携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白 及其重组表达方法与应用 技术领域 本发明属于融合蛋白及其重组表达方法与应用， 特别是涉及一种携带牛病毒性腹 泻病毒 (Bovine viral diarrhea virus， BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白及其重 组表达方法与其在牛病毒性腹泻病毒的 ELISA 检测中的应用。
背景技术 牛 病 毒 性 腹 泻 病 毒 (Bovine viral diarrhea virus， BVDV) 属 于 黄 病 毒 科 (Flaviviridae) 瘟病毒属 (Pestivirus)， 为单股正链 RNA 病毒， 与羊边界病病毒 (Border diseasevirus， BDV) 以及猪瘟病毒 (Classical swine fever virus， CSFV) 在血清学上有 交叉反应 ( 殷震， 刘景华 . 动物病毒学 [M]. 第 2 版 . 科学出版社， 1997.631-645)。BVDV 感 染往往是亚临床性的或导致轻微和非特异性临床症状。然而， 经胎盘感染可产出免疫耐受 的持续性感染牛犊， 这些持续感染动物终生带毒， 持续排毒， 成为牛群中的重要传染源， 加 重牛群的感染 (Weiland E.Ahl R.Stark et al.A second envelope lycoproteinmediate neutralization of a pestivirus hog cholera virus [J]Virol ， 1992 ，(66) ： 3677-3682)。
BVDV 的感染分布全球， 虽然感染率不同， 但感染往往在许多国家流行， 持续性感 染的牛 (PI) 最高可达到 1-2 ％， 抗体阳性的牛可达 60-85 ％ (Houe H.Epidemiological features and economical importance of bovine virus diarrhoea virus(BVDV) infections.Vet Microbiol， 1999， 64(2-3) ： 89-107)。 长期以来， 该病一直严重影响畜牧业 的发展， 同时 BVDV 还是牛源生物制品 ( 血清、 冻精、 冷冻胚胎及疫苗等 ) 的常在污染源， 给 畜牧业和相关商业领域造成了巨大的经济损失。
BVDV 检测的 “金标准” 为病毒中和试验 (Edwards S.The diagnosis of bovine virus diarrhoea-mucosal disease in cattle.Rev Sci Tech， 1990， 9(1) ： 115-30)， 此 方法敏感且特异， 但需要进行细胞培养且劳动量大。而 ELISA 方法检测 BVDV 操作简便， 费用低， 可用于大批量样本的检疫， 非常适用于临床诊断和检疫。传统的 ELISA 试剂盒基 于 BVDV 感染的细胞， 但 BVDV 在组织中产生的蛋白量较低， 很难获得充足数量的纯蛋白质 用于 BVDV 的诊断 (Justewicz DM， Magar R， Marsolais G， et al.Bovine viral diarrhea virus-infected MDBK monolayer as antigen in enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)for the measurement of antibodies in bovine sera.Vet.Immunol. Immunopathol， 1987， 14(4) ： 377-384)。
在病毒蛋白中， 结构蛋白 E0 和 E2， 非结构蛋白 NS3 已被确定为 BVDV 的主要免 疫原 (Bolin SR.Immunogens of bovine viral diarrhea virus.Vet.Microbiol， 1993， 37(3-4) ： 263-271)。非结构蛋白 NS3 在瘟病毒属内保守， 行使相似的功能， 在病毒增殖过 程中， NS3 蛋白出现在内质网中， 直接参与病毒蛋白的加工过程。该蛋白具有蛋白酶活性 (Protease) 和解旋酶活性 (Helicase)。NS3 蛋白是一种免疫优势蛋白， 在自然感染或弱毒
活疫苗免疫后的动物中都可以产生针对 NS3 蛋白的抗体 (Brown LM， Papa RA， Frost MJ， et al.A single amino acid is critical for the expression of B-cell epitopes on the helicase domain of the pestivirus NS3protein.Virus Res， 2002， 84(1-2) ： 111-124)， 具有重要的诊断价值。同时， 由于 NS3 蛋白本身的非结构性质， 动物在接种传统 灭活疫苗后， NS3 抗体的检测可以区分疫苗接种或自然感染的动物。很多研究人员建议由 NS3 作为诊断检测试剂， 便于疫苗接种或 NS3 血清学监控天然感染 (Sandvik T.Laboratory diagnostic investigations for bovine viral diarrhoea virus infections in cattle.Vet Microbiol， 1999， 64(2-3) ： 123-34 ； Reddy JR， Kwang J， Okwumabua O， et al.Application of recombinant bovine viral diarrhea virus proteins in the diagnosis of bovine viral diarrhea infection in cattle.Vet Microbiol， 1997， 57(2-3) ： 119-33 ； Deregt D， Masri SA， Cho HJ， et al.Monoclonal antibodies to the p80/125gp53proteins of bovine viral diarrhea virus ： their potential use as diagnostic reagents.Can J Vet Res， 1990， 54(3) ： 343-348)。 近 十 多 年 来， 国外已有 表达 NS3 蛋白或其截短片段作为诊断抗原， 建立 ELISA 诊断方法用于检测牛群中 BVDV 抗 体的报道。而且 Zoth 等在 2006 年通过多种重组 ELISA 方法的比较确定了 NS3 抗原可以 检测到由病毒中和实验和其它结构蛋白 ELISA 方法判定为阴性的样品中的抗 BVDV 抗体 (Chimeno Zoth S， Taboga O.Multiple recombinant ELISA for the detection of bovine viral diarrhoea virus antibodies in cattle sera.J Virol Methods， 2006， 138(1-2) ： 99-108)。 发明内容 本发明的目的是提供一种重组诊断抗原， 涉及一种携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白。
本发明所提供的携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋 白， 是在牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的氨基 (N) 端连接有折叠酶 DsbA 的融合蛋白。
其中， 所述 DsbA 自氨基端 (N 端 ) 位与氧化还原功能相关的两个半胱氨酸 (Cys) 突变成丝氨酸 (Ser)， 目的是使目的基因与突变后的 DsbA 融合， 实现胞内可溶性有活性的 高表达 ( 表达量大于 30％ )。
具体来讲， 所述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋 白， 命名为 DsbA/BVDV NS3， 是下述氨基酸残基序列之一 ：
1) 序列表中的 SEQ ID No ： 1；
2) 将序列表中 SEQ ID No ： 1 的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、 缺失或添加且具有丝氨酸蛋白酶活性、 RNA 解旋酶活性的蛋白质。
序列表中的 SEQ IDNo ： 1 由 563 个氨基酸残基组成， 自氨基 (N) 端第 1-215 位为折 叠酶 DsbA 的氨基酸残基序列， 自氨基端第 218-561 位为牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构 蛋白 NS3 优势区的氨基酸残基序列。
编码上述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区融合蛋白的基因 (DsbA/BVDVNS3) 也属于本发明的保护范围， 它是下述核苷酸序列之一 ：
1) 序列表中 SEQ ID No ： 2 的 DNA 序列 ；
2) 编码序列表中 SEQ ID No ： 1 的 DNA 序列 ；
3) 与序列表中 SEQ ID No ： 2 限定的核苷酸序列具有 90％以上同源性且具有丝氨 酸蛋白酶活性、 RNA 解旋酶活性的核苷酸序列 ；
4) 在高严谨条件下可与序列表中 SEQ ID No ： 2 限定的 DNA 序列杂交的核苷酸序 列。
所述高严谨条件为杂交后用含 0.1×SSPE( 或 0.1×SSC)、 0.1 ％ SDS 的溶液在 65℃下洗膜。
序列表中的 SEQ ID No ： 2 由 1689 个碱基组成， 其编码序列为自 5’ 端第 1-1689 位 碱基， 编码具有序列表中 SEQ ID No ： 1 的氨基酸残基序列的蛋白质， 其中， 自 5’ 端第 1-645 位碱基编码折叠酶 DsbA， 自 5’ 端第 652-1683 位碱基编码牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构 蛋白 NS3 优势区。
含有本发明基因的表达载体、 转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种上述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白的重组表达方法。
本发明所提供的上述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融 合蛋白的重组表达方法， 是将含有上述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势 区的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主中， 经表达、 纯化得到携 带牛病毒性腹泻 病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白。
在上述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白的重组 表达方法中， 所述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白编码基 因可采用转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 扩增得到， 用于扩增该基因的上、 下游引物序列分 别如序列表中 SEQ ID No ： 3 和 SEQ ID No ： 4 所示。
序列表中 SEQ ID No ： 1 由 33 个碱基组成， SEQ ID No ： 2 由 31 个碱基组成， 其中 SEQ ID No ： 1 自 5’ 端的第 1 位至第 6 位碱基为 BagII 酶切位点， SEQ ID No ： 2 自 5’ 端第 1 位至第 6 位碱基为 NheI 酶切位点。
用于构建含有上述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合 蛋白编码基因的重组表达载体的出发载体可为任意一种携带折叠酶 DsbA 基因的原核表达 载体 pET-DsbA。
其中， 以 pET-DsbA 为出发载体构建的含有携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构 蛋白 NS3 优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体为 pET-DsbA-NS3。
所述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白编码基因 位于原核表达载体 pET-DsbA 多克隆位点处的 BagII 和 Nhe I 限制性酶切位点之间。
所述宿主可为大肠杆菌、 酵母菌、 哺乳动物细胞、 昆虫细胞或枯草杆菌等， 优选为 大肠杆菌。
所述大肠杆菌具体可为 BL21(Rosetta)、 BL21(DE3)、 BL21(DE3， plysS)， E.coli JM109， E.coli HB101 或 E.coli Topl0 等， 优选为 BL21(Rosetta)。
其中， 以大肠杆菌 BL21(Rosetta) 为出发菌株构建的含有携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体 pET-DsbA-NS3 的工程 菌为 BL21(Rosetta)/DsbA-NS3。
上述重组表达载体和工程菌均可按照常规方法构建。
培养含有本发明携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋 白编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件， 均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。
所述宿主为大肠杆菌时， 需加入终浓度为 0.1-0.3％ ( 优选为 0.2％ ) 的葡萄糖和 0.8mM-1.2mM( 优选为 1mM)IPTG 诱导表达， 诱导温度为 30℃， 诱导时间为 1-5 小时。
所述对诱导表达的目的蛋白进行纯化的方法优选为镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化。
本发明提供了一种携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合 蛋白及其编码基因。本发明的融合蛋白是将牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋 白 NS3 优 势区的氨基 (N) 端连接折叠酶 DsbA 后得到的融合蛋白。所述 DsbA 去掉了信号肽， 同时将 DsbA 与氧化还原功能相关的两个半胱氨酸 (Cys) 突变成丝氨酸 (Ser)， 经过突变后的 DsbA 与牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区融合可实现 NS3 基因的胞内可溶性有 活性的高表达 ( 表达量大于 30％ )。本发明融合蛋白的表达方法中采用携带 T7 启动子和 DsbA 基因的 pET-DsbA 表达载体， 同时选用凝血酶切割位点作为牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区基因的插入位点， 且由于该基因的编码蛋白是非糖基化蛋白， 因而 表达的牛病毒性腹泻病毒 NS3 免疫优势蛋白具有很好的抗原性， 可用于牛病毒性腹泻病毒 的 ELISA 检测， 应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图说明 图 1 为牛病毒性腹泻病毒 NS3 蛋白免疫优势区基因的 RT-PCR 扩增结果
图 2 为克隆载体 pMD18-T-NS3 的 PCR 鉴定结果
图 3 为重组表达载体 pET-DsbA-NS3 的 PCR 鉴定结果
图 4 重组表达载体 pET-DsbA-NS3 的测序结果
图 5 为携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白表达产物的 12％ SDS-PAGE 电泳检测结果
图 6 为携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白表达上清经纯化 浓缩后的 12％ SDS-PAGE 电泳检测结果
图 7 为间接 ELISA 测定牛病毒性腹泻病毒抗体的结果
具体实施方式
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施， 给出了详细的实施方式和具体的 操作过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例 1、 携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白及其重组表 达
一、 携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白编码基因的扩增
1、 引物设计根据牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 的 mRNA 序列， 设计用于扩增牛病毒性腹泻 病毒非结构蛋白 NS3 优势区基因的上、 下游引物 P1 和 P2， 其中在上游引物 P1 中加入 BagII 酶切位点， 下游引物 P2 中加入 NheI 酶切位点， 具体的引物序列为 P1 ： AGATCTATGGTCAAGA AGATAACCAGCATGAAC( 带下划线的碱基序列为 BagII 酶切位点 )( 序列表中 SEQ ID No ： 3)， P2 ： GCTAGCCTCCCTAAAGGATTTCGTCACGTTG( 带下划线的碱基序列为 NheI 酶切位点 )( 序列表 中 SEQ ID No ： 4)。
2、 牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 免疫优势区基因的扩增
用反转录聚合酶反应 (RT-PCR) 的方法扩增牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 免 疫优势区基因， 具体方法包括以下步骤 ：
1) 将 MDBK 细胞 ( 牛肾细胞 ) 培养的病毒悬液反复冻融 3 次， 4 ℃、 8000r 离心 20min， 取上清， 分别加入终浓度为 10％和 3％的 PEG20000 和 NaCl， 4℃磁力搅拌过夜。 次日， 4℃、 8000r 离心 30min， 弃上清， 沉淀用 PBS 重悬。分别配置 30％、 35％、 40％、 45％的 CsCl 溶液， 制备 CsCl 浓度梯度， 加入病毒浓缩液后， 4℃、 22000r/min 离心 16h， 对浓缩的病毒液 进行纯化。
2) 取病毒浓缩液 10μl 加入 200μl PBS， 加入 400μl Trizol， 轻混 1min， 室温静 止 10min， 再加入 400μl 氯仿， 轻混 1min， 室温静止 10min， 于 4℃、 12000g 离心 15min， 吸取 上层液， 加入一倍体积以上的异丙醇， -30℃沉淀 30min， 于 4℃、 14000g 离心 10min， 用灭菌 9μl DEPC 水重悬沉淀。 3) 用反转录聚合酶反应 (RT-PCR) 得到牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 免疫 优势区基因的 cDNA， 反应体系为 ： 5×RT-PCR buffer 4μl， 下游引物 P22μl， 鼠源反转录 酶 1μl， DEPC 水 4μl， 42℃反转录 1h， 再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增， 反应体系为 ： cDNA 3μl， 2×PCR buffer 12.5μl， 上游引物 P1 1μl， 下游引物 P2 1μl， ddH2O 8.5μl， 反应 条件为 ： 94℃预变性 5min ； 94℃变性 45s， 55℃退火 45s， 72℃延伸 1min， 共 32 个循环 ； 最后 72℃延伸 10min， 4℃终止反应。
4) 将步骤 3) 经 PCR 扩增获得的 DNA 片段用北京天根公司的 DNA 片段纯化试剂盒 进行纯化， 具体步骤为 ： 将 DNA 扩增片段进行 0.8％琼脂糖凝胶电泳分离， 分离结果如图 1 所示 (M ： DL2000Marker ； a： 阴性对照 ； b： DsbA/BVDV NS3 基因的 RT-PCR 产物 )， 经 PCR 扩增 获得了约 1032bp 的目的片段， 与预期结果相符， EB 染色以后， 于长波紫外灯下切取含有该 目的片段的琼脂糖凝胶， 放入一无菌 1.5mL EP 管中， 加入 400μl 溶胶液， 于 50℃水浴 5min， 期间轻弹 EP 管， 凝胶完全溶化， 然后将溶化的液体转至一回收柱， 于室温静置 5min， 8000r/ min 离心 1min， 倒掉收集管中的废液， 用洗涤液洗涤两次， 最后 12000r/min 离心 1min， 回收 柱转至一干净无菌 1.5mL EP 管中， 加 10μl 洗脱液洗脱， 于室温放置 5min， 12000r/min 离 心 1min， 收集管中即为回收的 DNA 片段。洗脱后的 DNA 贮存于 4℃或 -20℃。
二、 携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白的重组表达
1、 克隆载体 pMD18-T-NS3 的构建
将步骤一纯化的目的基因与克隆载体 pMD18-T( 购自大连宝生物工程有限公 司 ) 连 接， 20μl 连 接 体 系 包 括 0.5μl pMD18-T 载 体、 4.5μl 目 的 基 因 纯 化 产 物 和 5μl Solution I， 16 ℃过夜。反应结束后， 将连接产物转化至 E.coli TOP10F 感受态细 胞中， 提取质粒 DNA 进行 PCR 鉴定， 结果如图 2 所示 (M ： DL2000Marker ； a： 阴性对照 ； b：
pMD18-T-NS3PCR 鉴定结果 )， 表明获得了携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区基 因的阳性克隆， 将该携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区基因的重组克隆质粒命 名为 pMD 18-T-NS3。
2、 重组表达质粒 pET-DsbA-NS3 的构建与转化 BL21(Rosetta) 感受态菌
将 pMD18-T-NS3 质粒进行 BagII、 NheI 双酶切， 表达载体 pET-DsbA( 购自晶美生 物公司 ) 进行 BamHI、 NheI 双酶切， 再将两个载体的双酶切产物用 T4DNA 连接酶 16℃连接 过夜， 将连接产物转化大肠杆菌感受态菌 BL21(Rosetta)， 提取质粒 DNA， 以 P1、 P2 为引物 进行 PCR 扩增， 结果如图 3 所示 (M ： DL2000Marker ； a： pET-DsbA-NS3PCR 鉴定结果 ； b： 阴性 对照 )， 经扩增获得了 1032bp 的 DNA 片段， 与预期结果相符， 再挑选阳性克隆， 进行测序鉴 定， 测序结果如图 4 所示， 结果编码携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区 融合蛋白的基因 ( 命名为 DsbA/BVDV NS3) 具有序列表中 SEQ ID No ： 2 的 DNA 序列， 序列 表中的 SEQ ID No ： 2 由 1689 个碱基组成， 其编码序列为自 5’ 端第 1-1689 位碱基， 编码具 有序列表中 SEQ ID No ： 1 的氨基酸残基序列的蛋白质， 其中， 自 5’ 端第 1-645 位碱基编码 折叠酶 DsbA， 自 5’ 端第 652-1683 位碱基编码牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区。上述测序结果表明获得了插入序列及位置均正确的含有携带牛病毒性腹泻病毒 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白基因的重组表达载体， 命名为 pET-DsbA-NS3， 将携带有 pET-DsbA-NS3 的重组大肠杆菌工程菌命名为 BL21(Rosetta)/DsbA-NS3。 3、 携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区融合蛋白的诱导表达
挑取单个克隆的重组大肠杆菌工程菌 BL21(Rosetta)/DsbA-NS3， 接种于 3mL 含有 氨苄青霉素 (100mg/L) 的 LB 培养基， 37℃振摇培养过夜， 次日按 1％的比例扩大培养， 37℃ 振摇培养 2h 后 ( 吸光光度为 0.6-0.8)， 加入 IPTG( 终浓度为 1.0mmol/L)、 葡萄糖 ( 终浓度 为 0.2％ )， 继续于 30℃振摇培养诱导 4h-6h， 收集菌体。
4、 SDS-PAGE 蛋白电泳检测
用 12％ SDS-PAGE 凝胶分离步骤 3 重组表达的蛋白， 浓缩胶浓度为 5％， 分离胶浓 度为 12％， 结果如图 5 所示 (a， b， c， d， e 分别为 pET-DsbA-NS3 诱导 5h， 4h， 3h， 2h， 1h 产物 ； f 为空载体诱导 3h ； M 为蛋白质相对分子量标准 ： 250kDa， 150kDa， 100kDa， 80kDa， 60kDa， 50kDa， 40kDa， 30kDa， 25kDa， 20kDa， 15kDa， 10kDa)， 经表达获得了 62.9kDa 的重组蛋白， 与 预期结果相符， 表明牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区融合蛋白已获得表 达。
5、 表达产物的分离纯化
取诱导菌液 200mL 收集菌体， 用 50mmol/L pH7.4 的 PBS 缓冲液约 5mL 悬浮菌体， 超声法破碎菌体， 超声条件为 ： 功率 200W， 超声 3s、 停 2s 为一个循环， 共 180 个循环超声破 碎， 超声液离心 12000r/min 15min， 取上清， 用针对 His 标签的镍琼脂糖凝胶柱纯化， 具体 操作为 ： 将样品加入经缓冲液 (0.5mol/L NaH2PO419mL， 0.5mol/LNa2HPO481mL， NaCl 29.3g， pH7.4) 洗涤的亲和层析柱， 用含 100mmol/L 咪唑的缓冲液进行阶段洗脱， 纯化后的蛋白装 入透析袋， 于透析液 (pH7.4PBS) 中， 4 ℃透析 20h。对纯化蛋白进行 12 ％ SDS-PAGE 凝胶 分； 离蛋白质， 结果如图 6 所示 (a 为 pET-DsbA-NS3 诱导产物纯化后 ； b 为 pET-DsbA-NS3 诱 导产物纯化前 ； M 为蛋白质相对分子量标准 ： 250kDa， 150kDa， 100kDa， 80kDa， 60kDa， 50kDa， 40kDa， 30kDa， 25kDa， 20kDa， 15kDa， 10kDa)， 表明牛病毒性腹泻病毒 NS3 蛋白免疫优势区融
合蛋白已得到纯化。
实施例 2、 间接 ELISA 法检测牛病毒性腹泻病毒抗体
1、 间接 ELISA 最佳反应条件的选择
BVDV 抗原最佳包被浓度与阴阳血清最佳稀释度的选择 ( 采用方阵试验进行工 作浓度的筛选 ) ： 取纯化的实施例 1 得到的重组 NS3 融合蛋白， 用包被液 (0.05mol/L 碳 酸 钠 - 碳 酸 氢 钠 缓 冲 液， pH9.6) 稀 释 为 8μg/mL、 4μg/mL、 2μg/mL、 1μg/mL， 加入酶标 板， 100μL/ 孔， 每个浓度作一行， 4℃过夜， 取出用 PBST(NaCl 8.0g， KH2PO4 0.2g， Na2HPO4 1.15g， KCl 0.2g， Tween-20 0.5mL， 加去离子水至 1000mL， 调 pH 至 7.4) 洗涤 3 次 ； 然后每 孔加入 250μL 封闭液 (PBST+1％明胶 )， 37℃封闭 2h， PBST 洗涤 3 次 ； 用 PBST 将牛阳性血 清和阴性血清 ( 标准阳性血清和标准阴性血清 ) 分别作 1 ∶ 20、 1 ∶ 40、 1 ∶ 80、 1 ∶ 160、 1 ∶ 320 稀释， 加入酶标板中， 每个稀释度作一列， 以 PBST 为空白对照， 100μL/ 孔于 37℃反 应 1h， 洗涤 3 次 ； 加入 1 ∶ 1000 兔抗牛 IgG-HRP( 北京经纬博恒生物科技开发有限责任公 司 )100μL/ 孔， 37℃反应 1h， 经洗涤后加入 TMB 底物 100μL， 室温避光作用 10-15min， 加 入 50μL 2mol/L H2SO4 终止反应， 测定 OD450nm。以阳性血清孔的 OD 值接近 1.0， P/N ≥ 2.1 的抗原、 血清最大稀释度作为抗原及待测血清的最适工作浓度。实验确定包被抗原浓度为 2μg/mL)， 血清抗体最佳稀释度为 1 ∶ 40。
2、 间接 ELISA 法测定牛病毒性腹泻病毒血清抗体
以方阵滴定所确定的抗原包被浓度 (2μg/mL) 作为包被抗原工作浓度， 对收集的 6 份牛血清样品 ( 经牛病毒性腹泻病毒抗体检测试剂盒 (INGEZIM 公司产品 ) 检测为阳性 ) 进行抗体检测， 同时设空白对照孔 (PBST) 和阴性对照孔 ( 标准阴性血清 )。
具体操作 ： 取纯化的实施例 1 得到的重组 NS3 融合蛋白， 以 2μg/mL 包被酶标板， 将 1 ∶ 40 稀释的牛血清样品和阴性对照血清加入酶标板中， 100μL/ 孔， 于 37℃反应 1h， 洗 涤后加入 1 ∶ 1000 兔抗牛 IgG-HRP( 北京经纬博恒生物科技开发有限责任公司 )， 100μL/ 孔， 37℃反应 1h， 洗涤后加入 TMB 底物 100μL， 室温避光作用 10-15min， 加入 50μL2mol/L H2SO4 终止反应， 测定 OD450nm。
背景技术 牛 病 毒 性 腹 泻 病 毒 (Bovine viral diarrhea virus， BVDV) 属 于 黄 病 毒 科 (Flaviviridae) 瘟病毒属 (Pestivirus)， 为单股正链 RNA 病毒， 与羊边界病病毒 (Border diseasevirus， BDV) 以及猪瘟病毒 (Classical swine fever virus， CSFV) 在血清学上有 交叉反应 ( 殷震， 刘景华 . 动物病毒学 [M]. 第 2 版 . 科学出版社， 1997.631-645)。BVDV 感 染往往是亚临床性的或导致轻微和非特异性临床症状。然而， 经胎盘感染可产出免疫耐受 的持续性感染牛犊， 这些持续感染动物终生带毒， 持续排毒， 成为牛群中的重要传染源， 加 重牛群的感染 (Weiland E.Ahl R.Stark et al.A second envelope lycoproteinmediate neutralization of a pestivirus hog cholera virus [J]Virol ， 1992 ，(66) ： 3677-3682)。
BVDV 的感染分布全球， 虽然感染率不同， 但感染往往在许多国家流行， 持续性感 染的牛 (PI) 最高可达到 1-2 ％， 抗体阳性的牛可达 60-85 ％ (Houe H.Epidemiological features and economical importance of bovine virus diarrhoea virus(BVDV) infections.Vet Microbiol， 1999， 64(2-3) ： 89-107)。 长期以来， 该病一直严重影响畜牧业 的发展， 同时 BVDV 还是牛源生物制品 ( 血清、 冻精、 冷冻胚胎及疫苗等 ) 的常在污染源， 给 畜牧业和相关商业领域造成了巨大的经济损失。
BVDV 检测的 “金标准” 为病毒中和试验 (Edwards S.The diagnosis of bovine virus diarrhoea-mucosal disease in cattle.Rev Sci Tech， 1990， 9(1) ： 115-30)， 此 方法敏感且特异， 但需要进行细胞培养且劳动量大。而 ELISA 方法检测 BVDV 操作简便， 费用低， 可用于大批量样本的检疫， 非常适用于临床诊断和检疫。传统的 ELISA 试剂盒基 于 BVDV 感染的细胞， 但 BVDV 在组织中产生的蛋白量较低， 很难获得充足数量的纯蛋白质 用于 BVDV 的诊断 (Justewicz DM， Magar R， Marsolais G， et al.Bovine viral diarrhea virus-infected MDBK monolayer as antigen in enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)for the measurement of antibodies in bovine sera.Vet.Immunol. Immunopathol， 1987， 14(4) ： 377-384)。
在病毒蛋白中， 结构蛋白 E0 和 E2， 非结构蛋白 NS3 已被确定为 BVDV 的主要免 疫原 (Bolin SR.Immunogens of bovine viral diarrhea virus.Vet.Microbiol， 1993， 37(3-4) ： 263-271)。非结构蛋白 NS3 在瘟病毒属内保守， 行使相似的功能， 在病毒增殖过 程中， NS3 蛋白出现在内质网中， 直接参与病毒蛋白的加工过程。该蛋白具有蛋白酶活性 (Protease) 和解旋酶活性 (Helicase)。NS3 蛋白是一种免疫优势蛋白， 在自然感染或弱毒
BVDV 的感染分布全球， 虽然感染率不同， 但感染往往在许多国家流行， 持续性感 染的牛 (PI) 最高可达到 1-2 ％， 抗体阳性的牛可达 60-85 ％ (Houe H.Epidemiological features and economical importance of bovine virus diarrhoea virus(BVDV) infections.Vet Microbiol， 1999， 64(2-3) ： 89-107)。 长期以来， 该病一直严重影响畜牧业 的发展， 同时 BVDV 还是牛源生物制品 ( 血清、 冻精、 冷冻胚胎及疫苗等 ) 的常在污染源， 给 畜牧业和相关商业领域造成了巨大的经济损失。
BVDV 检测的 “金标准” 为病毒中和试验 (Edwards S.The diagnosis of bovine virus diarrhoea-mucosal disease in cattle.Rev Sci Tech， 1990， 9(1) ： 115-30)， 此 方法敏感且特异， 但需要进行细胞培养且劳动量大。而 ELISA 方法检测 BVDV 操作简便， 费用低， 可用于大批量样本的检疫， 非常适用于临床诊断和检疫。传统的 ELISA 试剂盒基 于 BVDV 感染的细胞， 但 BVDV 在组织中产生的蛋白量较低， 很难获得充足数量的纯蛋白质 用于 BVDV 的诊断 (Justewicz DM， Magar R， Marsolais G， et al.Bovine viral diarrhea virus-infected MDBK monolayer as antigen in enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)for the measurement of antibodies in bovine sera.Vet.Immunol. Immunopathol， 1987， 14(4) ： 377-384)。
在病毒蛋白中， 结构蛋白 E0 和 E2， 非结构蛋白 NS3 已被确定为 BVDV 的主要免 疫原 (Bolin SR.Immunogens of bovine viral diarrhea virus.Vet.Microbiol， 1993， 37(3-4) ： 263-271)。非结构蛋白 NS3 在瘟病毒属内保守， 行使相似的功能， 在病毒增殖过 程中， NS3 蛋白出现在内质网中， 直接参与病毒蛋白的加工过程。该蛋白具有蛋白酶活性 (Protease) 和解旋酶活性 (Helicase)。NS3 蛋白是一种免疫优势蛋白， 在自然感染或弱毒
活疫苗免疫后的动物中都可以产生针对 NS3 蛋白的抗体 (Brown LM， Papa RA， Frost MJ， et al.A single amino acid is critical for the expression of B-cell epitopes on the helicase domain of the pestivirus NS3protein.Virus Res， 2002， 84(1-2) ： 111-124)， 具有重要的诊断价值。同时， 由于 NS3 蛋白本身的非结构性质， 动物在接种传统 灭活疫苗后， NS3 抗体的检测可以区分疫苗接种或自然感染的动物。很多研究人员建议由 NS3 作为诊断检测试剂， 便于疫苗接种或 NS3 血清学监控天然感染 (Sandvik T.Laboratory diagnostic investigations for bovine viral diarrhoea virus infections in cattle.Vet Microbiol， 1999， 64(2-3) ： 123-34 ； Reddy JR， Kwang J， Okwumabua O， et al.Application of recombinant bovine viral diarrhea virus proteins in the diagnosis of bovine viral diarrhea infection in cattle.Vet Microbiol， 1997， 57(2-3) ： 119-33 ； Deregt D， Masri SA， Cho HJ， et al.Monoclonal antibodies to the p80/125gp53proteins of bovine viral diarrhea virus ： their potential use as diagnostic reagents.Can J Vet Res， 1990， 54(3) ： 343-348)。 近 十 多 年 来， 国外已有 表达 NS3 蛋白或其截短片段作为诊断抗原， 建立 ELISA 诊断方法用于检测牛群中 BVDV 抗 体的报道。而且 Zoth 等在 2006 年通过多种重组 ELISA 方法的比较确定了 NS3 抗原可以 检测到由病毒中和实验和其它结构蛋白 ELISA 方法判定为阴性的样品中的抗 BVDV 抗体 (Chimeno Zoth S， Taboga O.Multiple recombinant ELISA for the detection of bovine viral diarrhoea virus antibodies in cattle sera.J Virol Methods， 2006， 138(1-2) ： 99-108)。 发明内容 本发明的目的是提供一种重组诊断抗原， 涉及一种携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白。
本发明所提供的携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋 白， 是在牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的氨基 (N) 端连接有折叠酶 DsbA 的融合蛋白。
其中， 所述 DsbA 自氨基端 (N 端 ) 位与氧化还原功能相关的两个半胱氨酸 (Cys) 突变成丝氨酸 (Ser)， 目的是使目的基因与突变后的 DsbA 融合， 实现胞内可溶性有活性的 高表达 ( 表达量大于 30％ )。
具体来讲， 所述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋 白， 命名为 DsbA/BVDV NS3， 是下述氨基酸残基序列之一 ：
1) 序列表中的 SEQ ID No ： 1；
2) 将序列表中 SEQ ID No ： 1 的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、 缺失或添加且具有丝氨酸蛋白酶活性、 RNA 解旋酶活性的蛋白质。
序列表中的 SEQ IDNo ： 1 由 563 个氨基酸残基组成， 自氨基 (N) 端第 1-215 位为折 叠酶 DsbA 的氨基酸残基序列， 自氨基端第 218-561 位为牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构 蛋白 NS3 优势区的氨基酸残基序列。
编码上述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区融合蛋白的基因 (DsbA/BVDVNS3) 也属于本发明的保护范围， 它是下述核苷酸序列之一 ：
1) 序列表中 SEQ ID No ： 2 的 DNA 序列 ；
2) 编码序列表中 SEQ ID No ： 1 的 DNA 序列 ；
3) 与序列表中 SEQ ID No ： 2 限定的核苷酸序列具有 90％以上同源性且具有丝氨 酸蛋白酶活性、 RNA 解旋酶活性的核苷酸序列 ；
4) 在高严谨条件下可与序列表中 SEQ ID No ： 2 限定的 DNA 序列杂交的核苷酸序 列。
所述高严谨条件为杂交后用含 0.1×SSPE( 或 0.1×SSC)、 0.1 ％ SDS 的溶液在 65℃下洗膜。
序列表中的 SEQ ID No ： 2 由 1689 个碱基组成， 其编码序列为自 5’ 端第 1-1689 位 碱基， 编码具有序列表中 SEQ ID No ： 1 的氨基酸残基序列的蛋白质， 其中， 自 5’ 端第 1-645 位碱基编码折叠酶 DsbA， 自 5’ 端第 652-1683 位碱基编码牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构 蛋白 NS3 优势区。
含有本发明基因的表达载体、 转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种上述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白的重组表达方法。
本发明所提供的上述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融 合蛋白的重组表达方法， 是将含有上述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势 区的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主中， 经表达、 纯化得到携 带牛病毒性腹泻 病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白。
在上述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白的重组 表达方法中， 所述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白编码基 因可采用转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 扩增得到， 用于扩增该基因的上、 下游引物序列分 别如序列表中 SEQ ID No ： 3 和 SEQ ID No ： 4 所示。
序列表中 SEQ ID No ： 1 由 33 个碱基组成， SEQ ID No ： 2 由 31 个碱基组成， 其中 SEQ ID No ： 1 自 5’ 端的第 1 位至第 6 位碱基为 BagII 酶切位点， SEQ ID No ： 2 自 5’ 端第 1 位至第 6 位碱基为 NheI 酶切位点。
用于构建含有上述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合 蛋白编码基因的重组表达载体的出发载体可为任意一种携带折叠酶 DsbA 基因的原核表达 载体 pET-DsbA。
其中， 以 pET-DsbA 为出发载体构建的含有携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构 蛋白 NS3 优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体为 pET-DsbA-NS3。
所述携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白编码基因 位于原核表达载体 pET-DsbA 多克隆位点处的 BagII 和 Nhe I 限制性酶切位点之间。
所述宿主可为大肠杆菌、 酵母菌、 哺乳动物细胞、 昆虫细胞或枯草杆菌等， 优选为 大肠杆菌。
所述大肠杆菌具体可为 BL21(Rosetta)、 BL21(DE3)、 BL21(DE3， plysS)， E.coli JM109， E.coli HB101 或 E.coli Topl0 等， 优选为 BL21(Rosetta)。
其中， 以大肠杆菌 BL21(Rosetta) 为出发菌株构建的含有携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体 pET-DsbA-NS3 的工程 菌为 BL21(Rosetta)/DsbA-NS3。
上述重组表达载体和工程菌均可按照常规方法构建。
培养含有本发明携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋 白编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件， 均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。
所述宿主为大肠杆菌时， 需加入终浓度为 0.1-0.3％ ( 优选为 0.2％ ) 的葡萄糖和 0.8mM-1.2mM( 优选为 1mM)IPTG 诱导表达， 诱导温度为 30℃， 诱导时间为 1-5 小时。
所述对诱导表达的目的蛋白进行纯化的方法优选为镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化。
本发明提供了一种携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区的融合 蛋白及其编码基因。本发明的融合蛋白是将牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋 白 NS3 优 势区的氨基 (N) 端连接折叠酶 DsbA 后得到的融合蛋白。所述 DsbA 去掉了信号肽， 同时将 DsbA 与氧化还原功能相关的两个半胱氨酸 (Cys) 突变成丝氨酸 (Ser)， 经过突变后的 DsbA 与牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区融合可实现 NS3 基因的胞内可溶性有 活性的高表达 ( 表达量大于 30％ )。本发明融合蛋白的表达方法中采用携带 T7 启动子和 DsbA 基因的 pET-DsbA 表达载体， 同时选用凝血酶切割位点作为牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区基因的插入位点， 且由于该基因的编码蛋白是非糖基化蛋白， 因而 表达的牛病毒性腹泻病毒 NS3 免疫优势蛋白具有很好的抗原性， 可用于牛病毒性腹泻病毒 的 ELISA 检测， 应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图说明 图 1 为牛病毒性腹泻病毒 NS3 蛋白免疫优势区基因的 RT-PCR 扩增结果
图 2 为克隆载体 pMD18-T-NS3 的 PCR 鉴定结果
图 3 为重组表达载体 pET-DsbA-NS3 的 PCR 鉴定结果
图 4 重组表达载体 pET-DsbA-NS3 的测序结果
图 5 为携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白表达产物的 12％ SDS-PAGE 电泳检测结果
图 6 为携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白表达上清经纯化 浓缩后的 12％ SDS-PAGE 电泳检测结果
图 7 为间接 ELISA 测定牛病毒性腹泻病毒抗体的结果
具体实施方式
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施， 给出了详细的实施方式和具体的 操作过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例 1、 携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白及其重组表 达
一、 携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白编码基因的扩增
1、 引物设计根据牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 的 mRNA 序列， 设计用于扩增牛病毒性腹泻 病毒非结构蛋白 NS3 优势区基因的上、 下游引物 P1 和 P2， 其中在上游引物 P1 中加入 BagII 酶切位点， 下游引物 P2 中加入 NheI 酶切位点， 具体的引物序列为 P1 ： AGATCTATGGTCAAGA AGATAACCAGCATGAAC( 带下划线的碱基序列为 BagII 酶切位点 )( 序列表中 SEQ ID No ： 3)， P2 ： GCTAGCCTCCCTAAAGGATTTCGTCACGTTG( 带下划线的碱基序列为 NheI 酶切位点 )( 序列表 中 SEQ ID No ： 4)。
2、 牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 免疫优势区基因的扩增
用反转录聚合酶反应 (RT-PCR) 的方法扩增牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 免 疫优势区基因， 具体方法包括以下步骤 ：
1) 将 MDBK 细胞 ( 牛肾细胞 ) 培养的病毒悬液反复冻融 3 次， 4 ℃、 8000r 离心 20min， 取上清， 分别加入终浓度为 10％和 3％的 PEG20000 和 NaCl， 4℃磁力搅拌过夜。 次日， 4℃、 8000r 离心 30min， 弃上清， 沉淀用 PBS 重悬。分别配置 30％、 35％、 40％、 45％的 CsCl 溶液， 制备 CsCl 浓度梯度， 加入病毒浓缩液后， 4℃、 22000r/min 离心 16h， 对浓缩的病毒液 进行纯化。
2) 取病毒浓缩液 10μl 加入 200μl PBS， 加入 400μl Trizol， 轻混 1min， 室温静 止 10min， 再加入 400μl 氯仿， 轻混 1min， 室温静止 10min， 于 4℃、 12000g 离心 15min， 吸取 上层液， 加入一倍体积以上的异丙醇， -30℃沉淀 30min， 于 4℃、 14000g 离心 10min， 用灭菌 9μl DEPC 水重悬沉淀。 3) 用反转录聚合酶反应 (RT-PCR) 得到牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 免疫 优势区基因的 cDNA， 反应体系为 ： 5×RT-PCR buffer 4μl， 下游引物 P22μl， 鼠源反转录 酶 1μl， DEPC 水 4μl， 42℃反转录 1h， 再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增， 反应体系为 ： cDNA 3μl， 2×PCR buffer 12.5μl， 上游引物 P1 1μl， 下游引物 P2 1μl， ddH2O 8.5μl， 反应 条件为 ： 94℃预变性 5min ； 94℃变性 45s， 55℃退火 45s， 72℃延伸 1min， 共 32 个循环 ； 最后 72℃延伸 10min， 4℃终止反应。
4) 将步骤 3) 经 PCR 扩增获得的 DNA 片段用北京天根公司的 DNA 片段纯化试剂盒 进行纯化， 具体步骤为 ： 将 DNA 扩增片段进行 0.8％琼脂糖凝胶电泳分离， 分离结果如图 1 所示 (M ： DL2000Marker ； a： 阴性对照 ； b： DsbA/BVDV NS3 基因的 RT-PCR 产物 )， 经 PCR 扩增 获得了约 1032bp 的目的片段， 与预期结果相符， EB 染色以后， 于长波紫外灯下切取含有该 目的片段的琼脂糖凝胶， 放入一无菌 1.5mL EP 管中， 加入 400μl 溶胶液， 于 50℃水浴 5min， 期间轻弹 EP 管， 凝胶完全溶化， 然后将溶化的液体转至一回收柱， 于室温静置 5min， 8000r/ min 离心 1min， 倒掉收集管中的废液， 用洗涤液洗涤两次， 最后 12000r/min 离心 1min， 回收 柱转至一干净无菌 1.5mL EP 管中， 加 10μl 洗脱液洗脱， 于室温放置 5min， 12000r/min 离 心 1min， 收集管中即为回收的 DNA 片段。洗脱后的 DNA 贮存于 4℃或 -20℃。
二、 携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白的重组表达
1、 克隆载体 pMD18-T-NS3 的构建
将步骤一纯化的目的基因与克隆载体 pMD18-T( 购自大连宝生物工程有限公 司 ) 连 接， 20μl 连 接 体 系 包 括 0.5μl pMD18-T 载 体、 4.5μl 目 的 基 因 纯 化 产 物 和 5μl Solution I， 16 ℃过夜。反应结束后， 将连接产物转化至 E.coli TOP10F 感受态细 胞中， 提取质粒 DNA 进行 PCR 鉴定， 结果如图 2 所示 (M ： DL2000Marker ； a： 阴性对照 ； b：
pMD18-T-NS3PCR 鉴定结果 )， 表明获得了携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区基 因的阳性克隆， 将该携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 优势区基因的重组克隆质粒命 名为 pMD 18-T-NS3。
2、 重组表达质粒 pET-DsbA-NS3 的构建与转化 BL21(Rosetta) 感受态菌
将 pMD18-T-NS3 质粒进行 BagII、 NheI 双酶切， 表达载体 pET-DsbA( 购自晶美生 物公司 ) 进行 BamHI、 NheI 双酶切， 再将两个载体的双酶切产物用 T4DNA 连接酶 16℃连接 过夜， 将连接产物转化大肠杆菌感受态菌 BL21(Rosetta)， 提取质粒 DNA， 以 P1、 P2 为引物 进行 PCR 扩增， 结果如图 3 所示 (M ： DL2000Marker ； a： pET-DsbA-NS3PCR 鉴定结果 ； b： 阴性 对照 )， 经扩增获得了 1032bp 的 DNA 片段， 与预期结果相符， 再挑选阳性克隆， 进行测序鉴 定， 测序结果如图 4 所示， 结果编码携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区 融合蛋白的基因 ( 命名为 DsbA/BVDV NS3) 具有序列表中 SEQ ID No ： 2 的 DNA 序列， 序列 表中的 SEQ ID No ： 2 由 1689 个碱基组成， 其编码序列为自 5’ 端第 1-1689 位碱基， 编码具 有序列表中 SEQ ID No ： 1 的氨基酸残基序列的蛋白质， 其中， 自 5’ 端第 1-645 位碱基编码 折叠酶 DsbA， 自 5’ 端第 652-1683 位碱基编码牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区。上述测序结果表明获得了插入序列及位置均正确的含有携带牛病毒性腹泻病毒 非结构蛋白 NS3 优势区的融合蛋白基因的重组表达载体， 命名为 pET-DsbA-NS3， 将携带有 pET-DsbA-NS3 的重组大肠杆菌工程菌命名为 BL21(Rosetta)/DsbA-NS3。 3、 携带牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区融合蛋白的诱导表达
挑取单个克隆的重组大肠杆菌工程菌 BL21(Rosetta)/DsbA-NS3， 接种于 3mL 含有 氨苄青霉素 (100mg/L) 的 LB 培养基， 37℃振摇培养过夜， 次日按 1％的比例扩大培养， 37℃ 振摇培养 2h 后 ( 吸光光度为 0.6-0.8)， 加入 IPTG( 终浓度为 1.0mmol/L)、 葡萄糖 ( 终浓度 为 0.2％ )， 继续于 30℃振摇培养诱导 4h-6h， 收集菌体。
4、 SDS-PAGE 蛋白电泳检测
用 12％ SDS-PAGE 凝胶分离步骤 3 重组表达的蛋白， 浓缩胶浓度为 5％， 分离胶浓 度为 12％， 结果如图 5 所示 (a， b， c， d， e 分别为 pET-DsbA-NS3 诱导 5h， 4h， 3h， 2h， 1h 产物 ； f 为空载体诱导 3h ； M 为蛋白质相对分子量标准 ： 250kDa， 150kDa， 100kDa， 80kDa， 60kDa， 50kDa， 40kDa， 30kDa， 25kDa， 20kDa， 15kDa， 10kDa)， 经表达获得了 62.9kDa 的重组蛋白， 与 预期结果相符， 表明牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 非结构蛋白 NS3 优势区融合蛋白已获得表 达。
5、 表达产物的分离纯化
取诱导菌液 200mL 收集菌体， 用 50mmol/L pH7.4 的 PBS 缓冲液约 5mL 悬浮菌体， 超声法破碎菌体， 超声条件为 ： 功率 200W， 超声 3s、 停 2s 为一个循环， 共 180 个循环超声破 碎， 超声液离心 12000r/min 15min， 取上清， 用针对 His 标签的镍琼脂糖凝胶柱纯化， 具体 操作为 ： 将样品加入经缓冲液 (0.5mol/L NaH2PO419mL， 0.5mol/LNa2HPO481mL， NaCl 29.3g， pH7.4) 洗涤的亲和层析柱， 用含 100mmol/L 咪唑的缓冲液进行阶段洗脱， 纯化后的蛋白装 入透析袋， 于透析液 (pH7.4PBS) 中， 4 ℃透析 20h。对纯化蛋白进行 12 ％ SDS-PAGE 凝胶 分； 离蛋白质， 结果如图 6 所示 (a 为 pET-DsbA-NS3 诱导产物纯化后 ； b 为 pET-DsbA-NS3 诱 导产物纯化前 ； M 为蛋白质相对分子量标准 ： 250kDa， 150kDa， 100kDa， 80kDa， 60kDa， 50kDa， 40kDa， 30kDa， 25kDa， 20kDa， 15kDa， 10kDa)， 表明牛病毒性腹泻病毒 NS3 蛋白免疫优势区融
合蛋白已得到纯化。
实施例 2、 间接 ELISA 法检测牛病毒性腹泻病毒抗体
1、 间接 ELISA 最佳反应条件的选择
BVDV 抗原最佳包被浓度与阴阳血清最佳稀释度的选择 ( 采用方阵试验进行工 作浓度的筛选 ) ： 取纯化的实施例 1 得到的重组 NS3 融合蛋白， 用包被液 (0.05mol/L 碳 酸 钠 - 碳 酸 氢 钠 缓 冲 液， pH9.6) 稀 释 为 8μg/mL、 4μg/mL、 2μg/mL、 1μg/mL， 加入酶标 板， 100μL/ 孔， 每个浓度作一行， 4℃过夜， 取出用 PBST(NaCl 8.0g， KH2PO4 0.2g， Na2HPO4 1.15g， KCl 0.2g， Tween-20 0.5mL， 加去离子水至 1000mL， 调 pH 至 7.4) 洗涤 3 次 ； 然后每 孔加入 250μL 封闭液 (PBST+1％明胶 )， 37℃封闭 2h， PBST 洗涤 3 次 ； 用 PBST 将牛阳性血 清和阴性血清 ( 标准阳性血清和标准阴性血清 ) 分别作 1 ∶ 20、 1 ∶ 40、 1 ∶ 80、 1 ∶ 160、 1 ∶ 320 稀释， 加入酶标板中， 每个稀释度作一列， 以 PBST 为空白对照， 100μL/ 孔于 37℃反 应 1h， 洗涤 3 次 ； 加入 1 ∶ 1000 兔抗牛 IgG-HRP( 北京经纬博恒生物科技开发有限责任公 司 )100μL/ 孔， 37℃反应 1h， 经洗涤后加入 TMB 底物 100μL， 室温避光作用 10-15min， 加 入 50μL 2mol/L H2SO4 终止反应， 测定 OD450nm。以阳性血清孔的 OD 值接近 1.0， P/N ≥ 2.1 的抗原、 血清最大稀释度作为抗原及待测血清的最适工作浓度。实验确定包被抗原浓度为 2μg/mL)， 血清抗体最佳稀释度为 1 ∶ 40。
2、 间接 ELISA 法测定牛病毒性腹泻病毒血清抗体
以方阵滴定所确定的抗原包被浓度 (2μg/mL) 作为包被抗原工作浓度， 对收集的 6 份牛血清样品 ( 经牛病毒性腹泻病毒抗体检测试剂盒 (INGEZIM 公司产品 ) 检测为阳性 ) 进行抗体检测， 同时设空白对照孔 (PBST) 和阴性对照孔 ( 标准阴性血清 )。
具体操作 ： 取纯化的实施例 1 得到的重组 NS3 融合蛋白， 以 2μg/mL 包被酶标板， 将 1 ∶ 40 稀释的牛血清样品和阴性对照血清加入酶标板中， 100μL/ 孔， 于 37℃反应 1h， 洗 涤后加入 1 ∶ 1000 兔抗牛 IgG-HRP( 北京经纬博恒生物科技开发有限责任公司 )， 100μL/ 孔， 37℃反应 1h， 洗涤后加入 TMB 底物 100μL， 室温避光作用 10-15min， 加入 50μL2mol/L H2SO4 终止反应， 测定 OD450nm。
结果如图 7 所示 (1-6 为 6 份血清 )， 表明重组 NS3 蛋白能与牛抗血清产生阳性反 应， 克用于检测牛病毒性腹泻病毒血清抗体中。10CN 102517260 A
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