一种基于表面等离子共振技术的食品中农兽药残留检测方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102628803 A (43)申请公布日 2012.08.08 CN 102628803 A *CN102628803A* (21)申请号 201210110733.1 (22)申请日 2012.04.17 G01N 21/55(2006.01) (71)申请人 王利兵 地址 300042 天津市河西区浦口道 6 号理化 楼 305 室 (72)发明人 王利兵 黄仁亮 于艳军 (54) 发明名称 一种基于表面等离子共振技术的食品中农兽 药残留检测方法 (57) 摘要 一种基于表面等离子共振技术的食品中农兽 药残留检测方法， 属于食品安全危害因子检测技 术领域。本发明。

2、包括传感表面适配体固定、 样品 标记、 样品检测、 传感元件再生四个步骤， 利用同 一传感芯片对不同农兽药残留组分的含量进行检 测 ； 其特征在于以溶菌酶作为标记分子探针， 将 传感芯片表面连接溶菌酶适配体 ； 对食品样品进 行一系列预处理， 加入农兽药残留组分的溶菌酶 标记物， 混合后竞争结合金属纳米粒子修饰的农 兽药残留组分相应的适配体 ； 利用表面等离子体 共振检测仪检测溶菌酶的含量， 间接检测农兽药 残留 ； 并对传感芯片进行再生， 用于检测其它农 兽药残留。本发明为农兽药残留检测提供了一种 稳定性高、 可重复性强、 灵敏度高的通用检测方 法， 实现了同一表面等离子体共振传感芯片对各 。

3、种农兽药残留的检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/2 页 2 1. 一种应用表面等离子体共振仪的食品中农兽药残留检测方法， 利用同一传感芯片对 不同农兽药残留组分的含量进行检测 ； 其特征在于包括以下步骤 ： （一）传感芯片表面适配体固定 ： 选择链霉亲和素 SA 修饰的传感芯片， 通过通入 5-50L 浓度为 1-50g/L 已标记生物素的溶菌酶适配体， 在表面等离子体传感芯片上固 定上溶菌酶适配体 ； （二） 对待测农兽药残留组分进。

4、行溶菌酶标记， 标记方法根据待测物基团不同， 所述标 记方法包括 EDC/NHS 法或戊二醛法 ； （三） 标准溶液配制 ： 用 0.01-0.1mol/L（pH 7.4） 的磷酸盐缓冲液配置农兽药残留组 分的标准样品储备液， 储备液浓度为 0.1ng/mL 至 1mg/mL， 用磷酸盐缓冲液将储备液配制成 不同浓度的标准溶液， 取不同浓度未标记待测残留组分的标准溶液和溶菌酶标记的待测残 留组分充分混合后， 竞争结合农兽药残留组分相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体， 其 中溶菌酶标记的农兽药残留组分应不少于加入的适配体量 ； （四） 建立标准曲线 ： 采用表面等离子共振谱仪测量， 以0.02m。

5、ol/L的磷酸盐缓冲液为测 量基准， 通过微泵通入 5-100L 待测混合样品， 记录下表面等离子体共振仪光谱图， 通过 检测溶菌酶的含量， 间接检测农兽药残留组分 ； 取不同浓度待测样品的表面等离子体共振 谱图稳定值， 绘制工作曲线， 并进行多项式曲线拟合， 获得回归标准曲线 ； （五） 定量检测 ： 对于未知含量的农兽药残留组分样品进行检测， 同样按照步骤 （三） 进 行 ； 采用表面等离子体共振检测仪记录农兽药残留的光谱图 ； 将光谱图中残留组分的稳定 值代入相应的回归曲线方程， 计算出食品中农兽药残留组分的浓度值 ； （六） 通入 0.01-0.05mol/L（pH 为 2-3） 的甘。

6、氨酸 - 盐酸缓冲溶液， 冲洗传感芯片表面， 进行传感元件再生， 用于其它农兽药残留检测。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述标记方法包括选择 EDC/NHS 法交联羧 基与氨基或戊二醛法交联两个氨基。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于采用核酸适配体为识别分子， 核酸适配体 序列与待测物直接相关。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述步骤 （一） 传感器表面适配体固定， 包 括如下步骤 ： （1） 将链霉亲和素 SA 修饰的传感芯片插入表面等离子体共振检测仪中， 在工作通道中 进行在线传感表面修饰 ； （2） 通入 0.02mol/L（pH 7。

7、.4） 的磷酸盐缓冲液 ； （3） 通入5-50L浓度为1-50g/L生物素修饰的溶菌酶适配体溶液， 进行在线偶联至 基线稳定 ； （4） 重复步骤 （2） 至 （3） ， 获得溶菌酶适配体修饰的传感芯片。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于采用溶菌酶标记待测物， 与未标记样品一 起与核酸适配体发生特异性竞争识别。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述步骤 （三） 中纳米粒子可以是金属纳米 粒子或磁性纳米粒子或高分子化合物。 7. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述步骤 （四） 和 （五） 中通过检测溶菌酶的 含量， 间接检测农兽药残留组分的浓度值， 。

8、提高表面等离子体传感芯片的可重复利用性， 适 权 利 要 求 书 CN 102628803 A 2 2/2 页 3 用于各种农兽药残留组分的检测。 权 利 要 求 书 CN 102628803 A 3 1/4 页 4 一种基于表面等离子共振技术的食品中农兽药残留检测方 法 技术领域 0001 本发明涉及一种食品中农兽药残留检测技术。特别是基于表面等离子体共振技 术， 通过核酸适配体与未标记、 标记样品进行特异性竞争识别， 采用溶菌酶适配体修饰的传 感元件间接检测食品中农兽药残留的方法。 背景技术 0002 近年来， 食品安全问题成为攸关民生的焦点问题， 而农兽药残留是制约食品安全 的首要因素。。

9、传统三大类农药之一的有机磷农药， 用量大， 使用广， 残留问题备受关注。啶 虫脒因其作为一种光谱杀虫剂， 不可避免地存在于果蔬中。孔雀石绿中的化学官能团三苯 甲烷可致癌， 很多国家已禁用， 但仍有渔民在防治鱼类感染真菌时使用， 也有运输商用作消 毒。世界各地动物性饲料中所使用的抗生素添加剂竟达 20 余种， 如卡那霉素、 四环素类等 兽药残留。 然而， 长期使用农兽药会造成添加剂在植物和动物体内的蓄积， 人们食用有农兽 药残留的食品后， 会对人体健康造成很大的危害。 因此， 建立可靠、 快速、 灵敏的检测方法是 监控农兽药残留的重要手段之一。 0003 经典的检测方法一般依靠液相色谱、 气相色。

10、谱、 气液质联用法， 但这些检测仪器价 格昂贵， 检测成本高， 不能进行在线检测。目前， 免疫分析技术是农兽药残留快速检测中应 用最普遍的技术。 然而， 现有免疫检测技术在灵敏度、 通用性等方面还无法满足实际检测需 求 ； 免疫标记物也存在不稳定、 容易失活等缺点， 限制了相关免疫分析技术的进一步发展。 0004 表面等离子体共振技术具有高灵敏度、 响应快、 体积小、 无须标记、 可保持分子的 生物活性等优点， 成为近十年来发展最快速的检测技术之一， 被广泛采用。 相对酶联免疫吸 附法、 生物传感器检测法以及荧光分析法， 仍然存在传感芯片检测专一问题， 检测成本非常 高。例如， 采用表面等离子。

11、体共振原理检测的仪器 BIACore， 其常用传感器芯片 CM5 成本为 2000 多元人民币。 发明内容 0005 为了解决现有表面等离子体技术在检测农兽药残留时存在芯片专一性、 抗体稳定 性差、 耗材量大、 造假昂贵等问题， 同时极大提高农兽药残留的检测限， 本发明提供了一种 采用表面等离子体共振传感器检测食品中各种农兽药残留的方法。该方法具有通用、 高稳 定性、 高灵敏度、 操作简单等优点。 0006 本发明的技术方案为 ： 一种应用表面等离子体共振仪的食品中农兽药残留检测 方法， 利用同一传感芯片对不同农兽药残留组分的含量进行检测 ； 其特征在于包括以下步 骤 ： （一）传感芯片表面适。

12、配体固定 ： 选择链霉亲和素 SA 修饰的传感芯片， 通过通入 5-50L 浓度为 1-50g/L 已标记生物素的溶菌酶适配体， 在表面等离子体传感芯片上固 定上溶菌酶适配体 ； 说 明 书 CN 102628803 A 4 2/4 页 5 （二） 对待测农兽药残留组分进行溶菌酶标记， 标记方法根据待测物基团不同， 所述标 记方法包括 EDC/NHS 法或戊二醛法 ； （三） 标准溶液配制 ： 用 0.01-0.1mol/L（pH 7.4） 的磷酸盐缓冲液配置农兽药残留组 分的标准样品储备液， 储备液浓度为 0.1ng/mL 至 1mg/mL， 用磷酸盐缓冲液将储备液配制成 不同浓度的标准溶液。

13、， 取不同浓度未标记待测残留组分的标准溶液和溶菌酶标记的待测残 留组分充分混合后， 竞争结合农兽药残留组分相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体， 其 中溶菌酶标记的农兽药残留组分应不少于加入的适配体量 ； （四） 建立标准曲线 ： 采用表面等离子共振谱仪测量， 以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测 量基准， 通过微泵通入 5-100L 待测混合样品， 记录下表面等离子体共振仪光谱图， 通过 检测溶菌酶的含量， 间接检测农兽药残留组分 ； 取不同浓度待测样品的表面等离子体共振 谱图稳定值， 绘制工作曲线， 并进行多项式曲线拟合， 获得回归标准曲线 ； （五） 定量检测 ： 对于未知含量的农兽药残。

14、留组分样品进行检测， 同样按照步骤 （三） 进 行 ； 采用表面等离子体共振检测仪记录农兽药残留的光谱图 ； 将光谱图中残留组分的稳定 值代入相应的回归曲线方程， 计算出食品中农兽药残留组分的浓度值 ； （六） 通入 0.01-0.05mol/L（pH 为 2-3） 的甘氨酸 - 盐酸缓冲溶液， 冲洗传感芯片表面， 进行传感元件再生， 用于其它农兽药残留检测。 0007 所述标记方法包括 EDC/NHS 法交联羧基与氨基或戊二醛法交联两个氨基。 0008 可以采用核酸适配体为识别分子， 核酸适配体序列与待测物直接相关。 0009 所述步骤 （一） 传感器表面适配体固定， 包括如下步骤 ： （1。

15、） 将链霉亲和素 SA 修饰的传感芯片插入表面等离子体共振检测仪中， 在工作通道中 进行在线传感表面修饰 ； （2） 通入 0.02mol/L（pH 7.4） 的磷酸盐缓冲液 ； （3） 通入5-50L浓度为1-50g/L生物素修饰的溶菌酶适配体溶液， 进行在线偶联至 基线稳定 ； （4） 重复步骤 （2） 至 （3） ， 获得溶菌酶适配体修饰的传感芯片。 0010 可以采用溶菌酶标记待测物， 与未标记样品一起与核酸适配体发生特异性竞争识 别。 0011 所述步骤 （三） 中纳米粒子可以是金属纳米粒子或磁性纳米粒子或高分子化合物。 0012 所述步骤 （四） 和 （五） 中通过检测溶菌酶的含量。

16、， 间接检测农兽药残留组分的浓度 值， 提高表面等离子体传感芯片的可重复利用性， 适用于各种农兽药残留组分的检测。 0013 本发明的有益效果 ： （1） 本发明解决食品中农兽药残留检测芯片的专一性差问题， 引入溶菌酶作为标记分 子探针， 采用生物素标记的适配体对表面等离子体共振传感芯片进行修饰， 将农兽药残留 的测量转换为对溶菌酶的测量， 实现传感芯片的通用性， 对不同农兽药残留进行检测。 具体 检测原理见附图 1 ； （2） 本发明解决芯片稳定性差问题， 采用适配体作为芯片表面通用配体， 再生容易。相 对抗体可重复使用性强， 极大地延长了芯片的使用寿命， 降低检测成本 ； （3） 本发明解。

17、决试剂消耗量大问题， 采用待测样品中农兽药残留与溶菌酶标记的农兽 药残留充分混合后， 加入适量的农兽药残留适配体， 即可进行竞争结合。 相对于以往的竞争 说 明 书 CN 102628803 A 5 3/4 页 6 抑制结合思想， 无须加入过量的适配体， 既实现了响应信号放大， 也节省了试剂消耗 ； （3） 本发明提高了检测灵敏度， 操作中可选用纳米粒子修饰的农兽药残留适配体， 基于 表面等离子体共振检测时， 信号显著增加。 附图说明 0014 图 1 是本发明所述的生物毒素检测原理图 ；其中 为农兽药残留物， 为溶菌酶标记的农兽药残留物， 为农兽药残留物的适配体， 为溶 菌酶的适配体，为纳米。

18、粒子。 具体实施方式 0015 下面结合具体实施例对本发明作以详细描述。 0016 实施例 ： 选择两种典型兽药残留卡那霉素和农药残留有机磷类似物 PAPMP 检测对 象， 具体操作步骤如下 ： （1） 传感器表面适配体固定 ： 选择链霉亲和素 SA 修饰的传感芯片， 通过通入 20L 浓 度为 30g/L 已标记生物素的溶菌酶适配体， 在表面等离子体传感芯片上固定上溶菌酶适 配体 ； （2） 分子探针标记物偶联 ： 将待测物通过戊二醛法与溶菌酶进行偶联标记， 标记方法根 据待测物基团不同选择， 包括 EDC/NHS 法、 戊二醛法等， 如卡那霉素， 可采用戊二醛法与溶 菌酶连接， 待用 ； 。

19、或直接购买卡那霉素 - 溶菌酶偶联物待用 ； （3） 标准溶液配制 ： 称取卡那霉素标准品 10 mg， 溶解于 0.02mol/L（pH 7.4） 磷酸盐 缓冲液定容至 10 mL， 即为 1 mg/mL 的标准贮备液 ； 用磷酸盐缓冲液将储备液配制成不同浓 度的标准溶液， 浓度在 pg/mLng/mL 级， 依次为 0 ng/mL， 50 ng/mL， 100 ng/mL， 200 ng/mL， 400 ng/mL， 600ng/mL ； （4） 标准曲线绘制 ： 将上述浓度为 0 ng/mL 未标记的标准溶液与适量的溶菌酶标记卡 那霉素溶液充分混合 ； 再加入农兽药残留组分相应的适配体或。

20、纳米粒子修饰的适配体， 其 中溶菌酶标记的农兽药残留组分应不少于加入的适配体量 ； 采用表面等离子共振谱仪测 量， 通入 0.02mol/L（pH 7.4） 磷酸盐缓冲液作为测量基准， 然后泵入待测混合样品， 待表 面等离子体共振响应值稳定后， 记录表面等离子体共振光谱图 ； （5） 通入 0.02mol/L（pH 2.4） 甘氨酸 - 盐酸溶液， 冲洗传感芯片表面， 破坏溶菌酶与 适配体的结合， 完成传感元件再生 ； （6）浓度由低到高， 依次通入其他浓度 （50-600ng/mL）的待测标准样品测量方法同 （4） ， 获得相应表面等离子体共振光谱图 ； 取卡那霉素残留的表面等离子体谱图稳定。

21、值， 绘 制标准曲线， 并进行多项式曲线拟合， 获得浓度 - 稳定值关系回归曲线方程 ； （7） 传感芯片再生后， 将实际未知浓度待测样品按步骤 （4） 与适量溶菌酶标记卡那霉素 溶液充分混合 ； 泵入的表面等离子体共振谱仪中， 同时记录卡那霉素残留组分的光谱图， 确 定相应稳定值， 代入各自标准曲线， 确定各组分含量， 检测限可达 pg/mLng/mL 级， 低于国 家规定的最高允许含量 ； （8） 再次通入 0.02mol/L（pH 2.4） 甘氨酸 - 盐酸溶液， 冲洗表面等离子体共振传感 芯片， 进行芯片再生， 用于 PAPMP 残留组分测量 ； 将适配体变换为 PAPMP 适配体， 。

22、而卡那霉 说 明 书 CN 102628803 A 6 4/4 页 7 素 - 溶菌酶偶联物变为 PAPMP- 溶菌酶偶联物 ； PAPMP 检测中步骤 （3） 中配制的溶液浓度改 为0pg/mL， 200ng/mL， 500ng/mL， 1g/mL， 2g/mL， 4g/mL。 检测限可达ng/mLg/mL级， 低于国家规定的最高允许含量。 0017 本发明为了叙述的准确和方便， 在实施例中以卡那霉素和 PAPMP 为例进行详细描 述， 但本发明同样适用于食品中其他农兽药残留的测定， 如雌二醇、 四环素类抗生素等的精 确检测和定性分析。传感器表面再生所用溶液选择 0.02mol/L（pH 2。

23、.4） 甘氨酸 - 盐酸 溶液， 但还可以选择盐溶液或弱酸弱碱溶液或高离子强度电解质溶液， 如 0.5mol/L 氢氧化 钠溶液或 10mmol/L 甘氨酸 / 盐酸缓冲溶液， 破坏溶菌酶与适配体的结合。因此上述内容均 在本发明保护范围之内。 此外， 根据实施例的方法进行检测样品， 与现有表面等离子体检测 技术相比， 准确度提高 210 倍， 探头寿命延长 10 倍以上， 现有表面等离子体检测技术不能 准确检测的雌二醇等小分子量 （1000Da） 物质， 可以采用本发明的方法获得准确的检测结 果。 说 明 书 CN 102628803 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102628803 A 8 。