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1、(10)申请公布号 CN 102507580 A (43)申请公布日 2012.06.20 CN 102507580 A *CN102507580A* (21)申请号 201110318629.7 (22)申请日 2011.10.19 G01N 21/84(2006.01) (71)申请人 南昌大学 地址 330031 江西省南昌市红谷滩新区学府 大道 999 号 (72)发明人 陈勇 邵文祥 黄洁 曾芳发 (74)专利代理机构 南昌新天下专利商标代理有 限公司 36115 代理人 施秀瑾 (54) 发明名称 一种基于理想化细胞半径定量测量细胞铺展 速率的方法 (57) 摘要 一种基于理想化细。
2、胞半径定量测量细胞铺 展速率的方法， 其特征是将处于悬浮状态的贴 壁细胞种植在培养孔或板上， 在细胞贴壁和铺 展过程中， 使用成像设备， 捕获细胞在不同时 间点的形貌图， 测量出每个细胞的贴壁面积， 将铺展前后细胞的形态理想化为圆形， 并按 计算出细胞 铺展速率 （单位时间内细胞半径的增长速率） 。本 发明以理想化的细胞半径为标准， 根据细胞铺展 所用时间和细胞半径的变化而计算出来的铺展速 率， 解决了传统方法的缺点， 比传统的细胞铺展测 量方法要更加精确， 且需测量设备简单， 计算方法 同样简单、 可行， 也易于整合到测量设备中去。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页。
3、 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 2 页 1/1 页 2 1. 一种基于理想化细胞半径定量测量细胞铺展速率的方法， 其特征是将处于悬浮状态 的贴壁细胞种植在培养孔或板上， 在细胞贴壁和铺展过程中， 使用成像设备， 捕获大量细胞 在不同时间点的形貌图， 测量出每个细胞的贴壁面积， 并按下式计算出细胞铺展速率 ： 其中， Rs 表示细胞的铺展速率 ； Tn+1表示细胞贴壁后铺展的 n+1 时刻， Tn表示细胞贴壁 后铺展的n时刻 ； An+1表示细胞铺展过程中的n+1时刻单个细胞的贴壁面积或所有细胞的贴 壁面积的平均值， An表示细胞铺展过程。
4、中的 n 时刻单个细胞的贴壁面积或所有细胞的贴壁 面积的平均值。 权 利 要 求 书 CN 102507580 A 2 1/2 页 3 一种基于理想化细胞半径定量测量细胞铺展速率的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 是用于测量贴壁细胞的铺展速率以及各种药物对细胞 铺展速率的影响的方法。 技术背景 0002 细胞铺展是贴壁细胞的重要生理活动或功能之一， 许多人体生理活动或疾病与细 胞的铺展有关。例如， 血管内皮细胞通过细胞的铺展来构建血管内壁或者修补破损的血管 内皮层， 因此， 内皮细胞铺展的改变往往与心血管疾病的产生、 发展和肿瘤转移等有关， 而 药物对细胞铺展的影响也必然是评。
5、估药物疗效的体外细胞试验中的重要指标之一。 0003 遗憾的是， 目前对细胞铺展机制， 特别是药物对细胞铺展的影响的研究， 还不是很 清楚， 其中细胞铺展速率的精确、 定量测量方法的缺乏就是主要原因之一。 0004 目前， 文献报道的定量测量细胞铺展的方法只有一个 ： 将细胞铺展的状态 （只是根 据细胞的形态） 划分为不铺展、 半铺展和完全铺展三种， 再计算出处于这三种状态的细胞的 数量或数量百分比。 然而， 这种定量测定细胞铺展的方法非常粗糙 ： 首先， 确定不铺展、 半铺 展和完全铺展三种状态具有非常大的主观性， 没有一个可定量的标准， 毕竟每种细胞甚至 每个单独的细胞， 它们完全铺展时的。
6、形态或贴壁面积都可能不一样， 要判断一个细胞是否 完全铺展是很困难的， 即由此会产生一定的偏差。 其次， 半铺展状态其实包含了很多个中间 阶段的状态， 因而， 只将细胞铺展划分为三种状态无法定量比较细胞铺展随着时间的变化。 此外， 通过计算细胞数量或数量百分比来定量细胞铺展是间接的方法， 而没有定量测量铺 展速率来得直接。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种基于理想化细胞半径定量测量细胞铺展速率的方法， 以 取代已有的传统定量测量方法。 0006 本发明是通过以下技术方案实现的。 0007 将处于悬浮状态的贴壁细胞种植在培养孔或板上， 在细胞贴壁和铺展过程中， 使 用成像设备， 捕获大。
7、量细胞在不同时间点 （Tn） 的形貌图， 测量出每个细胞的贴壁面积 （A） ， 将铺展前后细胞的形态理想化为圆形， 并计算出所有细胞在单位时间内的半径变化速率， 此即被定义为细胞铺展速率。细胞铺展速率计算公式如下 ： 其中， Rs 表示细胞的铺展速率 ； Tn+1表示细胞贴壁后铺展的 n+1 时刻 （测量设定中 n 时 刻之后的一个时刻） ， Tn表示细胞贴壁后铺展的 n 时刻 ； An+1表示细胞铺展过程中的 n+1 时 刻单个细胞的贴壁面积 （或所有细胞的贴壁面积的平均值） ， An表示细胞铺展过程中的 n 时 刻单个细胞的贴壁面积 （或所有细胞的贴壁面积的平均值） 。 0008 本发明所。
8、述的成像设备， 可以是能够分辨单个细胞形态且具有图像记录功能的显 说 明 书 CN 102507580 A 3 2/2 页 4 微镜， 包括普通光学显微镜或激光共聚焦显微镜和原子力显微镜等。 0009 本发明的主要特点是 ： 不划分不铺展、 半铺展和完全铺展三种细胞铺展状态， 而是 以细胞的理想化半径为标准， 半径越大说明细胞铺展的程度越大 ； 根据细胞铺展所用时间 和半径的变化而计算出来的铺展速率， 可说明不同时间内细胞铺展变化的快慢。 因而， 本发 明解决了上面所述的传统方法的缺点， 可取而代之。 0010 此外， 本发明比传统的细胞铺展测量方法要更加精确， 传统方法只能测量细胞铺 展的状。
9、态， 而无法定量测量细胞铺展的速率， 更无法比较不同时间段的细胞铺展速率。 本发 明所需测量设备也很简单， 是生物学研究中常用的设备 ； 计算方法同样简单、 可行， 如将来 设计出一套算法或软件， 也易于整合到测量设备中去。 具体实施方案 0011 本发明将通过以下实施例作进一步说明。 0012 本发明所述的实施例所使用的成像设备为德国产的 Carl Zeiss 710 激光共聚焦 显微镜， 其中细胞贴壁面积的测量， 是使用该显微镜的面积测量功能 （该显微镜自带的 LSM 710 Release Version 5.5 sp2 软件） 。 0013 实施例 1 ： 细胞铺展的定量测量。 001。
10、4 将悬浮的人脐静脉内皮细胞种植在含有培养液的 24 孔板上， 放置于 CO2培养箱 （370C， 5% CO2） 中培养。分别在培养 6 小时、 24 小时和 48 小时后用共聚焦显微镜观察并获 取细胞形貌图像， 并测量出图像中所有单个细胞的贴壁面积及所有细胞的平均贴壁面积， 通过上面提供的公式计算出不同时间段细胞的平均铺展速率。最后计算得出 ： 细胞铺展过 程中的6小时、 24小时和48小时时的平均平均理想化半径分别是12.95、 18.19和19.01微 米 ； 在 0-6 小时、 6-24 小时和 24-48 小时的时间内， 细胞的平均铺展速率 （单位时间内的半 径变化） 分别是 2.。
11、16、 0.29 和 0.03 微米 / 小时。数据显示， 细胞在 0-6 小时内铺展最快， 并 随时间延长铺展速度逐渐下降， 但 48 小时后细胞依然在铺展， 虽然铺展速率已经很低。 0015 实施例 2 ： 药物对细胞铺展的影响的定量测量。 0016 将悬浮的人脐静脉内皮细胞种植在含有培养液的 24 孔板上， 放置于 CO2培养箱 （370C， 5% CO2） 中培养。 培养24小时后用共聚焦显微镜获取细胞形貌图像， 随后往细胞溶液 中加入 20 ug/ml Ox-LDL （氧化性低密度脂蛋白） ， 再继续培养 48 小时， 并分别在 6 小时、 12 小时、 24 小时和 48 小时使用。
12、共聚焦显微镜获取细胞的形貌图像。并测量出图像中所有单 个细胞的贴壁面积及所有细胞的平均贴壁面积， 通过上面提供的公式计算出不同时间段细 胞的理想化半径和平均铺展速率。 最后计算出药物对细胞铺展的影响情况 ： 加入药物前， 细 胞的理想化半径约为 20.04 微米， 加入药物后 6 小时、 12 小时、 24 小时和 48 小时时细胞的 理想化半径分别为 19.87、 21.20、 21.35 和 21.70 微米 ； 加入药物后在 0-6 小时、 6-12 小时、 12-24 小时和 24-48 小时的时间内， 细胞的平均铺展速率分别是 -O.O3、 0.22、 0.01 和 0.02 微米/小时。 数据显示， 加入药物后0-6小时内细胞回缩 （铺展受抑制， 铺展速率为负值） ， 在 6-12 小时内回缩的细胞才又开始迅速铺展开来 （铺展速率为 0.22） ， 12-24 小时内和 24-48 小时内细胞的铺展都非常缓慢 （铺展速率分别只有 0.01 和 0.02） 。 说 明 书 CN 102507580 A 4 。