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1、(10)申请公布号 CN 102520038 A (43)申请公布日 2012.06.27 CN 102520038 A *CN102520038A* (21)申请号 201110425479.X (22)申请日 2011.12.16 G01N 27/327(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 李在均 夏前芳 赵静 杨雪 李洋 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 32104 代理人 曹祖良 (54) 发明名称 石墨烯生物传感器的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种石墨烯生物传感器的制备方 法， 属于。
2、电化学技术领域。 其将处理后的金电极浸 入氧化石墨烯和硫酸钠溶液中， 控制电位电沉积， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥后放在氯金酸溶液 中， 控制电位电沉积， 取出电极， 用水洗涤， 室温干 燥。将修饰电极置入导电高分子单体和支持电解 质溶液中， 控制电位采用循环伏安法进行聚合， 取 出电极， 用水洗涤， 室温干燥。修饰电极在 EDC/ NHS 溶液活化， 然后在呕吐毒素抗体中浸泡即可。 本发明用电沉积固定石墨烯、 金纳米和导电聚合 物， 不仅非常绿色环保， 而且涂层厚度及金纳米粒 子的大小和分布密度可以精准控制， 从而使修饰 电极的批生产重复性好。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 。
3、页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种石墨烯生物传感器的制备方法， 其特征是步骤为 ： 1) 石墨烯修饰电极的制备 ： 将氧化石墨超声分散于去离子水中形成稳定的浓度为 0.0001 0.1mg/mL 氧化石墨烯分散液， 超声频率为 55kHz-60kHz， 加入支持电解质， 调 节至支持电解质浓度为 0 1mol/L ； 以铂片为基础电极， 在电学化工作站上控制电位 在 -0.9 -1.2V 处电沉积 10 50s， 取出电极， 用去离子水洗涤， 室温干燥 ； 2。
4、) 氯金酸处理 ： 将步骤 1) 制得的石墨烯修饰电极放入 0.002 0.2mmol/L 氯金酸溶 液中， 在电化学工作站上控制电位在-0.250.4V处电沉积1050s， 取出电极， 用去离子 水洗涤， 室温干燥 ； 3) 循环伏安扫描 ： 复重 1) 和 2) 的操作 5 50 次， 然后将所得到的电极放入含有 0.01 0.2mol/L 导电高分子单体和 0.001 0.005mol/L 支持电解质的溶液中进行循环 伏安扫描， 循环伏安扫描电压范围是0 1.0V， 扫描速率是 10 400mV/s， 循环次数为 2 10 次， 温度为 0 40， 扫描完成后取出电极， 用去离子水洗涤，。
5、 室温干燥 ； 4) 石墨烯生物传感器的制备 ： 将步骤 3) 所得到的电极于 18 22mMEDC/NHS 溶液中活 化 4 6h， 然后在 8 12mg/mL 过氧化氢酶中浸泡 22 26h， 用去离子水洗涤， 4下干燥， 然后在电化学工作站上测试石墨烯生物传感器的分析性能。 2. 如权利要求 1 所述石墨烯生物传感器的制备方法， 其特征是 ： 所述高分子导电高分 子单体是如下式 1 所示的化合物 2， 5- 二 (2- 噻吩 )-1-R- 吡咯 ； 其中， R 是取代基， 为碳原子数在 1 20 之间的烷烃、 烯烃、 炔烃基或芳香基， 在其后再 连接 1 3 个羧基。 3. 如权利要求 。
6、1 所述石墨烯生物传感器的制备方法， 其特征是 ： 步骤 1) 所述的支持电 解质是以 K+或 Na+为阳离子， 以 SO42-、 CO32-、 CH3COO-、 Cl-、 ClO4-、 ClO3-或 NO3-为阴离子所组 成的化合物中的任何一种。 4.如权利要求1所述石墨烯生物传感器的制备方法， 其特征是 ： 步骤3)所述的复重1) 和 2) 的操作的次数为 10 20 次。 5. 如权利要求 1 所述石墨烯生物传感器的制备方法， 其特征是 ： 步骤 3) 所述的支持电 解质是以季胺基为阳离子， 以氯离子、 溴离子、 氯酸根、 高氯酸根、 四氟硼酸根或六氟磷酸根 为阴离子所组成的化合物， 或。
7、者它们的混合物。 权 利 要 求 书 CN 102520038 A 2 1/5 页 3 石墨烯生物传感器的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种石墨烯生物传感器的制备方法， 属于电化学技术领域。 背景技术 0002 石墨烯是单层碳原子紧密堆积形成的六方蜂巢状晶格结构的晶体， 独特的二维结 构使其具有优异的电学、 热学、 力学及化学性质， 但石墨烯片层间存在较大的范德华力， 易 发生堆积和聚集， 从而限制了它在许多方面的应用。为了解决以上问题， 人们在石墨烯片 层间掺杂金等金属纳米粒子， 这不仅有效地避免石墨烯片层因聚集而重新回到石墨晶体， 而且大大改善了石墨烯材料的电子传导性 (Zhon。
8、g， Z.Y.， Wu， W.， Wang， D.， Wang， D.， Shan， J.L.， Qing， Y.， Zhang， Z.M.， Biosensors and Bioelectronics， 2010， 25 ： 2379-2382)。最 近， 石墨烯 / 金属复合材料在生物传感器中的应用受到广泛关注 (Wan， Y.， Wang， Y.， Wu， J.J.， Zhang， D.， Anal.Chem.， 2011， 83 ： 648-652)。 0003 石墨烯材料和酶的固定对石墨烯基生物传感器性能及应用至关重要。目前， 石墨 烯材料和酶的固定多采用物理吸附法。通常是先采用 H。
9、ummer 法合成氧化石墨， 再将氧化石 墨超声分散在水中制成氧化石墨烯分散液， 然后与金属前驱体混合， 加入硼氢化钠等强还 原剂使氧化石墨烯和金属前驱体原位还原而制备石墨烯 / 金属复合材料， 复合材料在稳定 剂作用下重新分散于水以后滴涂于电极表面 (Gu， Z.G.， Yang， S.P.， Li， Z.J.， Sun， X.L.， Wang， G.L.， Fang， Y.J.， Liu， J.K.， Anal.Chim.Acta， 2011， 701 ： 75-80)。滴涂法耗时较多， 需要使用有毒化学试剂， 所得产品分散性差， 且涂层粗糙， 厚度难以精确控制， 从而导致材 料的电催化性。
10、能下降。最近， 研究人员提出了一种新的电化学方法。将电极置入氧化石墨 烯和氯金酸的混合溶液， 采用循环伏安扫描一次完成复合材料的制备和固定 (Liu， C.B.， Wang， K.， Luo， S.L.， Tang， Y.H.， Chen， L.Y.， Small， 2011， 7 ： 1203-1206)。方法具有简单、 快速和绿色等显著特点， 但氧化石墨与贵金属前驱体之间易发生氧化还原反应， 导致混合 溶液变质快且得到的电极修饰层较粗糙。壳聚糖是一种生物质材料， 它优异的成膜能力常 被用于酶在电极表面的固定 (Yang， Y.C.， Dong， S.W.， Shen， T.， Jian， 。
11、C.X.， Chang， H.J.， Li， Y.， Zhou， J.X.， Electrochim.Acta， 2011， 56 ： 6021-6025)。但这种物理吸附法所固定的 酶易脱落， 使传感器的稳定性和重现性难以满足实际工作对检测准确性的要求。 另外， 壳聚 糖等非导电性材料的使用也会影响电极的电化学响应。为了解决这一问题， 人们尝试利用 氧化石墨烯含有丰富羧基的特点， 以 DHC/NHS 为活化剂将共价连接在修饰电极上， 但氧化 石墨烯导电性差， 所制备的传感器分析性能不理想。 因此建立绿色、 简便和可靠的石墨烯生 物传感器的制备方法势在必行。 0004 经过广泛的研究和反复的试。
12、验发现， 采用电化学法依次电沉积石墨烯、 纳米金和 导电高分子电沉积在电极表面， 然后以共价键合方式将的酶或抗体固定在导电高分子膜 上。电化学法不仅实现了电化学反应和材料在电极上的固定同时完成， 还能实现对石墨烯 和导电高分子涂层厚度以及金纳米粒子的粒径和分布密度的精确控制， 而且材料的制备过 程没有 “三废” 产生。本发明人进一步对电沉积条件进行优化选择， 终于实现了提高石墨烯 说 明 书 CN 102520038 A 3 2/5 页 4 生物传感器的稳定性、 灵敏度和精密度的目的。 发明内容 0005 本发明的目的在于针对现有的石墨烯生物传感器存在石墨烯和酶易脱落、 灵敏度 不高和传感器制。
13、作的重现性差的不足， 提供一种新的石墨烯生物传感器的制备方法。方法 显著地改善了石墨烯生物传感器的稳定性、 灵敏度和精密度， 还绿色环保， 不会造成环境污 染。 0006 按照本发明提供的技术方案， 一种石墨烯生物传感器的制备方法， 步骤为 ： 0007 1) 石墨烯修饰电极的制备 ： 将氧化石墨超声分散于去离子水中形成稳定的浓度 为 0.0001 0.1mg/mL 氧化石墨烯分散液， 超声频率为 55kHz-60kHz， 加入支持电解质， 调节至支持电解质浓度为 0 1mol/L ； 以铂片为基础电极， 在电学化工作站上控制电位 在 -0.9 -1.2V 处电沉积 10 50s， 取出电极，。
14、 用去离子水洗涤， 室温干燥 ； 0008 2) 氯金酸处理 ： 将步骤 1) 制得的石墨烯修饰电极放入 0.002 0.2mmol/L 氯金 酸溶液中， 在电化学工作站上控制电位在-0.250.4V处电沉积1050s， 取出电极， 用去 离子水洗涤， 室温干燥 ； 0009 3) 循环伏安扫描 ： 复重 1) 和 2) 的操作 5 50 次， 然后将所得到的电极放入含有 0.01 0.2mol/L 导电高分子单体和 0.001 0.005mol/L 支持电解质的溶液中进行循环 伏安扫描， 循环伏安扫描电压范围是 0 1.0V， 扫描速率是 10 400mV/s， 循环次数为 2 10 次， 。
15、温度为 0 40， 扫描完成后取出电极， 用去离子水洗涤， 室温干燥 ； 0010 4) 石墨烯生物传感器的制备 ： 将步骤 3) 所得到的电极于 18 22mMEDC/NHS 溶液 中活化 4 6h， 然后在 8 12mg/mL 过氧化氢酶中浸泡 22 26h， 用去离子水洗涤， 4下 干燥， 然后在电化学工作站上测试石墨烯生物传感器的分析性能。 0011 所述高分子导电高分子单体是如下式 1 所示的化合物 2， 5- 二 (2- 噻吩 )-1-R- 吡 咯 ； 0012 0013 其中， R 是取代基， 为碳原子数在 1 20 之间的烷烃、 烯烃、 炔烃基或芳香基， 在其 后再连接 1 3。
16、 个羧基。 0014 步骤 1) 所述的支持电解质是以 K+或 Na+为阳离子， 以 SO42-、 CO32-、 CH3COO-、 Cl-、 ClO4-、 ClO3-或 NO3-为阴离子所组成的化合物中的任何一种。 0015 步骤 3) 所述的复重 1) 和 2) 的操作的次数为 10 20 次。 0016 步骤 3) 所述的支持电解质是以季胺基为阳离子， 以氯离子、 溴离子、 氯酸根、 高氯 酸根、 四氟硼酸根或六氟磷酸根为阴离子所组成的化合物， 或者它们的混合物。 0017 本发明具有如下优点 ： 本发明的一个实施例以氧化石墨为前驱体， 采用控制电位 在金电极表面电沉积石墨烯， 然后以氯金。
17、酸为前驱体采用控制电位在石墨烯表面电沉积金 说 明 书 CN 102520038 A 4 3/5 页 5 纳米粒子。重复以上操作 20 次后， 将电极放入 2， 5- 二 (2- 噻吩 )-1- 对苯甲酸吡咯单体溶 液中， 采用循环伏安法进行电聚合， 重复扫描 6 次。最后， 以 EDC/NHS 为活化剂将过氧化氢 酶共价键合方式结合在导电高分子膜上， 并在电化学工作站上测试该生物传感器的分析性 能。 研究表明， 所得到的过氧化氢生物传感对过氧化氢有非常灵敏的电化学响应， 其检出限 达 210-8mol/L， 具体优势如下 ： 0018 1) 电沉积固定石墨烯、 金纳米和导电聚合物， 不仅非常。
18、绿色环保， 而且涂层厚度及 金纳米粒子的大小和分布密度可以精准控制， 从而使修饰电极的批生产重复性好。 0019 2) 所得到的石墨烯 / 金复合材料分散性良好， 表现出显著的电催化活性， 其电化 学检测的灵敏度明显高于现有技术。 0020 3) 共价键合方式固定生物活性大分子物质， 克服了滴涂法的酶或抗体易脱落不 足， 大大改善了生物传感器的稳定性及检测精度。 附图说明 0021 图 1 本发明工艺流程图。 具体实施方式 0022 下面用实施例来进一步说明本发明， 但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 本发明中所述 。
19、的 “室温” 、“常压” 是指日常操作间的温度和气压， 一般为 25， 一大气压。 0023 下述实施例中， 所用的工作电极是金电极 ( 1mm)。电极在使用前用粒径为 50nm 的氧化铝粉末进行抛光处理， 在乙无水醇中浸洗 10min， 然后超声清洗， 干燥， 称重。电 沉积和电化学测试所用的工作电极和对电极都是裸的金电极或各种修饰电极， 参与电极 为 AgCl/Ag 标准电极。电化学测试采用循环伏安法， 操作电压为 -0.8 0.8V， 扫描速率为 100mV/s， 测试底液为 pH 为 7 的磷酸缓冲溶液。 0024 实施例 1 0025 将处理后的金电极浸入 0.05mg/mL 氧化石。
20、墨烯分散液中， 在 20下控制电位 在-1.2V处电沉积50s， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥后放在0.05mmol/L的氯金酸溶液中， 在 20下控制电位在 -0.25V 处电沉积 50s， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥。以上电沉积 操作循环 20 次后， 将修饰电极置入 3mL 含有 2， 5- 二 (2- 噻吩 )-1- 对苯甲酸吡咯 (1mmol/ L) 和四丁基高氯酸胺 (0.1mol/L) 的二氯甲烷溶液中， 控制电位在 0 1V 之间采用循环伏 安法进行聚合， 以 100mV/s 的 速率扫描六次， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥。修饰电极 在 20mmol/L EDC。
21、/NHS 溶液活化 4h， 然后在 10mg/mL 过氧化氢酶中浸泡 24h， 所得到的过氧 化氢生物传感器检测过氧化氢的检出限达 2.010-8mol/L， 20 次重复测定相对标准偏差为 1.8。 0026 实施例 2 0027 将处理后的金电极浸入 0.02mg/mL 氧化石墨烯分散液中， 在 0下控制电位 在-1.0V处电沉积20s， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥后放在0.01mmol/L的氯金酸溶液中， 在 25控制电位在 -0.3V 处电沉积 40s， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥。以上电沉积操作 循环 30 次后， 将修饰电极置入 3mL 含有 2， 5- 二 (2- 噻。
22、吩 )-1- 对苯甲酸吡咯 (1mmol/L) 和 说 明 书 CN 102520038 A 5 4/5 页 6 四丁基氯化胺 (0.1mol/L) 的二氯甲烷溶液中， 控制电位在 0 1V 之间采用循环伏安法进 行聚合， 以 200mV/s 的速率扫描六次， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥。修饰电极在 20mmol/ L EDC/NHS 溶液活化 4h， 然后在 10mg/mL 葡萄糖氧化酶中浸泡 24h， 所得到的葡萄糖生物传 感器检测葡萄糖的检出限达 1.010-9mol/L， 20 次重复测定相对标准偏差为 1.0。 0028 实施例 3 0029 将处理后的金电极浸入含有 0.02。
23、mg/mL 氧化石墨烯和 0.1mol/L 氯化钾溶液， 在 40下控制电位在 -1.0V 处电沉积 20s， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥后放在 0.01mmol/L 的氯金酸溶液中， 在0下控制电位在-0.4V处电沉积20s， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥。 以上电沉积操作循环 50 次后， 将修饰电极置入 3mL 含有 2， 5- 二 (2- 噻吩 )-1- 对苯甲酸吡 咯(1.0mmol/L)和四辛基胺四氟硼酸盐的二氯甲烷溶液(0.1mol/L)中， 控制电位在01V 之间采用循环伏安法进行聚合， 以 300mV/s 的速率扫描六次， 取出电极， 用水洗涤， 室温干 燥。修饰电。
24、极在 20mmol/L EDC/NHS 溶液活化 4h， 然后在 20mg/mL 黄曲霉毒素 B1抗体中浸 泡 24h， 所得到的葡萄糖生物传感器的检出限达 1.010-10mol/L， 20 次重复测定相对标准 偏差为 1.8。 0030 实施例 4 0031 将处理后的金电极浸入含有 0.01mg/mL 氧化石墨烯和 0.1mol/L 硫酸钾溶液， 在 0下控制电位在-1.2V处电沉积10s， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥后放在0.02mmol/L的 氯金酸溶液中， 在 0下控制电位在 -0.25V 处电沉积 30s， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥。 以上电沉积操作循环 30 次后。
25、， 将修饰电极置入 3mL 含有 2， 5- 二 (2- 噻吩 )-1- 邻苯甲酸吡 咯 (1mmol/L) 和四辛基溴化铵的二氯甲烷溶液 (0.2mol/L) 中， 控制电位在 0 1V 之间采 用循环伏安法进行聚合， 以 50mV/s 的速率扫描 2 次， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥。修饰 电极在 20mMEDC/NHS 溶液活化 4h， 然后在 20mg/mL 过氧化氢酶中浸泡 24h， 所得到的过氧化 氢生物传感器的检出限达 1.010-7mol/L， 20 次重复测定相对标准偏差为 1.1。 0032 实施例 5 0033 将处理后的金电极浸入含有 0.05mg/mL 氧化石墨。
26、烯和 0.1mol/L 硫酸钠溶液， 在 10下控制电位在 -1.0V 处电沉积 20s， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥后放在 0.01mmol/ L 的氯金酸溶液中， 在 0下控制电位在 -0.35V 处电沉积 10s， 取出电极， 用水洗涤， 室温干 燥。以上电沉积操作循环 15 次后， 将修饰电极置入 3mL 含有 2， 5- 二 (2- 噻吩 )-1- 丙酸吡 咯 (1mmol/L) 和四辛基溴化铵的二氯甲烷溶液 (0.2mol/L) 中， 控制电位在 0 1V 之间采 用循环伏安法进行聚合， 以 20mV/s 的速率扫描 8 次， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥。修饰 电极在 。
27、20mM EDC/NHS 溶液活化 4h， 然后在 20mg/mL 呕吐毒素抗体中浸泡 24h， 所得到的呕 吐毒素生物传感器的检出限达 2.510-11mol/L， 20 次重复测定相对标准偏差为 1.0。 0034 实施例 6 0035 将处理后的金电极浸入含有0.1mg/mL氧化石墨烯和0.3mol/L硫酸钠溶液， 在0 下控制电位在 -0.9V 处电沉积 20s， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥后放在 0.02mmol/L 的氯 金酸溶液中， 在 10下控制电位在 -0.25V 处电沉积 20s， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥。 以上电沉积操作循环 15 次后， 将修饰电极置入 。
28、3mL 含有 2， 5- 二 (2- 噻吩 )-1- 丙烯酸吡咯 (1mmol/L)和四辛基溴化铵的二氯甲烷溶液(0.2mol/L)中， 控制电位在01V之间采用循 环伏安法进行聚合， 以 20mV/s 的速率扫描 6 次， 取出电极， 用水洗涤， 室温干燥。修饰电极 说 明 书 CN 102520038 A 6 5/5 页 7 在 20mM EDC/NHS 溶液活化 4h， 然后在 20mg/mL 河虾过敏原中浸泡 24h， 所得到的河虾过敏 原生物传感器的检出限达 3.310-8mol/L， 20 次重复测定相对标准偏差为 2.1。 说 明 书 CN 102520038 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102520038 A 8 。