穿透表面。在一个实施方案中， 容器可以是管， 例如， 离心管。在另 一个实施方案中， 容器可以是小片 (chip) 或卡片。在一个实施方案中， 容器是独立的容器， 即， 用于分离单一样品的装置。 在其他实施方案中， 容器是包括两个或多个分离容器从而可 同时分离多个样品的装置的一部分。在一个实施方案中， 装置包括 2 个、 3 个、 4 个、 5 个、 6 个、 7 个、 8 个、 9 个、 10 个、 12 个、 15 个、 20 个、 25 个、 30 个、 36 个、 42 个、 48 个、 60 个、 72 个、 84 个、 96 个或更多个分离容器。在一个实施方案中， 分离容器是在于 2009 年 10 月 30 日提 交的标题为 “Separation Device for Usein the Separation， Characterization and/or Identification of Microorganisms( 用于微生物的分离、 表征和 / 或鉴定的分离装置 )” 的相关美国专利申请系列第 12/589,969 号中所公开的分离装置。
容器可包括光学窗口， 通过其可测定结合 ( 例如， 检测结合的量和 / 或测量结合亲 和力 )。光学窗口可以在容器的底部、 顶部、 和 / 或侧部。窗口可由透光 ( 例如， 近红外光 谱 (NIR ； 700nm-1400nm)、 紫外光谱 (UV ； 190nm-400nm) 和 / 或可见光谱 (VIS ； 400nm-700nm) 的至少一部分 ) 的任何材料组成。适宜的材料的例子包括但不限于， 丙烯酸酯 (acrylic)、 甲基丙烯酸酯、 石英、 熔凝硅石、 蓝宝石、 环烯烃共聚物 (COC)、 聚苯乙烯、 聚碳酸酯和 / 或 聚丙烯。在一个实施方案中， 整个容器由光学窗口材料制成。在另一个实施方案中， 容器 可由两个或多个分离的零件和组成容器其余部分的另一种材料 ( 例如， 成本较低的标准 模制塑料 ) 来制备 ( 例如， 模制 )， 所述两个或多个分离的零件例如用于光学窗口的光学 UV-VIS-NIR 透明组分。 在一个实施方案中， 光学窗口足够薄以允许分光镜探测， 这将取决于 窗口的材料。在另一个实施方案中， 光学窗口尽可能地薄以减少对分光镜探测的干扰。例 如， 窗口可具有小于约 0.20 英寸的厚度， 例如， 小于约 0.15、 0.10 或 0.05 英寸。
在另一个实施方案中， 分离通过过滤步骤来进行， 其中将样品和 / 或结合混合物 或组合物放置在装备有具有保留微生物的孔径的选择性过滤器或过滤器组的装置中。 保留 的微生物可通过将适宜的缓冲液平缓地通过过滤器来洗涤。 且然后可直接在过滤器上对被 洗涤的微生物进行探测和 / 或通过从过滤器表面直接取样或通过用适宜的缓冲溶液反冲 洗过滤器而回收被洗涤的微生物以用于探测。
任选的裂解步骤
在本发明的方法的一些实施方案中， 可任选地处理 ( 例如， 在分离步骤之前 ) 包括 微生物的样品以选择性地裂解可能存在于样品中的非微生物细胞 ( 例如， 非期望的细胞 )， 诸如血细胞和 / 或组织细胞。裂解细胞以允许微生物与样品中的其他组分相分离。微生物与其他组分的分离避免了检测步骤中的干扰。 如果预期非微生物细胞在样品中不存在或可 能不存在， 或预期其不干扰检测步骤， 则不必进行裂解步骤。在一个实施方案中， 待裂解的 细胞是存在于样品中的非微生物细胞， 且可能存在于样品中的微生物细胞没有被裂解。然 而， 在一些实施方案中， 特定种类的微生物的选择性裂解可能是期望的， 且因此可根据本文 所描述的方法和如本领域中所熟知的方法来进行。例如， 可选择性地裂解一类非期望的微 生物， 例如， 裂解酵母而不裂解细菌， 或反之亦然。 在另一个实施方案中， 裂解所期望的微生 物以分离微生物的特定亚细胞组分， 例如， 细胞膜或细胞器。在一个实施方案中， 裂解所有 的非微生物细胞。 在其他的实施方案中， 裂解一部分非微生物细胞， 例如， 足够的细胞， 以防 止干扰检测步骤。 细胞的裂解可通过本领域中已知的任何有效的方法来进行以选择性地裂 解细胞同时裂解或不裂解微生物， 所述方法包括但不限于， 裂解液的添加、 超声、 渗透休克、 冻融循环、 化学处理和 / 或其组合。
裂解液是能够裂解细胞的溶液， 所述细胞例如， 非微生物细胞 ( 例如， 通过溶解真 核细胞膜 ) 和 / 或微生物细胞。在一个实施方案中， 裂解液可包括一种或多种去污剂、 一 种或多种酶、 或一种或多种去污剂与一种或多种酶的组合， 且还可包括其他的剂。在一个 实施方案中， 去污剂可以是非变性的裂解性去污剂， 诸如 X-114、 NP-40、 Genapol C-100、 Genapol X-100、 X-100 X-100-R、 CA 630、 ArlasolveTM200、96/97、 CHAPS、 辛基 β-D- 吡喃葡萄糖苷、 皂苷、 单十二烷基九乙二醇醚 (C12E9， 聚多 卡醇 (polidocenol))， 和聚氧乙烯醚 (C12E10， 例如， C-100)。任选地， 可包括变性裂解性去污剂， 例如十二烷基硫酸钠、 N- 月桂基肌氨酸、 脱氧胆酸钠、 胆汁盐类、 溴化 十六烷基三甲基铵、 SB3-10、 SB3-12、 酰氨基磺基甜菜碱 -14(amidosulfobetaine-14) 和 C7BzO。任选地， 还可包括增溶剂， 例如 20、 L64、 P84、 98、 58、 35、 80、 F108、 非去污剂磺基甜菜碱 (NDSB 201)、 两亲高分子 (amphipol)(PMAL-C8) 和甲基 -β- 环糊精。通常， 使用高于临界胶束浓度 (CMC) 的浓度的非变性去污剂和增溶剂， 而变性去污剂可以低于其 CMC 的浓度来添加。例如， 可使 用约 0.010％至约 10％， 例如， 约 0.015％至约 1.0％， 例如， 约 0.05％至约 0.5％， 例如， 约 0.10％至约 0.30％的浓度 ( 样品稀释后的终浓度 ) 的非变性裂解去污剂。 在另一个实施方 案中， 聚氧乙烯去污剂去污剂可能是优选的。聚氧乙烯去污剂可包括结构 C12-18/E9-10， 其中 C12-18 代表从 12 个碳原子至 18 个碳原子的碳链长度和 E9-10 代表从 9 个到 10 个氧乙烯 亲水性首基。
例 如， 聚氧乙烯去污剂可选自由以下组成的组：97、96V、GenapolC-100、 Genapol X-100、 聚多卡醇， 或它们的组合。可用于裂解液中的酶包括， 但不 限于， 消化核酸和其他膜污垢物质的酶 ( 例如， 蛋白酶 XXIII、 DNA 酶、 神经氨酸酶、 多糖酶、 )。可使用的其他添加剂包括但不限于， 还原剂诸如 2- 巯基乙 醇 (2-Me) 或二硫苏糖醇 (DTT)， 和稳定剂诸如镁、 丙酮酸盐， 和湿润剂。裂解液可在适宜于 裂解期望的细胞的任何 pH 下缓冲， 且将取决于多种因素， 包括但不限于， 样品的类型、 待裂 解的细胞和所用的去污剂。在一些实施方案中， pH 可以在约 2 至约 13 的范围中， 例如， 约 6 至约 13， 例如， 约 8 至约 13， 例如， 约 10 至约 13。适宜的 pH 缓冲液包括能够将 pH 维持在 期望的范围中的任何缓冲液， 例如， 约 0.05M 至约 1.0M CAPS。在一个实施方案中， 将样品与裂解液混合且然后孵育足以发生细胞膜的裂解和溶 解的时间， 例如， 约 1、 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25、 30、 40、 50 或 60 秒， 或约 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15 或 20 分钟或更长， 例如， 约 1 秒至约 20 分钟， 约 1 秒至约 5 分钟， 或约 1 秒至约 2 分钟。 孵育时间将取决于裂解液的强度， 例如， 去污剂和 / 或酶的浓度和裂解的温度。一般来说， 较弱的裂解缓冲液将需要更多时间和更大的样品稀释度以完全溶解非微生物细胞。 裂解液 的强度可根据已知存在于或怀疑存在于样品中的微生物来选择。 对于对裂解更敏感的微生 物， 可使用弱的裂解液。裂解可在约 2℃至约 45℃的温度发生， 例如， 约 15℃至约 40℃， 例 如， 约 30℃至约 40℃。在一个实施方案中， 可将裂解液载入注射器中且然后可将样品吸入 注射器中从而在注射器中进行混合和孵育。
在一些实施方案中， 裂解条件 ( 例如， 溶液或孵育时间 )， 以及分离和 / 或探测步 骤， 可足以杀死样品中的一些或所有微生物。本发明的方法是高度灵活的且进行分离和鉴 定不需要活的微生物。 在某些实施方案中， 微生物中的一些或全部可以是死的， 死亡发生在 进行方法的步骤之前、 进行方法的步骤期间和 / 或进行方法的步骤之后。
检测 / 比较步骤
一旦微生物 / 抗性测定亲和配体复合物已与未结合的抗性测定亲和配体分离， 可 检测和 / 或测量与微生物结合的抗性测定亲和配体的量或配体的结合亲和力。如果通过离 心分离微生物 / 抗性测定亲和配体复合物以产生沉淀物， 可对所述沉淀物进行探测以检测 抗性测定亲和配体的结合的量或结合亲和力。在一个实施方案中， 探测以非侵入性的方式 进行， 即， 当沉淀物保留在分离容器中时对其进行探测。在另一个实施方案中， 在探测期间 分离容器保持密封。以非侵入方式鉴定抗生素抗性微生物、 任选地同时在分离和表征过程 中保持容器密封和使程序中的一些或全部自动化的能力避免了污染的和 / 或传染性的样 品的持续操作并极大提高了整个过程的安全性。此外， 通过直接探测而不对沉淀物进行另 外的处理 ( 例如， 重悬、 铺板和菌落的培养 ) 来表征微生物的能力， 极大提高了可进行抗生 素抗性微生物的鉴定的速度。
在本发明的某些方面， 方法包括在探测微生物之前从分离容器中回收在分离步骤 过程中形成的微生物 / 抗性测定亲和配体复合物的沉淀物或其部分。例如， 在形成沉淀物 之后， 可将液体吸离沉淀物并将沉淀物重悬于适宜的介质 ( 例如， 在其中微生物为活的的 介质 ) 中。可将重悬的微生物从分离容器中移除。然后可探测微生物以检测配体结合或亲 和力， 例如， 在悬浮液中或在已将它们再沉淀之后进行探测。在其他的实施方案中， 可在分 离容器中对重悬的微生物进行探测， 例如， 在悬浮液中或在已将它们再沉淀之后进行探测。 在另一个实施方案中， 原位探测之后回收和 / 或重悬沉淀物并然后进行进一步的探测。例 如， 对于回收的和 / 或重悬的微生物可进行可应用于分离的微生物而非微生物的沉淀物的 技术， 诸如胶乳凝集检验或自动化表型鉴定检验。 在另一个实施方案中， 可将从沉淀物回收 的微生物直接用于进一步的探测 ( 例如， 质谱 ) 而不进行重悬。
在一些实施方案中， 可对沉淀物和 / 或重悬的微生物进行分光镜探测。可使用光 谱学来分析抗性测定亲和配体的性质 ( 例如， 内在性质或结合的标记物的性质 ) 以检测结 合。除检测抗性测定亲和配体之外， 还可使用光谱学来分析复合物中的微生物的一种或多 种内在性质 ( 例如， 内在荧光 )， 例如， 无外加剂 (additional agent) 诸如染色剂、 染料、 粘 合剂等时微生物中存在的性质。 微生物， 尤其是细菌， 其内在荧光或自发荧光利用了细菌含有天然荧光团 ( 例如， 色氨酸、 酪氨酸、 苯丙氨酸、 NADH 和黄素 ) 的事实， 所述天然荧光团可 经由多波长光源激发。在这些实施方案中， 抗性测定亲和配体的结合可与微生物的内在性 质信号相比较， 且可在每个细胞基础上计算结合的配体的量。 可利用诸如荧光光谱、 漫反射 光谱、 吸收和透射光谱、 红外光谱、 太赫兹光谱、 拉曼光谱进行探测， 所述拉曼光谱包括表面 增强拉曼光谱 (SERS)、 空间偏移拉曼光谱和 / 或共振拉曼光谱来。为增强拉曼 (SERS) 和 荧光信号， 可在离心之前用金和 / 或银纳米颗粒涂覆微生物， 和 / 或可用特定尺寸和形状 的金属胶体来预涂覆内部光学表面 (Lakowicz， Anal.Biochem.337 ： 171(2005) 关于荧光 ； Efrima 等人， J.Phys.Chem.B.(Letter)102 ： 5947(1998) 关于 SERS)。 在另一个实施方案中， 纳米颗粒在离心之前存在于密度垫层中并当微生物穿过密度垫层时与微生物缔合。 在其他 的实施方案中， 可利用质谱技术探测微生物 ( 重悬的或沉淀物中的微生物 )， 所述质谱技术 诸如 MALDI-TOF 质谱、 DESI 质谱、 GC 质谱、 LC 质谱和选择离子流动管 (SIFT) 质谱。在一个 实施方案中， 当沉淀物保留在分离容器中时探测该沉淀物。可通过容器中的光学窗口对容 器进行探测。 光学窗口可在容器的底部和 / 或任何一侧或多侧和 / 或顶部上。 在一个实施方 案中， 在适宜于探测的位置中， 分离容器适合于分光计中的支持器 (holder) 或可使分离容 器适合于分光计中的支持器。 可通过本领域那些技术人员已知的有效检测抗性测定亲和配 体和 / 或微生物的一种或多种内在性质或外在性质的任何技术来进行分光镜探测。例如， 正表面荧光 ( 激发光和发射光进入其中并离开相同的光学表面， 且如果样品是一般光学厚 度的， 则激发光穿透非常短的距离进入到样品中 ( 参见， 例如， Eisinger， J.， 和 J.Flores， “Front-face fluorometry of liquid samples， ” ( 液体样品的正表面荧光测定术 )Anal. Biochem.94 ： 15(1983))， 可用来检测沉淀物中的微生物。其他形式的测量， 诸如， 落射荧光 (epifluorescence)、 反射系数、 吸光度和 / 或散射测量， 也可用于本发明。在本发明的某些 方面， 除分析微生物的一种或多种内在性质以用于在每个细胞基础上测定配体结合的目的 之外， 内在性质可用来鉴定微生物。 在一个实施方案中， 将微生物的内在性质与已知生物的 内在性质的数据库相比较以鉴定微生物。
在另一个实施方案中， 抗性的测定可通过测量检验微生物的测量性质的改变 ( 例 如， 内在荧光性质的改变 ) 和 / 或通过用于监测新陈代谢或膜完整性的荧光染料的使用来 间接地进行。 根据本实施方案， 配体或剂本身不需要发出可检测信号或被标记可检测信号， 因为抗性通过间接测量由配体或剂与检验微生物的结合引起的可测量性质的改变 ( 例如， 内在荧光性质的改变 ) 来测定。例如， 未标记的抗生素的结合和 / 或暴露可能改变、 转变微 生物的细胞壁或使微生物的细胞壁变薄。可对微生物进行探测 ( 例如， 通过本文其他处所 描述的光谱学 ) 且可间接地测量细胞壁的改变并与已知的抗性和 / 或敏感性微生物的数据 库相比较来测定微生物的抗微生物剂抗性状况。可选地， 转变的或变薄的细胞壁对于一种 或多种荧光染料可能是可渗透的 ( 或更可渗透的 )， 因此， 可将一种或多种荧光染料添加到 样品中并探测样品以检测和 / 或测量荧光染料以间接地测定微生物的抗微生物剂抗性状 况 ( 参见， 例如， 实施例 5)。
样品照明光源或激发光源可选自本领域中的技术人员已知的任何数目的适宜的 光源。可使用产生可用数据的电磁波谱的任何部分。可使用能够发射紫外光谱、 可见光谱 和 / 或近红外线光谱以及电磁波谱的其他部分的光源， 这些为本领域技术人员所知。例如， 光源可以是连续光谱灯， 诸如用于产生紫外光的氘或氙弧灯和 / 或用于产生可见激发光 /近红外激发光的钨卤素灯。如本领域中所熟知， 这些光源提供了宽泛的发射范围且可利用 光学干扰滤器、 棱镜和 / 或光栅来减少用于特定激发波长的光谱带宽。
可选地， 多个窄带光源， 诸如发光二极管和 / 或激光， 可以空间多路传输以提供多 波长激发光源。例如， 发光二极管在 190nm 到超过 900nm 是可用的， 且该源具有 20-40nm 的 谱带宽度 ( 半高全宽 )。 激光在从紫外到近红外的离散波长中是可用的， 并且可以用于本领 域技术人员熟知的多路传输 (multiplexing) 方法。
任何光源的光谱选择性可以通过利用光谱区分装置来改善， 例如扫描单色器。也 可以使用其他的区分方法， 如本领域技术人员所熟知的， 例如声光可调滤波器、 液晶可调滤 波器、 光学干涉滤波器阵、 棱镜摄谱仪， 等等， 及其任何组合。选择光谱鉴别器要考虑的是 调节范围和选择性水平。举例说明， 例如， 鉴别器可以使用波长范围 300-800nm 和选择性 10nm。这些参数通常决定达到调节范围和选择性所必需的最优技术。
通常， 光源引起样品激发， 随后在预设时间点或连续测量从样品发射的荧光。 类似 的， 可以测量来自激发源与样品的相互作用的反射光， 以提供检测和 / 或表征的有关数据。
来自样品的发射可以通过任何合适的光谱区分装置测量， 且在某些实施方案中使 用分光计。分光计可以是检测特定的发射波长的扫描单色器， 其中扫描单色器的输出由光 电倍增管检测， 和 / 或分光计可以被配置成图像摄谱仪， 其中输出由图像检测器阵例如电 荷耦合器件 (CCD) 检测器阵检测。在一个实施方案中， 鉴别器允许通过光电检测装置 ( 例 如光电倍增管、 雪崩光电二极管、 CCD 检测器阵、 和 / 或电子倍增电荷耦合器件 (EMCCD) 检 测器阵 ) 观察荧光和 / 或散射信号。
使用分光镜技术来获得测量结果， 所述测量结果优选地提供为激发 - 发射矩阵 (EEM) 测量结果。如本文所用， EEM 被定义为荧光物质的发光光谱发射强度， 是激发波长和 发射波长两者的函数， 且 EEM 包括完整光谱或其子集， 其中子集可以含有单一或多个激发 / 发射对。另外， 具有固定激发波长的 EEM 的截面图可以用于显示特定激发波长的发射光谱， 而具有固定发射波长的 EEM 的截面图可以用于显示样品的激发光谱。在一个实施方案中， 多个 EEM 在多于一个的特定激发 - 发射波长对处被测量， 例如， 至少在 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多特定激发 - 发射波长对。
例如， 可在检测抗性测定亲和配体的波长处采集一个或多个 EEM， 并在检测微 生 物 的 内 在 性 质 的 波 长 处， 诸 如 瑞 利 散 射 点 (260-580nm)、 色 氨 酸 (285/350nm)、 胶原 (305/315-330nm)、 NADH(345/460nm) 和黄素 (460/520nm)， 采集一个或多个另外的 EEM。
根据本发明的一个实施方案， 已发现正面荧光光谱学提供了测量高度散射和高度 猝灭样品的荧光和 / 或反射性质的优点。正面方法是特别有用的光谱学方法， 因为该配 置较少受血液和微生物培养基的干扰组分的影响。如本领域中的技术人员已知的， 可以 以提供可接受的结果的角度来照射容器的光学表面， ( 例如， Eisinger， J.， 和 J.Flores， “Front-face fluorometry ofliquid samples， ( 液体样品的正面荧光测定术 )” Anal. Biochem.94 ： 15-21(1983))。 在一个实施方案中， 设计系统以使分光镜系统除在一个定角的 最小处测量发射的荧光之外， 在一个定角的最小处测量漫散射的光。
根据本发明， 对已知微生物 ( 抗生素敏感性和 / 或抗生素抗性 ) 进行对照测量， 因此允许利用本领域中的技术人员已知的多种数学方法将所测量的检验数据与感兴趣的 微生物的表征相关联。例如， 利用本领域中的技术人员已知的软件系统可将来自样品的数据与基线测量结果或对照测量结果相比较。更具体地， 通过多种多元分析方法可对数 据进行分析， 所述多元分析方法诸如， 例如， 一般化判别分析 (GDA)、 偏最小二乘法判别分 析 (PLSDA)、 偏最小二乘回归、 主成分分析 (PCA)、 平行因子分析 (PARAFAC)、 神经网络分析 (NNA) 和 / 或支持向量机 (SVM)。在一个实施方案中， 比较步骤包括将结合的抗性测定亲和 配体的量或结合亲和力与同样的微生物的抗生素敏感性菌株或抗生素抗性菌株相比较。 在 另一个实施方案中， 比较步骤包括将结合的抗性测定亲和配体的量或结合亲和力与同样的 微生物的抗生素敏感性菌株和抗生素抗性菌株二者相比较。在一个实施方案中， 对同样微 生物的已知抗生素敏感性菌株或抗生素抗性菌株的结合的量或结合亲和力与由微生物所 结合的量同时进行测定。在另一个实施方案中， 先前已测定了对于同样的微生物的已知的 抗生素敏感性或抗生素抗性菌株的结合的量或结合亲和力。 先前测定的数据可存在于诸如 数据库中。
除测量微生物的抗生素抗性和任选地测量微生物的一种或多种内在性质 ( 例 如， 内在荧光 ) 之外， 本发明的方法还可包括使用另外的鉴定剂来协助分离和 / 或表征 过程。与特定微生物结合的剂， 诸如亲和配体， 可用来分离微生物以鉴定微生物的类别 或种 ( 例如， 通过与独特的表面蛋白或受体结合 ) 和 / 或鉴定微生物的特性。有用的鉴 定剂或亲和配体包括， 但不限于， 单克隆和多克隆抗体和其片段 ( 例如， 用于金黄色葡萄 球菌的鉴定的抗 -Eap)、 核酸探针、 适体、 肽模拟物、 噬菌体来源的结合蛋白、 凝集素、 宿主 防 御 肽 ( 例 如， 防 御 素、 导 管 素 (cathelicidin)、 抗 菌 肽 (proteogrin)、 爪 蟾 抗 菌 肽 )、 细 菌 素 (bacterocin)( 例 如， 硫 醚 抗 生 素 (lantibiotic) 如， 乳 酸 链 球 菌 肽、 美杀菌素 (mersacidin)、 表皮素、 gallidermin 和植物乳杆菌素 C(plantaricin C)， 以及 II 类肽 )、 噬菌体以及核酸、 脂质、 碳水化合物、 多糖或蛋白的选择性染料， 或其任何组合。 如果剂本身 不发出可检测信号， 那么剂可以被标记以提供可检测信号， 例如通过将剂轭合到标志物上 ( 例如， 可见的或荧光的标志物 )。标志物包括但不限于， 荧光的、 发光的、 发磷光的、 放射性 的、 拉曼活性的、 质谱反应性的和 / 或比色的化合物。所述剂可以在本发明方法中的任何步 骤添加到微生物中， 例如， 当样品在接触步骤过程中、 在分离步骤过程中、 和 / 或在检测步 骤过程中被获得时。在一些实施方案中， 所述剂在沉淀物中的存在可以在探测沉淀物的过 程中测定。 其他有用的鉴定剂包括， 微生物酶的底物、 螯合剂、 光敏剂、 猝灭剂、 还原剂、 氧化 剂、 缓冲液、 酸、 碱、 溶剂、 固定剂、 去污剂、 表面活性剂、 消毒剂 ( 例如， 酒精、 漂白剂、 过氧化 氢 ) 和毒性化合物 ( 例如， 叠氮化钠、 氰化钾 ) 和代谢抑制剂例如环己酰胺、 等等。类似地， 许多用于测量微生物细胞活力、 新陈代谢和 / 或膜电位的荧光化合物， 可以用作本发明的 鉴定剂。如将被本领域中的技术人员之一所容易理解地， 特定微生物对任何影响其物理状 态或新陈代谢的化合物诸如抗生素的敏感性， 可通过向样品、 裂解缓冲液、 密度垫层或其任 何混合物中添加化合物而快速地确定。
在本发明的一方面， 方法还可包括回收微生物 / 抗性测定亲和配体复合物的沉淀 物并进行另外的检验的步骤。在一个实施方案中， 沉淀物可通过从样品介质和 / 或结合混 合物或组合物以及密度垫层中吸出而回收。在另一个实施方案中， 沉淀物可通过将注射器 插入到容器中且在样品培养基和 / 或结合混合物或组合物和密度垫层保持完整时吸出沉 淀物而回收。然后可将回收的沉淀物重悬于适宜的介质中， 例如， 盐水。重悬后， 可对微生 物进行期望的任何另外的检验， 如本领域中的技术人员所已知和如以上所描述。 尤其是， 需要清洁的微生物样品的任何检验可利用重悬的微生物来进行。在一些实施方案中， 可进行 另外的鉴定检验。鉴定检验的例子包括 Vitek2、 扩增和非扩增的核酸检验 (NAT)、 生色测定 和胶乳凝集测定、 免疫测定 ( 例如， 使用标记的抗体和 / 或其他配体的免疫测定 )、 质谱 ( 例 如， MALDI-TOF 质谱 ) 和 / 或其他光学技术诸如红外光谱学 (FTIR) 或拉曼光谱学。还可进 行另外的表征检验， 诸如药物抗性。另外的表征可以是在方法的初始分离步骤和表征步骤 过程中开始的检验的部分。
在本发明的一方面， 方法步骤中的一些或全部可以是自动化的。 如本文所用的， 术 语 “自动化” 意为计算机控制的。在一个实施方案中， 多个荧光发射检测和相关步骤是自动 化的， 且获自方法的结果信息被自动化地用来填充数据库。 在另外的实施方案中， 方法中的 其他步骤， 诸如接触、 分离和 / 或检测也可以是自动化的。使方法的步骤自动化不仅允许更 快速地检验更多的样品， 其还降低了在处理可能包含有害的和 / 或传染性微生物的样品中 的人为失误的风险。
在另一方面， 本发明涉及用于鉴定抗生素抗性微生物的系统， 包括 ：
(a) 容器， 所述容器包括微生物或含有微生物的样品以及抗性测定亲和配体 ；
(b) 密度垫层 ； 和
(c) 提供测量结果的分光计 ；
其中所述测量结果鉴定已通过在所述系统内进行原位分离而在所述容器中浓缩 的所述抗生素抗性微生物。在另一个实施方案中， 系统包括用于将微生物与未结合的抗性 测定亲和配体分离的离心机。
以下的实施例进一步详述了本发明， 所述实施例以示例的方式提供并且不意在以 任何方式限制本发明。使用了本领域中熟知的标准技术或以下具体描述的技术。 实施例 实施例 1.BOCILLINTM-FL 与 MRSA 菌株和 MSSA 菌株的结合
使用了两种实验方法来检验 BOCILLINTM-FL(Molecular Probes， Invitrogen) 与金 黄色葡萄球菌的结合 ： (1) 用氢氧化钠 (NaOH) 处理细胞， 中和， 添加 BOCILLINTM-FL， 然后分 TM 离细胞 ( 粗预处理 ) ； 和 (2) 用 BOCILLIN -FL 培养细胞， 然后分离细胞 ( 新陈代谢标记 )。
对于第一种方法， 在胰蛋白酶大豆肉汤 (TSB) 中培养金黄色葡萄球菌菌株 ATCC 25923( 甲氧西林敏感性 ； MSSA) 和 D14906( 甲氧西林抗性 ； MRSA) 直至指数生长 (6 小时 )。
将每个悬浮液的样品 (TSB 中的 0.9ml) 和 0.1N NaOH(0.1ml ； ±20μl 7.5 ％ X100-R) 涡旋 5 秒钟， 然后立即或在 1 分钟之后通过添加 1M KH2PO4(0.125ml) 并涡旋 5 秒钟 进行中和。 将 BOCILLINTM-FL(1.0mg/ml 的 15μl) 添加到悬浮液中， 然后使其涡旋， 并在室温 下孵育 5 分钟。通过将 0.2ml 的油共混物 (1.0 份的 DF 型显微镜浸油 +0.875 份的 Drakeol 5 矿物油 ) 上方的混合物在 10,000rpm 下离心 1 分钟以除去未结合的 BOCILLINTM-FL， 所述油 共混物是优化的以将微生物与培养基相分离。去除上清液和油层并将沉淀物重悬于 3.0ml PBS， pH 7.4 中。在 FluoroLog-3 系统中在 490nm 的激发波长处扫描样品， 并记录 510nm 处 的荧光发射。
结果显示于表 1 中。在 pH 12 下处理细胞 5 秒钟导致了与 MRSA 细胞相比更多的 BOCILLINTM-FL 与 MSSA 细胞结合 ( 条件 a ＝ 2.3 比值 )。将 Trition X-100 包括在反应混合物中没有获得益处。将细胞在 pH 12 下的处理增加至 60 秒钟没有提供益处， 并导致细胞 损失。
表1
条件 a ＝ pH 12 下 5″ b ＝ pH 12 下 60″ c ＝ pH 12+TX100 下 5″ d ＝ pH 12+TX100 下 60″
MSSA(25923) 3.7×106 1.0×106 0.9×106 0.8×106 MRSA(D14906) 1.6×106 0.9×106 0.6×106 0.4×106 MSSA/MRSA 比值 2.3 1.1 1.5 2.0对于第二种方法， 将两种细菌悬浮液 (13ml) 与 BOCILLINTM-FL(175μl 的 1.0mg/ ml 贮 存 液 ) 混 合。 将 混 合 物 以 1.0ml 样 品 等 份 分 到 含 0.2ml 油 共 混 物 的 微 量 离 心 管 (microfuge tube) 中。将管在 37℃下孵育不同的时间点 ( 对于 T0 时间点将 1 组管保持在 冰上 )。在 30 分钟时移出一组管并通过用 PBS 洗涤两次而将细胞与游离的 BOCILLINTM-FL分离。在 30、 52、 68 和 86 分钟时移出一组管并通过穿过油共混物的离心而将细胞与游离的 BOCILLINTM-FL 分离。回收细胞并重悬于 3ml PBS 中。在 FluoroLog-3 系统中在 490nm 的 激发波长处扫描样品， 并记录 510nm 处的荧光发射。
结果显示于表 2( 原始数据 ) 和图 1( 标准化的数据 ) 中。当通过将 BOCILLINTM-FL 信号标准化为微生物色氨酸信号 ( 图 1) 而在每个细胞基础上进行评估时， MRSA 菌株结合 TM 的 BOCILLIN -FL 比 MSSA 菌株少 2-7 倍 ( 表 2)， 或少 3-4 倍。MRSA 和 MSSA 菌株之间最大 的差异发生在 37℃下培养约 60 分钟之后。虽然利用基于油的分离方法观察到了更高的背 细菌穿过油共混物的离心比用 PBS 洗涤两次得到更高水平的 BOCILLINTM-FL 景信号 (T0 处 )， 结合。
表2
实施例 2. 时程实验
在 37 ℃ 下 在 BacT/ALERT SA 培 养 基 中 培 养 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 株 ATCC 25923(MSSA) 和 D14906(MRSA) 的样品直至达到指数生长 (8-10 小时 )。测量每个培养物
的 OD 660nm， 并用预热的 SA 培养基将两个悬浮液调节至 0.50。在预热的 SA 培养基中稀释 TM BOCILLIN -FL， 通过 0.2μm 滤器过滤并保持在 37 ℃下。将细菌的样品 (9.0ml) 与 1.0ml 的 100μMBOCILLINTM-FL 混合， 充分混合， 并作为 10 个 1.0ml 等份分配到含有如实施例 1 中 所用的含 0.2ml 相同的油共混物的微量离心管中。除 T0 管外将所有的管置于 37℃下。在 6、 11、 16、 22、 45、 60、 75 和 91 分钟将管移出并进行处理。将每个管离心 1 分钟， 吸出上清 液， 并将沉淀物重悬于 0.1ml PBS 中且然后添加到丙烯酸酯比色杯中的 3.0ml PBS 中。在 FluoroLog-3 系统中在 490nm 的激发波长处扫描样品， 并记录 510nm 处的荧光发射。 TM
如通过油方法所评价的， BOCILLIN -FL 与金黄色葡萄球菌菌株快速发生结合 ( 图 2)。利用二次多项式曲线拟合绘制数据。在室温下在仅 5 分钟之后测量了最大结合 ( 即， T0 管 )。在 BOCILLINTM-FL 的该浓度下， 不论培养时间如何， 在每个细胞基础上， MSSA 菌株结 TM 合的 BOCILLIN -FL 较之 MRSA 菌株多近似 2-3 倍。
实施例 3.BOCILLINTM-FL 的滴定
在 37 ℃ 下 在 BacT/ALERT SA 培 养 基 中 培 养 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 株 ATCC 25923(MSSA) 和 D14906(MRSA) 约 6 小时直至 OD 660nm 达到约 0.35。在 SA 培养基中制备 BOCILLINTM-FL(0.1ml) 的稀释物并将其放置在培养管中。将细菌悬浮液的样品 (0.9ml) 添 加到该管中并混合。将管盖上并放置在 37℃培养箱中持续 60 分钟。将样品 (1.0ml) 转移 到实施例 1 中所用的含有 0.2ml 相同的油共混物的微量离心管中， 离心 1 分钟， 吸出上清 液， 并将沉淀物重悬于 0.1ml PBS 中， 且然后添加至丙烯酸酯比色杯中的 3.0ml PBS， pH7.4 中。在 FluoroLog-3 系统中在 490nm 的激发波长处扫描样品， 并记录 510nm 处的荧光发射。 TM
根据 BOCILLIN -FL 浓度不同， 在每个细胞基础上， MSSA 菌株结合的 BOCILLINTM-FL 比 MRSA 菌株多 2-4 倍 ( 图 3)。利用二次多项式曲线拟合绘制数据。MSSA 结合曲线是二 相性的。初始可饱和曲线存在于从 0.5μM 至约 10μM， 随后为具有增高的结合的第二相。 TM 在约 5μMBOCILLIN -FL 处， 在 MSSA 菌株和 MRSA 菌株之间存在 3 倍差异。在约 0.5μM TM BOCILLIN -FL 处， 在 MSSA 菌株和 MRSA 菌株之间存在 4 倍差异。
实施例 4. 一套组 MRSA 菌株和 MSSA 菌株的评价
使 20 个不同的金黄色葡萄球菌菌株 (10 个 MRSA 菌株和 10 个 MSSA 菌株， 用头孢西 丁纸片和 Vitek-2 验证 ) 进行增殖。从 24 小时平板上移出菌环量的生长物 (1μL) 并悬浮 于 BacT/ALERT SA 培养基中 ( 玻璃螺旋帽管中的 8ml)。充分涡旋管并在 36℃下孵育 6 小 时。测量每个悬浮液在 660nm 处的 OD， 并调节至大约同样密度 (0.50-0.75OD ； 样品 #12166 TM 仅为 0.28)。将 50μM BOCILLIN -FL(0.1ml) 置于 20 个标记的微量离心管的每一个中。将 每个菌株的样品 (0.9ml) 添加到每个管中、 混合并在 37℃下孵育 30 分钟。 然后将反应混合 物移出并添加到含 0.2ml 油共混物 (1.000 份 DF 型浸油加 0.875 份 Drakeol 5 矿物油 ) 的 第二组管中。在 10,000rpm 下在 A-8-11 转子 (Eppendorf 5417R) 中将管离心 2 分钟。利 用真空装置将上清液和大部分的油吸出。利用 Gilson P200 吸头将剩余的油除去并将沉淀 物重悬于 100μl PBS 中。将细胞转移到含 3ml PBS 的丙烯酸酯比色杯中并利用表 3 中列 出的 FluoroScan“Bocillin” 点在 FluoroLog 3 系统中读数。此外， 对于 20 个分离株 ( 来 自同样的 24 小时平板 ) 中的每一个运行 Vitek AST 卡片。
表3
23CN 102460172 A 瑞利散射点 色氨酸峰 MRSA/MRSE 胶原 NADH 黄素说明书260-580 285/350 305/315-330 320/405 345/460 460/520 490/51020/23 页BOCILLINTM-FL
当 BOCILLINTM-FL 信号 (Ex490_Em510) 被标准化为色氨酸信号 (Ex285_Em350) 时 获得了最优结果。5 个苯甲基青霉素敏感性菌株结合的 BOCILLINTM-FL 的量超过 15 个苯甲 基青霉素抗性菌株结合的 BOCILLINTM-FL 的量的两倍 ( 图 4)。该结果证明测定是特异性的 且与观察的 Vitek MIC 相关联。10 个苯唑西林敏感性 (MSSA) 菌株中的 5 个结合较高水平 的 BOCILLINTM-FL， 50％的 MRSA 敏感性和 100％的特异性。通过 Vitek 卡片将这 5 个菌株分类为苯甲基青霉素抗性和苯唑西林敏感性， 且 3/5 的菌株具有 0.5 的苯唑西林 MIC。
上述是对本发明的说明， 而不应解释为对本发明的限制。本发明由下面的权利要 求定义， 且权利要求的等同形式也包括在权利要求内。本文所引用的所有出版物、 专利申 请、 专利、 专利公布和任何其他参考文献以其整体通过引用并入以用于与出现参考文献的 句子和 / 或段落有关的教导。
实施例 5. 通过内在荧光和 / 或膜完整性的改变来间接地测定微生物的抗性状况
选择屎肠球菌 (E.faecium) 的 4 个菌株用于本研究。 两个是 VRE(#12406， #13185)， 具有通过 VITEK 2 测定的＞ 32μg/mL 的万古霉素 MIC， 和两个是 VSE(#14054， #12480)， 具 有通过 VITEK 2 测定的＞ 0.5μg/mL 的万古霉素 MIC。
对 于 每 个 检 验 菌 株， 将 来 自 24-48 小 时 平 板 的 1μl 的 菌 环 量 的 菌 落 悬 浮 于 10-12mL 的 BacT/ALERT SA 培养基中并在 37℃下培养 4-9 小时。然后将每个对数期培养物 的样品与 0μg/mL、 0.25μg/mL、 2.5μg/mL 和 12.5μg/mL 的万古霉素 -HCl 连同 1 ∶ 5000 稀释的贮存液 Sytox Green( 一种活细胞不可渗透型 DNA 染料 )(Molecular Probes， 目录 #S7020) 一起在 37℃下孵育 4 小时的时段。将培养物的等份移出以用于立即 (T0) 分析和 1、 2.5 和 4 小时之后的分析。
在适当的时间点， 将培养物的 0.5mL 等份 (0.5mL) 覆盖在含于定制的光学离心管 中的由含 24 ％ w/v CsCl 的 10mM Hepes， pH7.4 和 0.005 ％的 Pluronic F-108 组成的密 度垫层上， 如于 2009 年 10 月 30 日提交的标题为 “Separation Device for Use in the Separation， Characterization and/orIdentification of Microorganisms( 用于微生物 的分离、 表征和 / 或鉴定的分离装置 )” 的相关美国专利申请系列第 12/589,969 号中所公 开。将管密封并在 10,000rpm 下离心 2 分钟以从培养基和未结合的化学物质中分离完整 的微生物。然后将管放入定制的管支持器， 直接放置在构造成基底的光线探头上。探头与 FluoroLog 3 分光荧光计相连接。 穿过管的紫外光可透过的基底对管进行探测， 并收集荧光和漫反射读数。
表 4 中给出了微生物 NADH 荧光 (Ex340nm/Em440nm) 的结果。在对于两个 VSE 菌 株为抑制性的万古霉素水平 (2.5μg/mL 和 12.5μg/mL)， 细胞 NADH 水平随时间推移逐渐下 降。相比之下， 培养物中用同样的万古霉素水平处理的两个 VRE 菌株中的 NADH 水平在培养 近 1 小时后上升并在 4 小时培养时间持续上升。一个 VRE 菌株 (#12406) 具有较长延迟的 NADH 产生， 其与此期间的 Sytox Green 的通量有关。
表 5 中给出了微生物色氨酸荧光 (Ex300nm/Em360nm) 的结果。在对于两个 VSE 菌 株为抑制性的万古霉素水平 (2.5μg/mL 和 12.5μg/mL)， 细胞色氨酸水平随时间推移保持 稳定。相比之下， 用同样的万古霉素水平处理的两个 VRE 菌株中的色氨酸水平随 4 小时培 养时间推移缓慢地升高。
表 6 中 给 出 了 关 于 Sytox Green(Ex510nm/Em530nm) 的 结 果， 并 表 示 为 Sytox Green 与 NADH 荧光的比值以补偿活细胞生物质。 数据证明两个 VRE 菌株中的一个 (#14206) 在培养的前 2 个小时受万古霉素影响， 且然后开始恢复。该发现表明该菌株需要与万古霉 素共培养几小时， 以便抗性表型在该特定群体中占主要地位。该表现似乎表明该菌株具有 通过本方法所检测的可诱导的抗性。
本实验证明了测量与抗生素共培养的微生物细胞的内在荧光的改变可用来快速 地测定生物体是否对抗生素是抗性的。而且， 在检验中添加荧光染料以在微生物群体中监 测细胞膜的完整性提供了关于生存力和微生物群体的抗性诱导的宝贵信息。
表4： 万古霉素敏感性菌株和抗性菌株中微生物 NADH 的随时间变化
表5： 万古霉素敏感性菌株和抗性菌株中微生物色氨酸的随时间变化
表6： 进入万古霉素敏感性菌株和抗性菌株中的 Sytox Green 流入量的随时间变化