对于人Β1肾上腺素受体（Β1AR）的结合化合物以及它们在测量自身抗Β1AR抗体中的应用.pdf

本发明涉及结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的结合化合物/抗体，上述受体产生自/可获自具有选自由以下组成的组中的保藏号的宿主细胞/杂交瘤：DSM ACC3121、DSM ACC3174、DSM ACC3175、DSM ACC3176和DSM ACC3177。结合化合物/抗体特别适用于在基于体外细胞的测定系统中确定自身抗β1-AR抗体，以表征和确定针对生物样品中的β1-AR-ECII的自身抗体。本发明的进一步的方面是编码所述结合化合物/抗体的核酸分子、载体、宿主细胞、用于生产本发明的结合化合物/抗体的方法、以及包括本发明的结合化合物/抗体的试剂盒。

权利要求书
1.  一种抗体，所述抗体结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环。

2.  根据权利要求1所述的抗体，其中，所述人β1-肾上腺素受体的第二胞外环是或包含在SEQ ID NO:17中描述的氨基酸序列。

3.  根据权利要求1或2所述的抗体，其中，所述抗体可获自具有选自由以下组成的组中的保藏号的宿主细胞：DSM ACC3121、DSM ACC3174、DSM ACC3175、DSM ACC3176和DSM ACC3177。

4.  根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中，所述抗体可获自
（i）具有所述保藏号DSM ACC3121的宿主细胞并且其中所述抗体包含至少一个抗体轻链可变区以及至少一个抗体重链可变区，所述抗体轻链可变区分别具有SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:12的CDR序列CDRL1至CDRL3；所述抗体重链可变区分别具有SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:9的CDR序列CDRH1至CDRH3；
（ii）具有所述保藏号DSM ACC3174的宿主细胞并且其中所述抗体包含至少一个抗体轻链可变区以及至少一个抗体重链可变区，所述抗体轻链可变区分别具有SEQ ID NO:34至SEQ ID NO:36的CDR序列CDRL1至CDRL3；所述抗体重链可变区分别具有SEQ ID NO:37至SEQ ID NO:39的CDR序列CDRH1至CDRH3；
（iii）具有所述保藏号DSM ACC3175的宿主细胞并且其中所述抗体包含至少一个抗体轻链可变区以及至少一个抗体重链可变区，所述抗体轻链可变区分别具有SEQ ID NO:44至SEQ ID NO:46的CDR序列CDRL1至CDRL3；所述抗体重链可变区分别具有SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:49的CDR序列CDRH1至CDRH3；
（iv）具有所述保藏号DSM ACC3176的宿主细胞并且其中所述抗体包含至少一个抗体轻链可变区以及至少一个抗体重链可变区，所述抗体轻链可变区分别具有SEQ ID NO:54至SEQ ID NO:56的CDR序列CDRL1至CDRL3；所述抗体重链可变区分别具有SEQ ID NO:57至SEQ ID NO:59的CDR序列CDRH1至CDRH3；或
（v）具有所述保藏号DSM ACC3177的宿主细胞并且其中所述抗体包含至少一个抗体轻链可变区以及至少一个抗体重链可变区，所述抗体轻链可变区分别具有SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:66的CDR序列CDRL1至CDRL3；所述抗体重链可变区分别具有SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:69的CDR序列CDRH1至CDRH3。

5.  根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中，所述抗体可获自
（i）具有所述保藏号DSM ACC3121的宿主细胞并且其中所述抗体包含轻链可变区以及重链可变区，所述轻链可变区包含具有上达至十个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:6的序列，所述重链可变区包含具有上达至十个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:4的序列；
（ii）具有所述保藏号DSM ACC3174的宿主细胞并且其中所述抗体包含轻链可变区以及重链可变区，所述轻链可变区包含具有上达至十个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:31的序列，所述重链可变区包含具有上达至十个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:33的序列；
（iii）具有所述保藏号DSM ACC3175的宿主细胞并且其中所述抗体包含轻链可变区以及重链可变区，所述轻链可变区包含具有上达至十个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:41的序列，所述重链可变区包含具有上达至十个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:43的序列；
（iv）具有所述保藏号DSM ACC3176的宿主细胞以及其中所述抗体包含轻链可变区以及重链可变区，所述轻链可变区包含具有上达至十个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:51的序列，所述重链可变 区包含具有上达至十个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:53的序列；或
（v）具有所述保藏号DSM ACC3177的宿主细胞并且其中所述抗体包含轻链可变区以及重链可变区，所述轻链可变区包含具有上达至十个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:61的序列，所述重链可变区包含具有上达至十个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:63的序列。

6.  根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体可获自
（i）具有所述保藏号DSM ACC3121的宿主细胞并且其中所述抗体包含轻链可变区以及重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:6，所述重链可变区包含SEQ ID NO:4；
（ii）具有所述保藏号DSM ACC3174的宿主细胞并且其中所述抗体包含轻链可变区以及重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:31，所述重链可变区包含SEQ ID NO:33；
（iii）具有所述保藏号DSM ACC3175的宿主细胞并且其中所述抗体包含轻链可变区以及重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:41，所述重链可变区包含SEQ ID NO:43；
（iv）具有所述保藏号DSM ACC3176的宿主细胞并且其中所述抗体包含轻链可变区以及重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:51，所述重链可变区包含SEQ ID NO:53；或
（v）具有所述保藏号DSM ACC3177的宿主细胞并且其中所述抗体包含轻链可变区以及重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:61，所述重链可变区包含SEQ ID NO:63。

7.  一种抗体，所述抗体结合至与根据权利要求1至6中任一项所述的抗体相同的表位。

8.  根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或全人源抗体。

9.  根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

10.  根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中，所述抗体是人单克隆抗体、小鼠单克隆抗体或大鼠单克隆抗体。

11.  根据权利要求1至10中任一项所述的抗体，其中，所述抗体可获自具有选自由以下组成的组中的保藏号的宿主细胞：DSM ACC3121、DSM ACC3175、DSM ACC3176和DSM ACC3177，并且其中所述抗体是小鼠单克隆抗体。

12.  根据权利要求1至10中任一项所述的抗体，其中，所述抗体可获自具有所述保藏号DSM ACC3174的宿主细胞并且其中所述抗体是大鼠单克隆抗体。

13.  根据权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中，所述抗体可获自具有所述保藏号DSM ACC3121的宿主细胞并且其中所述抗体进一步包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包含γ1、γ2a、γ2b或γ3小鼠重链恒定区或它们的变异体。

14.  根据权利要求1至11中任一项或权利要求13所述的抗体，其中，所述抗体可获自具有所述保藏号DSM ACC3121的宿主细胞并且其中所述抗体进一步包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区包含κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。

15.  根据权利要求1至14中任一项所述的抗体，其中，所述抗体是选自由以下组成的组中的抗体片段：Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab')2和双体分子。

16.  根据权利要求1至15中任一项所述的抗体，其中，所述抗体可获自具有所述保藏号DSM ACC3121的宿主细胞并且其中所述抗体具有以下性质中的至少一种：
（a）所述抗体以1000pM或更小的平衡解离常数（Kd）结合至所述人β1-肾上腺素受体的第二胞外环；
（b）在肽环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln)存在的条件下，与所述人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的结合亲和力被竞争性抑制，具有2000pM或更小的IC50值；和/或
（c）与大鼠单克隆抗体相比，优选地与可获自具有所述保藏号DSM ACC3174的宿主细胞的大鼠单克隆抗体相比，或与结合至所述人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的山羊多克隆抗体相比，以至少低10倍的亲和力（Kd）结合至所述人β1-肾上腺素受体的第二胞外环。

17.  根据权利要求16所述的抗体，其中，所述抗体可获自具有所述保藏号DSM ACC3121的宿主细胞并且其中所述抗体以510pM或更小的平衡解离常数（Kd）结合至所述人β1-肾上腺素受体的第二胞外环。

18.  一种核酸分子，编码根据权利要求1至17中任一项所述的抗体。

19.  一种载体，包含根据权利要求18所述的核酸。

20.  一种宿主细胞，包含根据权利要求18所述的核酸分子或根据权利要求19所述的载体。

21.  根据权利要求20所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是一种杂交瘤。

22.  根据权利要求21所述的宿主细胞，其中，所述杂交瘤选自由DSM ACC3121、DSM ACC3174、DSM ACC3175、DSM ACC3176和DSM ACC3177组成的组。

23.  一种用于产生根据权利要求1至17中任一项所述的抗体的方法，其中，所述方法包括培养根据权利要求20至22中任一项所述的宿主细胞以及从所述培养物中回收所述分子。

24.  一种抗体，所述抗体结合至所述人β1-肾上腺素受体的第二胞外环，优选结合至在SEQ ID NO:17中描述的所述人β1-肾上腺素受体的胞外环，其中，所述抗体可获自根据权利要求23所述的方法。

25.  一种用于确定具有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法，包括以下步骤：
（a）使人β1-肾上腺素受体与所述患者的生物样品接触，从而容许包含在所述生物样品中的一种或多种分子或化合物结合至所述人β1-肾上腺素受体；
（b）使（a）的所述人β1-肾上腺素受体与根据权利要求1至17中任一项所述的抗体接触，从而容许所述抗体结合至未被包含在（a）的所述生物样品中的一种或多种分子或化合物结合的人β1-肾上腺素受体；
（c）使未与（a）的所述生物样品接触的人β1-肾上腺素受体与根据权利要求1至17中任一项所述的抗体接触，从而容许所述抗体结合至未与（a）的所述生物样品接触的所述人β1-肾上腺素受体；
（d）测量
（i）步骤（b）的所述人β1-肾上腺素受体和所述抗体之间的结合信号，和
（ii）步骤（c）的所述人β1-肾上腺素受体和所述抗体之间的结合信号；并且
（e）比较在（d）（i）中测得的所述结合信号与在（d）（ii）中测得的所述结合信号，
其中在（d）（i）中测得的结合信号至少40%低于在（d）（ii）中测得的结合信号，表明所述患者患有所述疾病或有发展所述疾病的风险。

26.  根据权利要求25所述的方法，其中，所述抗体是可获自具有选自由组成的组中的保藏号的宿主细胞的抗体：DSM ACC3121、DSM ACC3174、DSM ACC3175、DSM ACC3176和DSM ACC3177。

27.  根据权利要求25或26所述的方法，其中，所述抗体是可获自具有所述保藏号DSM ACC3121的宿主细胞的抗体。

28.  根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中，在与生物样品或所述抗体接触前，将所述人β1-肾上腺素受体固定在固相上。

29.  根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其中，所述固相的材料选自由以下组成的组中：聚L-赖氨酸、聚D-赖氨酸预涂覆的琼脂糖凝胶、胶乳、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯、硝化纤维素和硅。

30.  根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中，所述疾病选自由心脏病组成的组中，包括特发性扩张型心肌病（DCM）、缺血性心肌病（ICM）、查加斯病、感染性和非感染性心脏病、缺血性和非缺血性心脏病、炎性心脏病和心肌炎、心脏扩张、特发性心肌病、免疫性心肌病、心脏衰竭、以及任何心律失常，包括室性和室上性过早搏动。

31.  根据权利要求30所述的方法，其中，所述疾病是特发性扩张型心肌病（DCM）。

32.  根据权利要求30所述的方法，其中，所述疾病是缺血性心肌病（ICM）。

33.  根据权利要求25至32中任一项所述的方法，其中，所述测得的结合信号包括标记根据权利要求1至17中任一项所述的抗体。

34.  根据权利要求33所述的方法，其中，所述结合化合物的所述标记包括发射信号的系统或者所述标记由包含发射信号的系统的一种或多种另外的第二分子或化合物所特异性地识别。

35.  根据权利要求34所述的方法，其中，所述发射信号的系统包含发射该信号的酶。

36.  根据权利要求34或35所述的方法，其中，所述一种或多种第二分子或化合物选自由肽、多肽、低分子量物质、抗体或它们的片段或衍生物组成的组中。

37.  根据权利要求25至36中任一项所述的方法，其中，所述方法是ELISA、EIA或RIA。

38.  一种诊断药剂，包含根据权利要求1至17中任一项所述的抗体，用于检测生物样品中的一种或多种分子或化合物。

39.  根据权利要求38所述的诊断药剂，其中，所述抗体获自具有保藏号DSM ACC3121的宿主细胞。

40.  根据权利要求25至37中任一项所述的方法或根据权利要求38或39所述的诊断药剂，其中，所述生物样品包括血液、血浆或血清。

41.  根据权利要求40所述的方法或诊断药剂，其中，所述生物样品包含一种或多种分子或化合物，所述分子或化合物选自由抗体、蛋白质、蛋白质片段、肽、氨基酸和/或它们的衍生物组成的组中。

42.  根据权利要求41所述的方法或诊断药剂，其中，所述一种或多种分子或化合物是抗体。

43.  根据权利要求42所述的方法或诊断药剂，其中，所述抗体是一种或多种自身抗β1-肾上腺素能抗体。

44.  一种用于检测自身抗β1-肾上腺素能受体抗体的诊断试剂盒，包括根据权利要求1至17中任一项所述的抗体、根据权利要求20至22中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求38至43中任一项所述的诊断药剂。

说明书对于人β1-肾上腺素受体(β1-AR)的结合化合物以及它们在测量自身抗β1-AR抗体中的应用
本发明涉及结合化合物，其结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）（extracellular loop），并且本发明具体涉及结合化合物/抗体，其产生自和/或可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞/杂交瘤。本发明还涉及结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的抗体，其产生自/可获自保藏号为选自由DSM ACC3174、DSM ACC3175、DSM ACC3176和DSM ACC3177组成的组中的宿主细胞杂交瘤。本发明的结合化合物/抗体特别适用于在体外测定中测定自身抗β1-AR抗体以在细胞ELISA测定中表征和确定针对生物样品中的β1-AR-ECII的自身抗体，上述细胞ELISA测定是基于在SF9细胞中由杆状病毒过表达人β1-肾上腺素受体（β1-AR）。此外，在本发明中描述了编码所述结合化合物/抗体的核酸分子以及包含上述核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还提供了用于生产本发明的结合化合物/抗体的方法。另外，描述了一种用于确定患有与人β1-肾上腺素受体（β1-AR）相关疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体（β1-AR）相关疾病的风险的患者的方法，所述疾病如特发性扩张型心肌病（DCM）或缺血性心肌病（ICM）。本发明还涉及诊断装置、方法和应用，利用本发明的结合化合物/抗体来检测在生物样品中的分子/化合物，如自身抗β1AR（β1-肾上腺素受体/β1-肾上腺素能受体）抗体。最后，描述了包括本发明的化合物的试剂盒。
病因不明的进行性心脏扩张和泵衰竭（心力衰竭，pump failure）已被称为"特发性"扩张型心肌病（DCM）（Richardson,Circulation93(1996),841-842）。DCM是严重心脏衰竭的主要原因之一，具有上达至每百万人100位患者的年发病率以及每百万人300-400位患者的患病率（AHA报告2007）。目前，大部分的DCM被认为是由最初（主要是病毒性）感染引起，这导致急性心肌炎，其在免疫系统激活以后可以进展到（慢性）自身免疫性心肌炎，从而导致心脏扩张和严重的充血性心脏衰竭。尤其是当（a） 伴随针对不同的肌细胞肌纤维膜或膜蛋白（其对于心脏功能是必不可少的）的自身抗体的发展（Freedman,J.Clin.Invest.113(2004),1379-1382;Jahns,Trends Cardiovasc Med16(2006),20-24），或（b）伴随心肌的慢性炎症和病毒持续感染（Kiihl,Circulation112(2005),1965-1970）时，会发生严重的充血性心脏衰竭。这些发现进一步得到以下事实的加强，即，患有DCM的患者在细胞免疫和体液免疫方面经常具有改变（Jahns,Trends Cardiovasc Med16(2006),20-24,Limas Circulation95(1997),1979-1980,Luppi,Circulation98(1998),777-785,Mahrholdt,Circulation114(2006),1581-1590）。在他们的体液反应的情况下，已发现，相当多的DCM患者发展针对各种心脏抗原的自身抗体。其中，仅有一个亚组的针对（人）β1-肾上腺素受体/β1-肾上腺素能受体（β1-AR）的第二胞外环的自身抗体已经显示出对于人β肾上腺素受体施加激动剂样（agonist-like）作用，从而发展为心脏扩张和功能障碍。
因此，已经从基于动物和患者的研究中积累了证据：即，靶向（人）β1-肾上腺素受体（β1-AR）的功能活性的自身抗体在进行性心脏扩张和衰竭的发展和临床病程中发挥重要作用（Wallukat,Eur.Heart J.12（1991）,178-181;Magnusson,Circulation89(1994),2760-2767;Jahns,Circulation99(1999),649-654和Iwata,J.Am.Coll.Cardiol.37(2001),418-424）。β1-肾上腺素受体（β1-AR）是G蛋白偶联的受体，其通过腺苷酸环化酶、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和PKA来引发信号。此信号通路调节肌浆钙浓度并增加心肌细胞收缩力。
在最近几年，已经由不同研究小组独立地证明，相关类别的自身抗体结合至β1-AR的第二环并识别天然受体构象（Jahns Circulation99(1999),649-654;Iwata J Am Coll Cardiol37(2001),418-424;Nikolaev J Am Coll Cardiol50(2007),423-443和Elies J Immunol.157(1996),4203-4211）。已表明这类构象抗β1AR-(ECII)抗体是功能活性的，并且似乎能够刺激细胞内cAMP产生（Jahns,Circulation99(1999),649-654和Nikolaev,Am Coll Cardiol50(2007),423-443）。此外，仅仅那些靶向第二胞外环（β1-AR-ECII）的抗β1AR自身抗体似乎是功能活性的。相反，针对受体蛋白的氨基或羧基末端的抗体并不发挥生物学作用（Wallukat,Eur Heart J12（1991）,178-181;Elies,J Immunol.157（1996）,4203-4211和Borda,Clin Exp Immunol.57（1984）,679-686）。
关于抗人β1-肾上腺素受体（β1-AR）的第二胞外环的功能活性的自身抗体，已证明在健康个体中它们的流行度（传播）几乎可以忽略不计（<1%），条件是，使用基于以其天然构象呈现靶标（即，（人）β1-AR）的细胞系统的筛选程序（Jahns,Circulation99(1999),649-654）。通过采用这种筛选方法，还可以在患有慢性瓣膜性心脏病或高血压性心脏病的患者中排除自身抗β1-AR抗体的出现（Jahns,J.Am.Coll.Cardiol34(1999),1545-1551）。相反，针对β1-AR的第二胞外环的自身抗体是众所周知的，并且取决于相应的研究或筛选方法，存在于大约30%-50%的DCM患者中。较小百分比的患有缺血性心肌病的患者，大约10%-20%，被判断为是抗β1-AR抗体阳性的（Stork,Am.Heart J.152(2006),697-704）。这还得到来自Jahns等的先前数据的证实，从而呈现直接证据：即，β1-AR自身抗体在DCM中发挥因果作用并且不仅仅关联于心肌组织损伤或是心肌组织损伤的结果（Jahns,J.Clin.Invest.113(2004),1419-1429）。
因此，除去针对人β1-AR的第二胞外环的自身抗体预期将会在DCM患者中产生改善的临床状态。患有DCM的患者的初期临床试验显示在用IgG免疫吸附（IA）治疗后，不仅心脏自身抗体滴度被降低，而且左心室功能得到改善（Felix.,Am Coll Cardiol35(2000),1590-1598;Wallukat,N.Engl.J.Med.347(2002),180;Muller,N Engl J Med347(2002),1806和Muller,Circulation101(2000),385-391）。降低心脏自身抗体的另一种方法是使用基于肽的疫苗以实现抗原特异性耐受和降低过度活跃的免疫系统的响应。例如，在WO01/21660中，公开了若干与β1-AR的第二胞外环同源的（环）肽，并且提出将这些肽应用于扩张型心肌病（DCM）的医疗干预。此外，例如WO01/21660提到，可以修饰这些肽以保护它们免受血清蛋白酶的作用，例如，通过环化作用。
两种治疗策略均需要用于筛查自身抗β1-AR抗体并因此可靠地确定阳性心脏衰竭患者（优选患有DCM）的可靠的诊断测定。在过去，进行了大量的努力来开发这样的测定。可以将这些方法分成两类：
-研究抗体激活人β1肾上腺素受体（β1-AR）的功能能力的测定
-分析针对人β1肾上腺素受体的第二胞外环（人β1-AR的ECII环）的自身抗体的结合特性的测定。
建立功能测定，即对新生大鼠心肌细胞或鸡胚胎的收缩效果和受体介导的信号cAMP水平，并适用于检测功能抗β1-AR抗体（Nikolaev,Am.Coll.Cardiol.50(2007),423-443;Wallukat,Mol Cell Cardiol.27(1995),397-406,Erratum in:J Mol Cell Cardiol27(1995),2529;Baba,Ther Apher Dial.12(2008),109-116;Tutor,Cardiovasc Res76(2007),51-60）。通过程序来表征所有这些功能测定，其耗费时间和成本，并且不能合理地用来快速地筛查较大的患者群体（n>1000）。
还通过利用基于肽的ELISA研究了人自身抗β1-AR-抗体的结合。为此，将26聚体肽（His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg（SEQ ID NO:17）），其对应于人β1-AR的第二胞外环（氨基酸位置197-222），固定于微量滴定板上（Magnusson,J Clin Invest86(1990),1658-1663和Labovsky Clin Exp Immunol148(2007),440-149）。这种测定是充分HTS（高通量筛查）适合的，但还没有同时在较大群体的患者和健康对照中研究它用作具有诊断相关性的筛查测定。
在本研究中，对于针对人β1-AR的自身抗体的存在，利用结合测定特别是使用全天然的人β1-AR基于细胞的竞争性ELISA测定亦或使用人β1-AR ECII相应肽（参照上面提到的26聚体肽His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-P he-Val-Thr-Asn-Arg（SEQ ID NO:17）作为各自的结合靶的测定来检查患有心脏衰竭特别是DCM患者。
鉴于现有技术，构成本发明的基础的技术问题是提供用于诊断和预测与人β1-肾上腺素受体（β1-AR）相关的疾病的改进的装置和方法。
通过提供在权利要求中表征的实施方式来解决上述技术问题。
本发明涉及抗体/结合化合物，其结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR）的第二胞外环。本发明的抗体结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环，其是或包含如在SEQ ID NO:17中描述的氨基酸序列。抗体/结合化合物可获自宿主细胞，例如杂交瘤，其具有选自由DSM ACC3121、DSM ACC3174、DSM ACC3175、DSM ACC3176和DSM ACC3177组成的组中的保藏号。这些是本发明的特别优选的结合化合物/抗体。在若干手段和方法中如本文提供的诊断方法中采用这些结合化合物/抗体。
本发明还涉及建立用于检测如上文所描述的功能活性的人抗β1-AR自身抗体的基于细胞的竞争性ELISA。此测定使用完全天然β1-AR蛋白作为靶抗原来提供胞外域的正确折叠，其是确定表位特异性自身抗体的基本要求。为了优化测定的特异性，使用结合至人β1-AR的第二胞外环并且能够刺激受体活性的抗体/结合化合物开发了竞争性方法。
通过它们结合至相同或重叠表位并替换测试结合分子/抗体并因此降低免疫或生物学信号如ELISA信号的能力表征来自患者血清的功能相关的人抗β1-AR自身抗体。通过丙氨酸置换扫描进行的表位搜索已经产生了提示：在β1-AR的EC II环内，氨基酸序列NDPK（Asn-Asp-Pro-Lys）应该是相关表位的一部分。
因此，本发明涉及具有一种或多种所期望的性能（包括高结合亲和力）的结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的抗体。在本文和在诊断方法中描述的抗体结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环，其中人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的所述第二胞外环是或包含如在SEQ ID NO:17中描述的氨基酸序列。本文描述的抗β1-AR-ECII抗体产生自/可获自宿主细胞，例如具有选自由DSM ACC3121、DSM ACC3174、DSM ACC3176和DSM ACC3177组成的组中的保藏号的杂交瘤。本发明还涉及在用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法中使用本发明的抗体。如在本发明中已惊奇发现的，和多克隆（对照）抗体相比，产生自/可获自具有DSM ACC3121保藏号的杂交瘤细胞系23-6-7（于2011年3月15日由Corimmun GmbH以识别标记（identification reference）"blECII E3,23-6-7（抗β1-AR）"保藏）的结合化合物/抗体或所述结合化合物/抗体的衍生物表现出对β1-肾上腺素受体的提高的亲和力。此外，本发明涉及（i）小鼠单克隆抗体或所述抗体的衍生物，产生自/可获自杂交瘤细胞系28-2-7（于2012年5月16日由Corimmun GmbH以识别标记"blECII,28-2-7"和保藏号DSM ACC3175保藏）、47-12-9（于2012年5月16日由Corimmun GmbH以识别标记"blECII,47-12-9"和保藏号DSM ACC3176保藏）、50-1-5（于2012年5月16日由Corimmun GmbH以识别标记"blECII,50-1-5"和保藏号DSM ACC3177保藏）和55-4-10；以及（ii）大鼠单克隆抗体13F6（于2012年5月16日由Corimmun GmbH以识别标记"13/F6"和保藏号DSM ACC3174保藏；或（iii）山羊多克隆抗 体（参见随附实施例的图3至图5）。在随附的实施例中还示出并说明了，与山羊多克隆（对照）抗体相比，大鼠单克隆抗体13F6的特征还在于对β1-肾上腺素受体（β1-AR）的显著提高的亲和力（图5）。鉴于对β1-AR的这种提高的亲和力，还可以使用单克隆大鼠13F6抗体（其可获自宿主细胞，例如杂交瘤，如以DSM ACC3174保藏的）和13F6的衍生物，例如，在用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病的风险的患者的诊断方法中作为阳性对照（PC）（如下文所描述）。
如在本文中所使用的，术语"β1-肾上腺素受体（β1-AR）"优选指人β1-肾上腺素受体，其通常是本领域技术人员已知的。例如，可以自技术人员已知的数据库获得人β1-肾上腺素能受体的编码序列。例如，如在本文中所使用的，人β1-AR（还被称为人β1肾上腺素受体（ADRBl））的序列（SEQ ID NO:1和2）可以获自数据库条目NM_000684（版本NM_000684.2；GI:110349783）和/或NP_000675（版本号NP_000675.1；GI:4557265）。
在本发明的情况下，人β1-肾上腺素受体的核酸序列包含以下（cDNA）序列（参照SEQ ID NO:1）：


以下示出人β1-肾上腺素受体的氨基酸序列（参照SEQ ID NO:2）：

人β1-肾上腺素受体是指具有在SEQ ID NO:2中描述的氨基酸序列的氨基酸位置59-83、96-120、133-152、177-196、223-243、327-346和359-378内的7个跨膜区的受体。人β1-肾上腺素受体的第二胞外环区位于在SEQ ID NO:2中描述的氨基酸序列的氨基酸位置197-222内（指氨基酸序列His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-L ys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg；SEQ ID NO:17）。
此外，如在随附的实施例中详细说明和举例说明的，产生自/可获自宿主细胞，例如杂交瘤，保藏号为DSM ACC3121（参照宿主细胞，例如杂交瘤，识别标记为"blECII E3，23-6-7（抗β1-AR）"）的本发明的抗体或其衍生物，可以在用于确定患有特发性扩张型心肌病（DCM）或有发展特发性扩张型心肌病（DCM）的风险的患者的方法中使用，因为它可以通过识别针对人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的自身抗体加以检测。本 发明还涉及产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤（参照杂交瘤细胞系，识别标记为"blECII E3，23-6-7（抗β1-AR）"）的抗体或其衍生物，以及它在用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病的风险的患者的方法中的应用。本发明还涉及产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤（参照识别标记为"blECII，28-2-7"的杂交瘤细胞系28-2-7）的抗体或其衍生物，以及它在用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病的风险的患者的方法中的应用。本发明还涉及产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤（参照识别标记为"blECII，47-12-9"的杂交瘤细胞系47-12-9）的抗体或其衍生物，以及它在用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法中的应用。本发明还涉及产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤（参照识别标记为"blECII，50-1-5"的杂交瘤细胞系50-1-5）的抗体或其衍生物，以及它在用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法中的应用。本发明还涉及产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤（参照识别标记为"13/F6"的杂交瘤细胞系）的抗体或其衍生物，以及它在用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法中的用途。
在所公开和描述性术语的情况下，可以理解的是术语"产生自"和"可获自"并不仅仅涉及特定的单克隆抗体，而且还涉及所述保藏的抗体的衍生物和变异体。上述衍生物和变异体具有保藏的单克隆抗体的至少部分的CDR序列。衍生物和变异体包括但不限于CDR接枝的、人源化的抗体、Fab、Fab'、Fab'-SH、FV、scFV、F(ab')2和双体分子。
如在本文中所使用的，术语抗体/结合分子（亲代抗体/结合分子）的"抗体片段"或"结合片段"包括抗体/结合分子的片段或衍生物，通常包括亲代抗体的抗原结合或可变区（例如，一个或多个CDR）的至少一部分，其保留亲代抗体的至少一些结合特异性。特别地，在本文中亲代抗体/结合分子是指结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR）的第二胞外环的抗体，上述抗体产生自/可获自宿主细胞，例如具有选自由DSM ACC3121、DSM ACC3174、DSM ACC3176和DSM ACC3177组成的组中的保藏号的杂交 瘤。抗体结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体分子；线性抗体；单链抗体分子，例如，sc-Fv；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。通常，当基于摩尔来表达活性时，结合片段或衍生物保留至少10%的对人β1-肾上腺素受体（β1-AR）的第二胞外环的结合活性。优选地，和亲代抗体特别是保藏的单克隆抗体相比，结合片段或衍生物保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更高的对人β1-肾上腺素受体（β1-AR）的第二胞外环的结合亲和力结合活性。还预期的是，结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR）的第二胞外环的结合片段可以包括抗体的保守氨基酸替代物（被称为"保守变异体"），其基本上不改变它的生物学活性。
通常，本发明的结合化合物是结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的抗体。特别地，本发明的结合化合物是结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的抗体，上述抗体包含或由VH结构域（重链可变区）和VL结构域（轻链可变区）组成，其与SEQ ID NO:4和6（如果参照重链和轻链可变区的相应的核酸序列，则与SEQ ID NO:3和5）的序列具有至少95%、90%、85%、75%、70%、65%、60%、55%或50%序列同源性。此外，本发明的结合化合物包含VH结构和VL结构域的抗体，参照SEQ ID NO:4和6的序列，其具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多保守氨基酸替代。此外，本发明的结合化合物是抗体或其结合片段，例如，选自由Fab、Fab'、Fab'-SH、FV、scFV、F(ab')2和双体分子组成的组中的抗体片段。
本发明还涉及结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的抗体，上述抗体包含或由VH结构域（重链可变区）和VL结构域（轻链可变区）组成，其与SEQ ID NO:33和31（如果参照重链和轻链可变区的相应的核酸序列，则与SEQ ID NO:32和30）的序列具有至少95%、90%、85%、75%、70%、65%、60%、55%或50%序列同源性。此外，本发明的结合化合物是包含VH结构域或VL结构域的抗体，参照SEQ ID NO:33和31的序列，其具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多保守氨基酸替代。此外，本发明的结合化合物是抗体或其结合片段，例如，选自由Fab、Fab'、Fab'-SH、FV、scFV、F(ab')2和双体分子组成的组中的抗体片段。
本发明还涉及结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的抗体，上述抗体包含或由VH结构域（重链可变区）和VL结构域（轻链可变区）组成，其与SEQ ID NO:43和41（如果参照重链和轻链可变区的相应的核酸序列，则与SEQ ID NO:42和40）的序列具有至少95%、90%、85%、75%、70%、65%、60%、55%或50%序列同源性。此外，本发明的结合化合物是包含VH结构域和VL结构域的抗体，参照SEQ ID NO:43和41的序列，其具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多保守氨基酸替代。此外，本发明的结合化合物是抗体或其结合片段，例如，选自由Fab、Fab'、Fab'-SH、FV、scFV、F(ab')2和双体分子组成的组中的抗体片段。
本发明还涉及结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的抗体，上述抗体包含或由VH结构域（重链可变区）或VL结构域（轻链可变区）组成，其与SEQ ID NO:53和51（如果参照重链和轻链可变区的相应的核酸序列，则与SEQ ID NO:52和50）的序列具有至少95%、90%、85%、75%、70%、65%、60%、55%或50%序列同源性。此外，本发明的结合化合物是包含VH结构域和VL结构域的抗体，参照SEQ ID NO:53和51的序列，其具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多保守氨基酸替代。此外，本发明的结合化合物是抗体或其结合片段，例如，选自由Fab、Fab'、Fab'-SH、FV、scFV、F(ab')2和双体分子组成的组中的抗体片段。
本发明还涉及结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的抗体，上述抗体包含或由VH结构域（重链可变区）和VL结构域（轻链可变区）组成，其与SEQ ID NO:63和61（如果参照重链和轻链可变区的相应的核酸序列，则与SEQ ID NO:62和60）的序列具有至少95%、90%、85%、75%、70%、65%、60%、55%或50%序列同源性。此外，本发明的结合化合物是包含VH结构域和VL结构域的抗体，参照SEQ ID NO:63和61的序列，其具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多保守氨基酸替代。此外，本发明的结合化合物是抗体或其结合片段，例如，选自由Fab、Fab'、Fab'-SH、FV、scFV、F(ab')2和双体分子组成的组中的抗体片段。
在本发明的范围内，如本文描述的抗体是完整抗体（免疫球蛋白，如IgGl、IgG2、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD或IgE），F(ab)-、Fabc-、 Fv-、Fab'-、F(ab')2-片段，单链抗体，嵌合抗体，CDR接枝抗体，二价抗体构建体，抗体融合蛋白或合成抗体。
此外，本发明的范围包括任何结合化合物，其包含由在Chothia,J.Mol.Biol.186(1985),651-663;Novotny and Haber,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(1985),4592-4596或Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,(1987)中描述的方法确定的任何轻链免疫球蛋白或重链免疫球蛋白的一个或多个互补性决定区（CDR）（3个轻链CDR和/或3个重链CDR）和/或框架区。
本发明涉及结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的抗体，上述抗体包含如以下所示的一个或多个互补性决定区（CDR）。抗体是指产生自/可获自以保藏号（登录号）DSM ACC3121保藏的杂交瘤的小鼠单克隆结合化合物/抗体或其衍生物，其分别包含以下轻链可变区（VL结构域）或重链可变区（VH结构域）的CDR。因此，可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的本发明的抗体包含选自由下述组成的组中的一个或多个互补性决定区（CDR）（按照Kabat的分类系统）：
DRH1：Asp-Tyr-Tyr-Met-His  （SEQ ID NO:7）
DRH2：Arg-Ile-Asn-Pro-Tyr-Ser-Gly-Ala-Pro-Ser-Tyr-Thr-Gln-Asn-Phe-Lys-Ala  （SEQ ID NO:8）
CDRH3：Ala-Asn-Trp-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Tyr  （SEQ ID NO:9）
CDRL1：Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Ser-Tyr-Met-Tyr  （SEQ ID NO:10）
CDRL2：Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser  （SEQ ID NO:11）
DRL3：Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-Asn-Pro-Trp-Thr  （SEQ ID NO:12）
本发明还涉及可获自保藏号DSM ACC3174并且其结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的抗体或其衍生物，上述抗体包含如以下所示的一个或多个互补性决定区（CDR）。抗体是指大鼠单克隆结合化合物/结合抗体或其衍生物，其分别包含以下轻链可变区（VL结构域）或重链可变区（VH结构域）的CDR。因此，可获自宿主细胞例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的本发明的抗体或其衍生物包含一个或多个互补性决定区（CDR）（按照Kabat的分类系统），该互补性决定区选自由如在SEQ  ID NO:34中描述的CDRL1、如在SEQ ID NO:35中描述的CDRL2、如在SEQ ID NO:36中描述的CDRL3、如在SEQ ID NO:37中描述的CDRH1、如在SEQ ID NO:38中描述的CDRH2和如在SEQ ID NO:39中描述的CDRH3组成的组。
本发明还涉及可获自保藏号DSM ACC3175并且其结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的抗体或其衍生物，上述抗体包含如以下所示的一个或多个互补性决定区（CDR）。抗体是指小鼠单克隆结合化合物/抗体，其分别包含以下轻链可变区（VL结构域）或重链可变区（VH结构域）的CDR。因此，可获自宿主细胞例如保藏号为DSM ACC3175杂交瘤的本发明的抗体或其衍生物包含一个或多个互补性决定区（CDR）（按照Kabat的分类系统），该互补性决定区选自由如在SEQ ID NO:44中描述的CDRL1、如在SEQ ID NO:45中描述的CDRL2、如在SEQ ID NO:46中描述的CDRL3、如在SEQ ID NO:47中描述的CDRH1、如在SEQ ID NO:48中描述的CDRH2和如在SEQ ID NO:49中描述的CDRH3组成的组。
本发明还涉及可获自保藏号DSM ACC3176并且其结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的抗体或其衍生物，上述抗体包含如以下所示的一个或多个互补性决定区（CDR）。抗体是指小鼠单克隆结合化合物（抗体），其分别包含以下轻链可变区（VL结构域）或重链可变区（VH结构域）的CDR。因此，可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的本发明的抗体或其衍生物包含一个或多个互补性决定区（CDR）（按照Kabat的分类系统），该互补性决定区选自由如在SEQ ID NO:54中描述的CDRL1、如在SEQ ID NO:55中描述的CDRL2、如在SEQ ID NO:56中描述的CDRL3、如在SEQ ID NO:57中描述的CDRH1、如在SEQ ID NO:58中描述的CDRH2和如在SEQ ID NO:59中描述的CDRH3组成的组。
本发明还涉及可获自保藏号DSM ACC3177并且其结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的抗体或其衍生物，上述抗体包含如以下所示的一个或多个互补性决定区（CDR）。抗体是指小鼠单克隆结合化合物（抗体），其分别包含以下轻链可变区（VL结构域）或重链可变区（VH结构域）的CDR。因此，可获自保藏号为DSM ACC3177的宿主细胞（杂交瘤）的本发明的抗体或其衍生物包含一个或多个互补性决定区（CDR）（按照Kabat的分类系统），该互补性决定区选自由如在SEQ ID NO:64中描述的CDRL1、如在SEQ ID NO:65中描述的CDRL2、如在SEQ ID NO:66中 描述的CDRL3、如在SEQ ID NO:67中描述的CDRHl、如在SEQ ID NO:68中描述的CDRH2和如在SEQ ID NO:69中描述的CDRH3组成的组。
此外，本发明的结合化合物是指产生自（可获自）保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤（宿主细胞），并且包含或由如以下所示的重链可变区（VH结构域）和/或轻链可变区（VL结构域）组成的小鼠单克隆结合化合物（抗体）。
因此，产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的结合化合物/抗体，包含cDNA序列或推导的氨基酸序列（下划线示出CDR）：
重链（SEQ ID NO:3）的可变区的cDNA序列

重链（SEQ ID NO:4）的可变区的氨基酸序列

轻链（SEQ ID NO:5）的可变区的cDNA序列

轻链（SEQ ID NO:6）的可变区的氨基酸序列

本发明还涉及产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤，并且包含或由如在SEQ ID NO:33（VH结构域）和/或SEQ ID NO:31（VL结构域）中所示的重链可变区（VH结构域）和/或轻链可变区（VL结构域）组成的大鼠单克隆结合化合物/抗体。
因此，产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的抗体包含如示于SEQ ID NO:30（轻链的可变区的cDNA序列）、SEQ ID NO:31（轻链的可变区的（推导的）氨基酸序列）、SEQ ID NO:32（重链的可变区的cDNA序列）和SEQ ID NO:33（重链的可变区的（推导的）氨基酸序列）的cDNA序列或推导的氨基酸序列。
本发明还涉及产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤，并且包含或由示于SEQ ID NO:43（VH结构域）和/或SEQ ID NO:41（VL结构域）重链可变区（VH结构域）和/或轻链可变区（VL结构域）组成的大鼠单克隆结合化合物/抗体。
因此，产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤的抗体包含如示于SEQ ID NO:40（轻链的可变区的cDNA序列）、SEQ ID NO:41（轻链的可变区的（推导的）氨基酸序列）、SEQ ID NO:42（重链的可变区的cDNA序列）和SEQ ID NO:43（重链的可变区的（推导的）氨基酸序列）的cDNA序列或推导的氨基酸序列。
本发明还涉及大鼠单克隆结合化合物/抗体，其产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤，并且包含或由如示于SEQ ID NO:53（VH结构域）和/或SEQ ID NO:51（VL结构域）的重链可变区（VH结构域）和/或轻链可变区（VL结构域）组成。
因此，产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的抗体包含如示于SEQ ID NO:50（轻链的可变区的cDNA序列）、SEQ ID NO:51（轻链的可变区的（推导的）氨基酸序列）、SEQ ID NO:52（重链的可变区的cDNA序列）和SEQ ID NO:53（重链的可变区的（推导的）氨基酸序列）的cDNA序列或推导的氨基酸序列。
本发明还涉及产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤，并且包含或由如示于SEQ ID NO:63（VH结构域）和/或SEQ ID  NO:61（VL结构域）的重链可变区（VH结构域）和/或轻链可变区（VL结构域）组成的大鼠单克隆结合化合物/抗体。
因此，产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤的抗体包含如示于SEQ ID NO:60（轻链的可变区的cDNA序列）、SEQ ID NO:61（轻链的可变区的（推导的）氨基酸序列）、SEQ ID NO:62（重链的可变区的cDNA序列）和SEQ ID NO:63（重链的可变区的（推导的）氨基酸序列）的cDNA序列或推导的氨基酸序列。
术语"结合化合物"是指抗体和其结合片段。因此，在本发明的范围内，抗体是嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或全人源抗体。
因此，在本发明中，结合化合物是指一种或多种单克隆抗体或多克隆抗体，优选是指一种或多种（小鼠/鼠类）单克隆抗体。可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体是（小鼠/鼠类）单克隆抗体。可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤的抗体是（小鼠/鼠类）单克隆抗体。可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的抗体是（小鼠/鼠类）单克隆抗体。可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤的抗体是（小鼠/鼠类）单克隆抗体。
本发明还涉及可获自保藏号为DSM ACC3174的宿主细胞（杂交瘤）的抗体，其中所述抗体是（大鼠）单克隆抗体。
如在本文中所使用的，术语"单克隆抗体"是指获自基本上同种抗体的群体的抗体，即，除可能的可以少量存在的自然发生的突变之外，构成群体的个体抗体是相同的。针对单抗原位点，单克隆抗体是高度特异的。单克隆抗体是有利的，因为它们可以通过杂交瘤培养合成，并且基本上不受其他免疫球蛋白的污染。修饰的"单克隆"是指抗体的以下特性：是在基本上同种抗体的群体中，而不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。如上文所描述，可以通过由Kohler,Nature256(1975),495描述的杂交瘤法来制备按照本发明使用的单克隆抗体。
如在本文中所使用的，术语"多克隆抗体"是指在一种或多种其他不相同抗体的存在下所产生的抗体。通常，由B淋巴细胞在若干其他B淋巴细胞（其产生不相同抗体）的存在下产生多克隆抗体。通常，多克隆抗体直接获自被免疫的动物。
如在本文中所使用的，术语"双特异性"或"双功能抗体"是指具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体（hybrid antibody）。可以通过多种方法产生双特异性抗体，包括融合杂交瘤或连接Fab'片段。参见例如，Songsivilai,Clin.Exp.Immunol.79(1990),315-321和Kostelny,J Immunol.148(1992),1547-1553。另外，双特异性抗体可以形成为"双体分子"（Holliger,Proc.Nat.Acad.Sci.USA90(1993),6444-6448）或形成为"Janusins"（Traunecker,EMBO J.10(1991),3655-3659和Traunecker,Int.J.Cancer Suppl.7(1992),51-52）。
如在本文中所使用的，术语"全人源抗体"是指仅包含人免疫球蛋白序列的抗体。如果在小鼠、在小鼠细胞或在源自小鼠细胞的杂交瘤中产生，则全人源抗体可能包含鼠类糖链（carbohydrate chain）。类似地，"小鼠抗体"或"鼠类抗体"是指仅包含小鼠/鼠类免疫球蛋白序列的抗体。可替代地，如果在大鼠、在大鼠细胞、在源自大鼠细胞的杂交瘤中产生，则"全人源抗体"可以包含大鼠糖链。类似地，术语"大鼠抗体"是指仅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗体。还可以通过例如噬菌体展示来生产全人源抗体，噬菌体展示是广泛使用的筛选技术，其能够生产并筛选全人源抗体。在本发明范围内也可以使用噬菌体抗体。在例如，US5,403,484、US5,969,108和US5,885,793中描述了噬菌体展示方法。能够开发全人源抗体的另一种技术涉及小鼠杂交瘤技术的改进。将小鼠转基因以包含与它们自己的小鼠基因交换的人免疫球蛋白基因座（参见，例如，US5,877,397）。
术语"嵌合抗体"在本发明的一种实施方式中是指包含与来自另一人或非人物种（例如，小鼠、马、兔、狗、牛、鸡）的抗体区（例如，恒定区）融合或嵌合的本发明的可变区的抗体。
术语抗体还涉及重组人抗体、异源抗体和异源杂合抗体。术语"重组人抗体"包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人序列抗体，如分离自动物（例如，小鼠）（其是针对人免疫球蛋白基因转基因的）的抗体；利用转染进入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体；分离自重组、组合人抗体文库的抗体；或通过任何其他方式（其涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列）制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区（如果存在的话）。然而，这些抗体可以经受体外诱变（或，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，经受体内体细胞诱变），因而重组抗体的VH和VL区的氨基 酸序列是尽管源自并且与人种系VH和VL序列相关但不可能体内地自然存在于人抗体种系所有组成成分（repertoire）内的序列。
"异源抗体"是相对于产生这种抗体的转基因非人生物体而定义的。此术语是指具有与在不由转基因非人动物组成的生物体中发现的序列对应的、并且通常来自不同于该转基因非人动物的物种的氨基酸序列或编码核酸序列的抗体。
术语"异源杂合抗体"是指具有不同生物起源的轻链和重链的抗体。例如，具有与小鼠轻链相结合的人重链的抗体是异源杂合抗体。异杂合抗体的实例包括嵌合抗体和人源化抗体。
术语抗体还涉及人源化抗体。非人（例如鼠类或免）抗体的"人源化"形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或它们的片段（如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列），其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。经常地，人源化抗体是人免疫球蛋白（受体抗体，recipient antibody），其中来自受体的互补决定区（CDR）的残基被具有所期望的特异性、亲和力和能力的来自非人物种（供体抗体）如小鼠、大鼠或免的CDR的残基所替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基所替换。此外，人源化抗体可以包含既不存在于受体抗体中也不存在于引入的CDR或框架序列中的残基。进行这些修饰以进一步细化并优化抗体性能。通常，人源化抗体将基本上均包含至少一个、并且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体还可以包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区（Fc），通常人免疫球蛋白的恒定区。关于进一步的详情，参见：JonesNature321(1986),522-525；Reichmann Nature332(1998),323-327和Presta Curr Op Struct Biol2(1992),593-596。
用于抗体的人源化的流行方法涉及CDR移植，其中将来自非人'供体'抗体的功能性抗原结合位点移植到人'受体'抗体上。CDR移植法是本领域中已知的并且例如描述于US5,225,539、US5,693,761和US6,407,213中。另一种相关方法是自转基因动物生产人源化抗体，其中对上述转基因动物进行基因工程处理以包含一个或多个人源化免疫球蛋白基因座，其能够经受基因重排和基因转换（参见，例如，US7,129,084）。
因此，在本发明的范围内，术语"抗体"或"结合化合物"涉及全免疫球蛋白分子以及这些免疫球蛋白分子的部分。此外，如上文所讨论的，该术语涉及修饰和/或改变的抗体分子。该术语还涉及重组地或合成地产生/合成的抗体。该术语还涉及完整抗体以及它们的抗体片段，如，分离的轻链和重链、Fab、Fv、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2。术语抗体还包括但不限于全人源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、CDR移植抗体和抗体构建体，如单链Fv（scFv）或抗体融合蛋白。
在本发明的范围内，"单链Fv"或"scFv"抗体片段具有抗体的VH结构域和VL结构域，其中这些结构域存在于单多肽链中。通常，scFv多肽进一步包含在VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的期望的结构。用于生产单链抗体的技术描述于例如Pluckthun的The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,N.Y.(1994),269-315中。
如在本文中所使用的，"Fab片段"包括一个轻链和一个重链的CRI和可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
"Fc"区含有包含抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。由两个或更多二硫键以及由CH3结构域的疏水性相互作用将上述两个重链片段保持在一起。
"Fab'片段"包含一个轻链和一个重链的一部分，其包含VH结构域和CH1域以及在CHI和CH2结构域之间的区，使得在两个Fab'片段的两个重链之间可以形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。
"F(ab')2片段"包含两个轻链和两个重链，重链包含在CHI和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两个重链之间形成链间二硫键。F(ab')2片段因此包括由两个重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab'片段。
"Fv区"包含来自重链和轻链的可变区，但缺少恒定区。
在本发明的范围内，结合化合物学也可以是产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体。此外，本发明的结合分子/抗体包含重链恒定区，例如小鼠恒定区，如γl、γ2a、γ2b或γ3小鼠重链恒定区或其变异体。本发明的结合分子/抗体还可以包含轻链恒定区，例如小鼠轻链恒定区，如λ或κ小鼠轻链区或其变异体。因此，可获自宿主细 胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体包含重链恒定区，例如小鼠恒定区，如γ1、γ2a、γ2b或γ3小鼠重链恒定区或它们的变异体。可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体还可以包含轻链恒定区，例如小鼠轻链恒定区，如λ或κ小鼠轻链区或它们的变异体。
本发明还涉及可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤的抗体，其中所述抗体包含重链恒定区，例如小鼠恒定区，如γ1、γ2a、γ2b或γ3小鼠重链恒定区或它们的变异体。可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤的抗体还可以包含轻链恒定区，例如小鼠轻链恒定区，如λ或κ小鼠轻链区或它们的变异体。
本发明还涉及可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的抗体，其中所述抗体包含重链恒定区，例如小鼠恒定区，如γ1、γ2a、γ2b或γ3小鼠重链恒定区或它们的变异体。可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的抗体还可以包含轻链恒定区，例如小鼠轻链恒定区，如λ或κ小鼠轻链区或它们的变异体。
本发明还涉及可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤的抗体，其中所述抗体包含重链恒定区，例如小鼠恒定区，如γl、γ2a、γ2b或γ3小鼠重链恒定区或它们的变异体。可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤的抗体还可以包含轻链恒定区，例如小鼠轻链恒定区，如λ或κ小鼠轻链区或它们的变异体。
本发明还涉及可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的抗体，其中所述抗体包含重链恒定区，例如大鼠恒定区，如γ1、γ2a、γ2b或γ2c大鼠重链恒定区或它们的变异体。可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的抗体还可以包含轻链恒定区，例如大鼠轻链恒定区，如λ或κ大鼠轻链区或它们的变异体。
术语"保守取代"是指用具有类似特性（例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等）的其他氨基酸取代蛋白质中的氨基酸，使得可以经常进行变化而不改变蛋白质的生物活性。本领域技术人员明了，通常地，在多肽的非必需区中的单氨基酸替代基本上不改变生物活性（参见，例如，Watson Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.4th Ed.(1987),224）。此外，结构或功能类似氨基酸的取代是较少可能破坏生物活性。在本发明的范围内，本发明的结合化合物/抗体包含其中当 与本文公开的特定氨基酸序列例如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:63（涉及抗体的抗体重链的可变区）以及SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:61（涉及抗体的轻链的可变区）相比时，其序列包括上达至0（没有变化）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或更多保守氨基酸替代的多肽链。如在本文中所使用的，短语"上达至X"个保守氨基酸替代包括0个替代和上达至10的任何数目的替代并且包括0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个替代。
因此，本发明涉及可获自/产生自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体，并且其中所述抗体包含：含有具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:6的序列的轻链可变区，和含有具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:4的序列的重链可变区。
本发明还涉及可获自/产生自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的抗体，并且其中所述抗体包含：含有具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:31的序列的轻链可变区，和含有具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:33的序列的重链可变区。
本发明还涉及可获自/产生自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤的抗体，并且其中所述抗体包含：含有具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:41的序列的轻链可变区，和含有具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:43的序列的重链可变区。
本发明还涉及可获自/产生自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的抗体，并且其中所述抗体包含：含有具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:51的序列的轻链可变区，和含有具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:53的序列的重链可变区。
本发明还涉及可获自/产生自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤的抗体，并且其中所述抗体包含：含有具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:61的序列的轻链 可变区，和含有具有上达至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个保守氨基酸替代的SEQ ID NO:63的序列的重链可变区。
优选按照在如下表1中列出的进行这样的示例性取代：
表1
示例性保守氨基酸替代
初始残基保守取代Ala（A）Gly；SerArg（R）Lys；HisAsn（N）Gln；HisAsp（D)Glu；AsnCys（C）Ser；AlaGln（Q）AsnGlu（E）Asp；GlnGly（G）AlaHis（H）Asn；GlnIle（I）Leu；ValLeu（L）Ile；ValLys（K）Arg；HisMet（M）Leu；Ile；TyrPhe（F）Tyr；Met；LeuPro（P）AlaSer（S）ThrThr（T）SerTrp（W）Tyr；PheTyr（Y）Trp；PheVal（V）Ile；Leu
本发明还涉及编码本发明的抗体、例如结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的抗体的核酸，例如DNA。核酸编码包含至少一个抗体轻链可变区（VL）和至少一个抗体重链可变区（VH）或这些结构域的结合片段的抗体，其中VL包含具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12的序列CDRL1、CDRL2、CDRL3的互补决定区（CDR）；和/或其中VH包含具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的序列CDRH1、CDRH2、CDRH3的CDR。
核酸分子还可以编码包含或由SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:6组成的重链可变区和/或轻链可变区之一或两者。本发明的核酸分子还可以编码产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体。
本发明还涉及编码本发明的抗体、例如结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的抗体的核酸，例如DNA。核酸编码包含至少一个抗体轻链可变区（VL）和至少一个抗体重链可变区（VH）或这些结构域的结合片段的抗体，其中VL包含具有SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和/或SEQ ID NO:36的序列CDRL1、CDRL2、CDRL3的互补性决定区（CDR）；和/或其中VH包含具有SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和/或SEQ ID NO:39的序列CDRH1、CDRH2、CDRH3的CDR。
核酸分子还可以编码包含或由SEQ ID NO:33和/或SEQ ID NO:31组成的重链可变区和/或轻链可变区之一或两者。本发明的核酸分子还可以编码产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的抗体。
本发明还涉及编码本发明的抗体、例如结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的抗体的核酸，例如DNA。核酸编码包含至少一个抗体轻链可变区（VL）和至少一个抗体重链可变区（VH）或这些结构域的结合片段的抗体，其中VL包含具有SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和/或SEQ ID NO:46的序列CDRL1、CDRL2、CDRL3的互补性决定区（CDR）；和/或其中VH包含具有SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和/或SEQ ID NO:49的序列CDRHl、CDRH2、CDRH3的CDR。
核酸分子还可以编码包含或由SEQ ID NO:43和/或SEQ ID NO:41组成的重链可变区和/或轻链可变区之一或两者。本发明的核酸分子还可以编码产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤的抗体。
本发明还涉及编码本发明的抗体、例如结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的抗体的核酸，例如DNA。核酸编码包含至少一个抗体轻链可变区（VL）和至少一个抗体重链可变区（VH）或这些结构域的结合片段的抗体，其中VL包含具有SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和/或SEQ ID NO:56的序列CDRL1、CDRL2、CDRL3的互补性决定区（CDR）；和/或其中VH包含具有SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和/或SEQ ID NO:59的序列CDRH1、CDRH2、CDRH3的CDR。
核酸分子还可以编码包含或由SEQ ID NO:53和/或SEQ ID NO:51组成的重链可变区和/或轻链可变区之一或两者。本发明的核酸分子还可以 编码产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的抗体。
本发明还涉及编码本发明的抗体、例如结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的抗体的核酸，例如DNA。核酸编码包含至少一个抗体轻链可变区（VL）和至少一个抗体重链可变区（VH）或这些结构域的结合片段的抗体，其中VL包含具有SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和/或SEQ ID NO:66的序列CDRL1、CDRL2、CDRL3的互补性决定区（CDR）；和/或其中VH包含具有SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和/或SEQ ID NO:69的序列CDRH1、CDRH2、CDRH3的CDR。
核酸分子还可以编码包含或由SEQ ID NO:63和/或SEQ ID NO:61组成的重链可变区和/或轻链可变区之一或两者。本发明的核酸分子还可以编码产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤的抗体。
所述核酸分子可以是天然核酸分子以及重组核酸分子。因此，本发明的核酸分子可以是天然的、合成的或半合成的。它可以包含DNA、RNA以及PNA并且它可以是它们的杂合体。
对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以将调节序列加入本发明的核酸分子。可以采用，例如，启动子、转录增强子和/或序列，其使得能够诱导表达本发明的多核苷酸。适合的可诱导系统是例如，如例如由Gossen and Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992),5547-5551和Gossen,Trends Biotech.12(1994),58-62描述的四环素调节的基因表达系统，或如例如由Crook,EMBO J.8(1989),513-519描述的地塞米松可诱导的基因表达系统。
此外，所述核酸分子可以包含，例如，硫酯键和/或核苷酸类似物。对于稳定核酸分子抵抗细胞中的内切核酸酶和/或外切核酸酶所述修饰可以是有用的。可以通过适当的载体来转录所述核酸分子，上述载体包含使得能够在细胞中转录所述核酸分子的嵌合基因。在此方面，还应当明了，编码本发明的结合化合物/抗体的核酸分子可以用于"基因导向"。在本发明的范围内，所述核酸分子是标记的。用于检测核酸的方法也是本领域中众所周知的，例如，Southern和Northern印迹、PC或引物延伸。
本发明的一种或多种核酸分子可以是重组产生的嵌合核酸分子，其单独或组合地包含任何上述核酸分子。优选地，本发明的核酸分子是载体的一部分。
因此，本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体。因此，本发明涉及包含本发明的核酸的载体，优选表达载体。
本发明的载体可以是，例如，质粒、黏粒、病毒、噬菌体或例如常规地在基因工程中使用的另一种载体，并且可以包括另外的基因如标记基因，其使得在适合的宿主细胞中并在适宜的条件下能够选择所述载体。
此外，除本发明的核酸序列以外，本发明的载体可以还包含表达控制元件，使得能够在适合的宿主中适当地表达编码区。上述控制元件是技术人员已知的并且可以包括启动子、剪接盒、翻译起始密码子、用于将插入片段引入载体的翻译和插入位点。优选地，将本发明的核酸分子操作地连接至所述表达控制序列，使得能够在真核或原核细胞中表达。因此，本发明涉及包含本发明的核酸的载体，其中，核酸被可操作地连接至当用载体转染真核和/或原核（宿主）细胞时由宿主细胞识别的控制序列。
确保在真核和原核（宿主）细胞中的表达的控制元件是本领域技术人员众所周知的。如上文所述，它们通常包含确保起始转录的调节序列以及可选地包含确保终止转录和稳定转录本的多聚腺苷酸信号。另外的调节元件可以包括转录以及翻译增强子和/或天然相关的或异源启动子区。允许在例如哺乳动物宿主细胞中表达的可能的调节元件包括CMV-HSV胸苷激酶启动子、SV40、RSV-启动子（劳氏肉瘤病毒）、人延伸因子lα-启动子、糖皮质激素-可诱导的MMTV-启动子（莫洛小鼠肿瘤病毒）、金属硫蛋白-或四环素-可诱导的启动子，或增强子如CMV增强子或SV40-增强子。对于在神经细胞中表达，设想，可以采用神经丝-、PGDF-、NSE-、PrP-或thy-1-启动子。所述启动子是本领域中已知的，并且尤其描述于Charron J.Biol.Chem.270(1995),25739-25745中。对于在原核细胞中表达，已经描述了多种启动子，包括，例如，tac-lac-启动子或trp启动子。除负责起始转录的元件以外，上述调节元件还可以包括转录终止信号，如多核苷酸的下游的SV40-多聚腺苷酸位点或tk-多聚腺苷酸位点。在这种情况下，适合的表达载体是本领域中已知的如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDVl（Pharmacia）、pRc/CMV、pcDNAl、pcDNA3（In-vitrogene）、pSPORTl （GIBCO BRL）、pX（Pagano,Science255(1992),1144-1147）、酵母双杂交载体，如pEG202和dpJG4-5（Gyuris,Cell75(1995),791-803）或原核表达载体，如λgtl1或pGEX（Amersham-Pharmacia）。除本发明的核酸分子以外，载体还可以进一步包含编码分泌信号的核酸序列。这种序列是本领域技术人员众所周知的。此外，取决于所使用的表达系统，可以将能够将本发明的肽引向细胞区室的前导序列加入本发明的核酸分子的编码序列并且这种前导序列是本领域中众所周知的。在适当的阶段使用翻译、起始和终止序列来装配一个或多个前导序列，并且优选能够将翻译蛋白的分泌或其蛋白质引入周质间隙或细胞外培养基的前导序列。可选地，异源序列可以编码包括C端或N端识别肽（identification peptide）的融合蛋白，识别肽赋予期望的特性，例如，表达的重组产物的稳定或简化纯化。一旦已经将载体加入适当宿主，则将宿主保持在适合于高水平表达核苷酸序列的条件下，然后，根据需要，可以随后收集并纯化本发明的抗体分子或它们的片段。
此外，本发明的载体还可以是表达载体。可以设计本发明的核酸分子和载体用于直接引入或用于经由脂质体、病毒载体（例如腺病毒载体、反转录病毒载体）、电穿孔、弹道（例如基因枪）或其他递送系统引入细胞。另外，杆状病毒系统可以用作用于本发明的核酸分子的真核表达系统。
本发明还涉及用本发明的载体转染或转化的宿主细胞或携带本发明的载体的非人宿主，即，涉及用根据本发明的核酸分子或用包含上述核酸分子的载体加以遗传修饰的宿主细胞或宿主。术语"遗传修饰的"是指，除它的天然基因组以外，宿主细胞或宿主还包含被引入细胞或宿主的或被引入它的祖先/亲代之一的根据本发明的核酸分子或载体。核酸分子或载体可以存在于遗传修饰的宿主细胞或宿主中，亦或作为在基因组外的独立分子、优选作为能够复制的分子，亦或它可以被稳定地整合到宿主细胞或宿主的基因组。
本发明的宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。适宜的原核细胞是通常用于克隆的那些原核细胞如大肠杆菌或枯草杆菌。此外，真核细胞包括，例如，真菌或动物细胞。适宜的真菌细胞的实例是酵母细胞，优选酵母属（genus Saccharomyces）的那些、并且最优选酿酒酵母种（species Saccharomyces cerevisiae）的那些真菌细胞。适宜的动物细胞是，例如，昆虫细胞、脊椎动物细胞，优选哺乳动物细胞，如例如HEK293、NSO、 CHO、MDCK、U2-OSHela、NIH3T3、MOLT-4、Jurkat、PC-12、PC-3、IMR、NT2N、Sk-n-sh、CaSki、C33A。这些宿主细胞，例如CHO细胞，可以提供对本发明的抗体分子的翻译后（二级）修饰，包括前导肽除去、H链和C链的折叠和装配、在正确位点处分子的糖基化以及功能分子的分泌。本领域中已知的另外的适宜的细胞系可获自细胞系保藏机构，如，例如，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSMZ）或American Type Culture Collection（ATCC）。根据本发明，此外设想，原代细胞/细胞培养物可以作为宿主细胞。所述细胞特别地源自昆虫（如，果蝇种或蠊（Blatta）种的昆虫）或哺乳动物（如人、猪、小鼠或大鼠）。所述宿主细胞还可以包括来自和/或源自细胞系、如神经母细胞瘤细胞系的细胞。上文述及的原代细胞是本领域中众所周知的并且尤其包括原代星形细胞、（混合的）脊髓培养物或海马培养物。
在本发明的范围内，本发明的宿主细胞可以是登录号为DSM ACC3121的杂交瘤。因此，本发明涉及宿主细胞，例如的保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤，其产生本发明的结合分子。本发明还涉及宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤。本发明还涉及宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤。本发明还涉及宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤。本发明还涉及宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤。
产生结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的（单克隆）抗体的宿主细胞，例如杂交瘤，已由Corimmun GmbH,Fraunhoferstr.17,82152Martinsried（科里木恩有限公司，弗劳恩霍夫大街17号，82152马丁雷德，德国）保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig，德国（DSMZ-德国微生物和细胞培养有限公司，茵霍芬大街7B，D-38124不伦瑞克，德国）。
产生结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的（小鼠单克隆）抗体的杂交瘤（23-6-7），已于2011年3月15日由Corimmun GmbH,Fraunhoferstr.17,82152Martinsried保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig，德国。该杂交瘤的保藏名称和DSM登录号是"blECII E3,23-6-7（抗β1-AR）"和"DSM ACC3121（DSMZ ACC3121）"。
产生结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的（小鼠单克隆）抗体的杂交瘤（28-2-7），已于2012年5月16日由Corimmun GmbH,Fraunhoferstr.17,D-82152Martinsried保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig，德国。杂交瘤（23-6-7）的保藏名称和DSM登录号是"blECII,28-2-7"和"DSM ACC3175（DSMZ ACC3175）"。
产生结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的（小鼠单克隆）抗体的杂交瘤（47-12-9），已于2012年5月16日由Corimmun GmbH,Fraunhoferstr.17,D-82152Martinsried保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig，德国。杂交瘤（47-12-9）的保藏名称和DSM登录号是"blECII,47-12-9"和"DSM ACC3176（DSMZ ACC3176）"。
产生结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的（小鼠单克隆）抗体的杂交瘤（50-1-5），已于2012年5月16日由Corimmun GmbH,Fraunhoferstr.17,D-82152Martinsried保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig，德国。杂交瘤（50-1-5）的保藏名称和DSM登录号是"blECII,50-1-5"和"DSM ACC3177（DSMZ ACC3177）"。
产生结合至人β1-肾上腺素受体（β1-AR-ECII）的第二胞外环的（大鼠单克隆）抗体的杂交瘤（13/F6），已于2012年5月16日由Corimmun GmbH,Fraunhoferstr.17,D-82152Martinsried保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig，德国。表达大鼠单克隆抗体（克隆）13F6的杂交瘤（宿主细胞）的保藏名称和DSM登录号是"13/F6"和"DSM ACC3174（DSMZ ACC3174）"。
本发明涉及生产本发明的结合化合物/抗体的方法，包括：在培养基中培养包含（harbouring）编码结合化合物的表达载体的宿主细胞；以及自宿主细胞或培养基中回收结合化合物/抗体。本发明还可以涉及用于生产本发明的抗体的方法，包括：培养本发明的宿主细胞以及自培养物中回收结合化合物。因此，本发明涉及用于生产本发明的抗体的方法，其中所述方法包括：培养宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤；以及自培养基中回收可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤 的抗体。本发明还涉及用于产生本发明的抗体的方法，其中所述方法包括：培养宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤；以及自培养基中回收可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的抗体。本发明还涉及用于产生本发明的抗体的方法，其中所述方法包括：培养宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤；以及自培养基中回收可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤的抗体。本发明还涉及用于产生本发明的抗体的方法，其中所述方法包括：培养宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤；以及自培养基中回收可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的抗体。本发明还涉及用于产生本发明的抗体的方法，其中所述方法包括：培养宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤；以及自培养基中回收可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤的抗体。
因为宿主细胞，例如，CHO细胞可以提供对本发明的表达的结合化合物的翻译后（二级）修饰。这些修饰尤其包括糖基化和磷酸化。因此，本发明还涉及结合至产生自本发明的宿主细胞的人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的抗体。因此，在本发明的范围内，结合化合物/抗体产生自如以DSM ACC3121保藏的杂交瘤。
本发明涉及结合化合物，如抗体或其片段，其结合至可获自/产生自如上文所述的宿主细胞的结合化合物和/或可获自/产生自保藏号为DSMACC3121的杂交瘤的结合化合物在人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）上的相同表位。本发明涉及结合化合物，如抗体或其结合片段，其结合至可获自/产生自如上文所述的宿主细胞的结合化合物和/或可获自/产生自保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的结合化合物在人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）上的相同表位。本发明涉及结合化合物，如抗体或其结合片段，其结合至可获自/产生自如上文所述的宿主细胞的结合化合物和/或可获自/产生自保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤的结合化合物在人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）上的相同表位。本发明涉及结合化合物，如抗体或其结合片段，其结合至可获自/产生自如上文所述的宿主细胞的结合化合物和/或可获自/产生自保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的结合化合物在人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）上的相同表位。本发明涉及结合化合物，如抗体或其结合片段，其结合至可获自/产生自如上文所述的宿主细胞的结合化合物和 /或可获自/产生自保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤的结合化合物在人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）上的相同表位。
本发明涉及结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII），或其片段的抗体，如以1000、900、800、700、600、550、540、530、520、510、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350pM或更小的平衡解离常数（Kd）结合的抗体。本发明还涉及结合至人的第二胞外环β1-AR-ECII或其结合片段的、可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞的抗体或它们的片段，其中可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞的抗体或其片段的特征在于具有1000、900、800、700、600、550、540、530、520、510、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350pM或更小的平衡解离常数（Kd）。本发明还涉及可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞的抗体或其片段并且其中所述抗体以510pM或更小的平衡解离常数（Kd）结合至人的第二胞外环。
本发明的结合化合物还可以是，与结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的、可获自保藏号为DSM ACC3174的宿主细胞（杂交瘤）的大鼠单克隆抗体13F6或山羊多克隆抗体相比，其以至少低于1000、100、50、40、30、20、10、5倍的亲和力（Kd）结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的抗体或它们的片段。本发明还涉及可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞（杂交瘤）或它们的片段的抗体或它们的片段，与结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的、可获自保藏号为DSM ACC3174的宿主细胞（杂交瘤）的大鼠单克隆抗体13F6或山羊多克隆抗体相比，其以低于30、20、10、5倍结合至第二胞外环。
本发明的结合化合物还可以是这样的抗体或它们的片段：当在生物测定系统中测量时、该生物测定系统在一种或多种与（人）β1-肾上腺素受体同源的受体存在的条件下测量对人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的结合亲和力，其具有2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、10pM或更低的IC50值。本发明还涉及可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体或它们的片段，当在生物测定系统中测量时、该生物测定系统在一种或多种与（人）β1-肾上 腺素受体同源的受体存在的条件下测量对人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的结合亲和力，其具有2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、10pM或更低的IC50值。
因此，本发明涉及可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体或其片段，其中所述抗体具有至少一种以下性质：
（a）抗体以1000pM以下的平衡解离常数（Kd）结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环；
（b）在与（人）β1-肾上腺素受体同源的受体存在的条件下，对人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的结合亲和力以2000pM以下的IC50值被竞争性抑制；和/或
（c）与结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的大鼠单克隆抗体、优选可获自保藏号为DSM ACC3174的宿主细胞的大鼠单克隆抗体，或山羊多克隆抗体相比，以至少低于10倍的亲和力（Kd）结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环。
可以例如通过测量结合亲和力来筛选具有本文确定的特征的、可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体或它们的片段。为了筛选结合至由可获自宿主细胞的抗体结合的在人β1-肾上腺素受体（β1-AR）的第二胞外环上的相同表位的抗体，其中上述宿主细胞是，例如具有选自由DSM ACC3121、DSM ACC3174、DSM ACC3175、DSM ACC3176和DSM ACC3177组成的组中的保藏号的杂交瘤，可以进行如在Antibodies,A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中描述的常规的交叉阻断测定。可替换地，可以通过丙氨酸置换扫描或，例如，通过如在Champe,J.Biol.Chem.270(1995),1388-1394中所描述的方法来进行表位定位（epitope mapping）。可以通过使用标准方法，包括在随附实施例中描述的那些标准方法来确定抗体亲和力，例如对于人β1-AR的第二胞外环的抗体亲和力。优选的抗体或它们的片段是以1000pM以下的平衡解离常数（Kd）结合β1-AR的第二胞外环那些抗体或它们的片段。甚至更加优选的是具有不大于约510pM的Kd值的抗体或它们的片段。
如在本发明中所使用的β1-受体同源物可以尤其包括，化学起源或生物起源的分子、物质或化合物；在自然界中发现的或合成、重组和/或化学方法产生的分子、物质或化合物。具体地，β1-受体同源物是与人β1-肾上腺素受体同源的受体。具体地，β1-受体同源物是具有与β1-肾上腺素受体、优选人β1-肾上腺素受体的第一胞外环（β1-ECI）、第二胞外环（β1-ECII）或第三胞外环（β1-ECIII）相似的序列的肽或环肽。β1-肾上腺素受体的第三胞外结构域域（β1-ECIII）包含或由氨基酸序列Lys-Ala-Phe-His-Arg-Glu-Leu-Val-Pro-Asp-Arg组成。具有与（人）β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-ECII）相似的序列的肽或环肽包含或由通式（x-Xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xj-x）或环（x-Xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xj-x）组成。在此通式中，术语"y"可以是除Cys以外的任何氨基酸，优选地"y"可以是除Cys和/或Pro以外的任何氨基酸。通常，"y"可以是任何氨基酸，只要此氨基酸与本文所描述的环肽的另一种氨基酸（例如，本文所描述的环肽的不同的Cys）没有分子内连接（例如，二硫键）。优选地，"y"可以是类似于Cys的任何氨基酸（即，具有和Cys相似的化学结构和/或类似的生化行为的氨基酸），只是，与本文所描述的环肽的另一种氨基酸（例如，与本文所描述的环肽的另一个Cys）没有分子内连接（例如，二硫键），或与包含Cys残基的内源性细胞蛋白没有分子间连接。优选地，"y"可以是除Cys或Thr以外的任何极性氨基酸。具体地，在本文所描述的环肽中"y"可以是Ser。在本发明的范围内，"y"可以是硒代半胱氨酸（selenocysteine）或其类似物。此外，在本发明的范围内，"y"可以是α-丁酸（Abu）或Abu类似物。适宜的（环）肽的实例是：（环）(Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Thr-Gly)，涉及SEQ ID NO:13，（环）(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Gln)，涉及SEQ ID NO:14，以及（环）(Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln)，涉及SEQ ID NO:15。在本文的上下文中，在（环）肽中（参见上述通式），"h"可以是1至15的数字，优选5至9，和/或"i"可以是0至14的数字，优选1至14。因此，在本文的上下文中，"i"可以是0至6的数字，优选1至6。因此，"h"可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15和/或"i"可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。优选地，"h"是5或9或"i"是3或6。此外，在本发明的范围内，"xh"可以是氨基酸序列 Asp-Glu-Ala-Arg-Arg或Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg和/或"xi"是氨基酸序列Asp-Phe-Val、Asp-Phe-Val-Thr或Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Thr。在本发明的范围内，"xh"是氨基酸序列Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg和/或"xi"是氨基酸序列DFVT。此外，如在本发明中描述的（环）肽（或其环状部分）仅包括一个Pro。因此，优选的是，除了恰好xa、xb和xc之一外，"y"或"x"均不是Pro。在本发明的范围内，"xc"是Pro并且，如本文在任何上述通式中描述的，"xb"是酸性氨基酸如Asp或Glu。例如，如果"xc"是Pro，则"xa"可以是酸性氨基酸，而如果"xa"是Pro，则如本文在任何上述通式中描述的，"x"，其位于"xa"和第一Cys之间，可以是酸性氨基酸。
如在本发明中描述的，（环）肽（或其环状部分）包含18至25个氨基酸。因此，本发明的（环）肽包含18、19、20、21、23、24或25个氨基酸，其中（环）肽优选包含18、22或25个或更优选包含18或22个氨基酸。在本发明的范围内，（环）肽（或其环状部分）包含较少的氨基酸，例如，16或17个氨基酸。在本发明的范围内，本文描述的β1-受体同源物可以（已作必要的修改（mutatis mutandis））是线性肽。本文描述的β1-受体同源物还可以是（环）肽，其与（人）β1-肾上腺素受体的第三胞外环具有序列相似性（参见上文）。β1-受体同源物是本领域中众所周知的并且尤其描述于WO2006/103101和WO2009/027063中。如在WO2006/103101和WO2009/027063中公开的β1-受体同源物在本发明的范围内。特别地，优选的是如在WO2009/027063中描述的（环）肽。在本发明的范围内，β1-受体同源物优选指如在SEQ ID NO:16中描述的氨基酸序列（肽），涉及环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln)。
在本发明范围内，在环状的（环）肽内提供的分子内S-S键可以形成于在如本文描述的所述环状（环）肽的氨基酸主链/一级氨基酸序列内的两个Cys残基之间。在本发明的范围内，β1-受体同源物是指如在SEQ ID NO:16中描述的氨基酸序列（肽），涉及具有在两个Cys残基之间的分子内S-S键的环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln)。在这种环状（环）肽（即，SEQ ID NO:16）中，参考与人β1-AR的ECII表位的同源物，可以在Ala1和Gln18之间发生环化作用。
因此，如在本发明的随附实施例中所示的，本文描述的抗体还可以是抗体或它们的片段，当在生物测定系统中测量时，该生物测定系统在肽环 (Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln)（如在SEQ ID NO:16中描述的）存在的条件下测量对人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的结合亲和力，其具有2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、10pM或更低的IC50值。本发明还涉及可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体或它们的片段，当在生物测定系统中测量时，该生物测定系统在肽环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln)（如在SEQ ID NO:16中描述的）存在的条件下测量对人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的结合亲和力，其具有2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、10pM或更低的IC50值。
因此，本发明涉及可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞（杂交瘤）的抗体或其片段，其中所述抗体具有至少一种以下性质：
（a）抗体以1000pM以下的平衡解离常数（Kd）结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环；
（b）在肽环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln)（如在SEQ ID NO:16中描述的）存在的条件下，对人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的结合亲和力以2000pM以下的IC50值被竞争性抑制；和/或
（c）与结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的大鼠单克隆抗体、优选可获自保藏号为DSM ACC3174的宿主细胞的大鼠单克隆抗体，或山羊多克隆抗体相比，以至少低于10倍的亲和力（Kd）结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环。
本发明还涉及可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞（杂交瘤）的抗体或它们的片段，当在生物测定系统中测量时，该生物测定系统中在肽环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln)（如在SEQ ID NO:16中描述的）存在的条件下测量对人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的结合亲和力，其具有1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、10pM或更低的IC50值。
此外，如在随附实施例中说明的，本发明的抗体作为检测生物样品中的一种或多种分子或化合物的诊断药剂/诊断试剂是有用的。因此，本发明涉及产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体或其片段，其可用作检测生物样品中的一种或多种分子或化合物的诊断药剂/诊断试剂。本发明还涉及可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的抗体或其片段，其可用作检测生物样品中的一种或多种分子或化合物的诊断药剂/诊断试剂。本发明还涉及可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤的抗体或其片段，其可用作检测生物样品中的一种或多种分子或化合物的诊断药剂/诊断试剂。本发明还涉及可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的抗体或其片段，其可用作检测生物样品中的一种或多种分子或化合物的诊断药剂/诊断试剂。本发明还涉及可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤的抗体或其片段，其可用作检测生物样品中的一种或多种分子或化合物的诊断药剂/诊断试剂。
如在本文中所定义的，生物样品可以是，例如，细胞、细胞裂解液、细胞的粗提取物、膜制备组织或生物流体。如在本文中所使用的，在其中检测分子或化合物的生物流体样品，优选指精液、淋巴、血清、血浆、尿、滑液或脊髓液。本发明还涉及一种实施方式，其中，在其中检测分子或化合物的生物样品是指血液、血清或血浆。
在本发明的范围内，在本发明中的生物样品包括一种或多种分子或化合物，其选自抗体、蛋白、蛋白片段、肽、氨基酸和/或它们的衍生物。
如在本文中所使用的，在本文中一种或多种分子或化合物是指在生物样品中，优选在血液、血清或血浆中的一种或多种抗体。
此外，在本发明的范围内，在生物样品中的一种或多种抗体是指一种或多种自身抗β1-肾上腺素能抗体/自身抗β1-AR抗体。
因此，本发明涉及包含本发明的抗体的在检测血液、血清或血浆中的一种或多种自身抗β1-肾上腺素能抗体/自身抗β1-AR抗体的诊断药剂/诊断试剂。在本发明的范围内，优选的是，可以用作诊断药剂/诊断试剂的所述抗体是指产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体或其片段。在本发明的范围内，可以用作诊断药剂/诊断试剂的抗体是产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的指 抗体或其片段。在本发明的范围内，可以用作诊断药剂/诊断试剂的抗体是指产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤的抗体或其片段。在本发明的范围内，可以用作诊断药剂/诊断试剂的抗体是指产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的抗体或其片段。在本发明的范围内，可以用作诊断药剂/诊断试剂的抗体是指产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤的抗体或其片段。
在本发明中，优选的是：用作诊断药剂/诊断试剂的本发明的可获自宿主细胞，例如保藏号为选自由DSM ACC3121、DSM ACC3174、DSM ACC3175、DSM ACC3176和DSM ACC2177组成的组中的杂交瘤的所述抗体是可检测地标记的。多种技术可用于标记生物分子（结合化合物），以及它们是本领域技术人员众所周知的，并且被认为是在本发明的范围内。这样的技术是，例如，在Tijssen,"Practice and theory of enzyme immuno assays",Burden,RH and von Knippenburg(Eds),15(1985)，"Basic methods in molecular biology";Davis LG,Dibmer MD;Battey Elsevier(1990)，Mayer et al.,(Eds)"Immunochemical methods in cell and molecular biology"Academic Press,London(1987)，或系列"Methods in Enzymology",Academic Press,Inc中描述的。
存在许多本领域技术人员已知的不同标记物和标记方法。在本发明中可以使用的标记物类型的实例包括酶、放射性同位素、胶态金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物。
常用的标记物尤其包括荧光染料（如荧光素、罗丹明、德克萨斯红等）、酶（如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶）、放射性同位素（如32P或125I）、生物素、地高辛（异羟洋地黄毒甙元）、胶态金属、化学发光化合物或生物发光化合物（如二氧杂环丁烷、鲁米诺或吖啶鎓）。标记步骤，如酶或生物素基团的共价偶联、碘化、磷酸化、生物素化等，是本领域中众所周知的。
检测方法包括但不限于放射自显影、荧光显微镜检术、直接和间接的酶促反应等。常用的检测方法包括放射性同位素法或非放射性同位素法。这些方法尤其包括Western印迹、重叠测定、RIA（放射免疫测定）和IRMA （免疫放射免疫测定）、EIA（酶免疫测定）、ELISA（酶联免疫吸附测定）、FIA（荧光免疫测定）、以及CLIA（化学发光免疫测定）。
此外，本发明的抗体的另一种创造性应用是在确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法中使用。因此，可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞的抗体可以在用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法中使用。可获自保藏号为DSM ACC3174的宿主细胞的抗体还可以在用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体的相关的疾病的风险的患者的方法中使用。可获自保藏号为DSM ACC3175的宿主细胞的抗体还可以在用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病的风险的患者的方法中使用。可获自保藏号为DSM ACC3176的宿主细胞的抗体还可以在用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法中使用。可获自保藏号为DSM ACC3177的宿主细胞的抗体还可以在用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法中使用。
以上列举的与人β1-肾上腺素受体相关的疾病包括但不限于心脏病，包括特发性扩张型心肌病（DCM）、缺血性心肌病（ICM）、感染性和非感染性心脏病、缺血性和非缺血性心脏病、炎性心脏病和心肌炎、心脏扩张、特发性心肌病、免疫性心肌病、心脏衰竭、以及任何心律失常（包括室性心律失常）、查加斯病和室上性过早搏动。
在本发明的范围内，与人β1-肾上腺素受体相关的疾病是指特发性扩张型心肌病（DCM）。此外，在本发明的范围内，与人β1-肾上腺素受体相关的疾病是指缺血性心肌病（ICM）。
因此，本发明提供了用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法，包括以下步骤：
（a）使人β1-肾上腺素受体与所述患者的生物样品接触，从而使得包含在所述生物样品中的一种或多种分子或化合物能够结合至人β1-肾上腺素受体；
（b）使（a）的人β1-肾上腺素受体与本发明的抗体/结合化合物接触，从而使得所述抗体/结合化合物能够结合至未被包含在（a）的所述生物样品中的一种或多种分子或化合物结合的人β1-肾上腺素受体；
（c）使未与（a）的所述生物样品接触的人β1-肾上腺素受体与本发明的抗体/结合化合物接触，从而使得所述抗体/结合化合物能够结合至未与（a）的所述生物样品接触的所述人β1-肾上腺素受体；
（d）测量
（i）步骤（b）的人β1-肾上腺素受体和抗体/结合分子之间的结合信号，和
（ii）在人β1-肾上腺素受体和步骤（c）的抗体/结合分子之间的结合信号；并且
（e）比较在（d）（i）中测得的结合信号和在（d）（ii）中测得的结合信号，
其中在（d）（i）中测得的结合信号，其至少40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%低于在（d）（ii）中测得的结合信号，表明所述患者患有所述疾病或有发展所述疾病的风险。
本发明提供了用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法，包括以下步骤：
（a）使人β1-肾上腺素受体与所述患者的生物样品接触，从而使得包含在所述生物样品中的一种或多种分子或化合物能够结合至人β1-肾上腺素受体；
（b）使（a）的人β1-肾上腺素受体与可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体或其衍生物接触，从而使得所述抗体或其衍生物能够结合至未被包含在（a）的所述生物样品中的一种或多种分子或化合物结合的人β1-肾上腺素受体；
（c）使未与（a）的所述生物样品接触的人β1-肾上腺素受体与可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体或其衍生物接触，从而使得所述抗体或其衍生物能够结合至未与（a）的所述生物样品接触的所述人β1-肾上腺素受体；
（d）测量
（i）步骤（b）的人β1-肾上腺素受体和抗体或其衍生物之间的结合信号，和
（ii）步骤（c）的人β1-肾上腺素受体和抗体或其衍生物之间的结合信号；并且
（e）比较在（d）（i）中测得的结合信号和在（d）（ii）中测得的结合信号，
其中在（d）（i）中测得的结合信号，其至少40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%低于在（d）（ii）中测得的结合信号，表明所述患者患有所述疾病或有发展所述疾病的风险。
此外，本发明提供了用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法，包括以下步骤：
（a）使人β1-肾上腺素受体与所述患者的生物样品接触，从而使得包含在所述生物样品中的一种或多种分子或化合物能够结合至人β1-肾上腺素受体；
（b）使（a）的人β1-肾上腺素受体与可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的抗体或其衍生物接触，从而使得所述抗体或其衍生物能够结合至未被包含在（a）的所述生物样品中的一种或多种分子或化合物结合的人β1-肾上腺素受体；
（c）使未与（a）的所述生物样品接触的人β1-肾上腺素受体与可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的抗体或其衍生物接触，从而使得所述抗体或其衍生物能够结合至未与（a）的所述生物样品接触的所述人β1-肾上腺素受体；
（d）测量
（i）步骤（b）的人β1-肾上腺素受体和抗体或其衍生物之间的结合信号，和
（ii）步骤（c）的人β1-肾上腺素受体和抗体或其衍生物之间的结合信号；并且
（e）比较在（d）（i）中测得的结合信号和在（d）（ii）中测得的结合信号，
其中在（d）（i）中测得的结合信号，其至少40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%低于在（d）（ii）中测得的结合信号，表明所述患者患有所述疾病或有发展所述疾病的风险。
本发明还涉及用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法，包括以下步骤：
（a）使人β1-肾上腺素受体与所述患者的生物样品接触，从而使得包含在所述生物样品中的一种或多种分子或化合物能够结合至人β1-肾上腺素受体；
（b）使（a）的人β1-肾上腺素受体与可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤的抗体或其衍生物接触，从而使得所述结合化合物能够结合至未被包含在（a）的所述生物样品中的一种或多种分子或化合物结合的人β1-肾上腺素受体；
（c）使未与（a）的所述生物样品接触的人β1-肾上腺素受体与可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤的抗体或其衍生物接 触，从而使得所述结合化合物能够结合至未与（a）的所述生物样品接触的所述人β1-肾上腺素受体；
（d）测量
（i）步骤（b）的人β1-肾上腺素受体和抗体或其衍生物之间的结合信号，和
（ii）步骤（c）的人β1-肾上腺素受体和抗体或其衍生物之间的结合信号；并且
（e）比较在（d）（i）中测得的结合信号和在（d）（ii）中测得的结合信号，
其中在（d）（i）中测得的结合信号，其至少40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%低于在（d）（ii）中测得的结合信号，表明所述患者患有所述疾病或有发展所述疾病的风险。
本发明还涉及用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法，包括以下步骤：
（a）使人β1-肾上腺素受体与所述患者的生物样品接触，从而使得包含在所述生物样品中的一种或多种分子或化合物能够结合至人β1-肾上腺素受体；
（b）使（a）的人β1-肾上腺素受体与可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的抗体或其衍生物接触，从而使得所述结合化合物能够结合至未被包含在（a）的所述生物样品中的一种或多种分子或化合物结合的人β1-肾上腺素受体；
（c）使未与（a）的所述生物样品接触的人β1-肾上腺素受体与可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的抗体或其衍生物接触，从而使得所述抗体或其衍生物能够结合至未与（a）的所述生物样品接触的所述人β1-肾上腺素受体；
（d）测量
（i）步骤（b）的人β1-肾上腺素受体和抗体或其衍生物之间的结合信号，和
（ii）步骤（c）的人β1-肾上腺素受体和抗体或其衍生物之间的结合信号；以及
（e）比较在（d）（i）中测得的结合信号和在（d）（ii）中测得的结合信号，
其中在（d）（i）中测得的结合信号，其至少40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%低于在（d）（ii）中测得的结合信号，表明所述患者患有所述疾病或有发展所述疾病的风险。
本发明提供了用于确定患有与相关人β1-肾上腺素受体的疾病或有发展与相关人β1-肾上腺素受体的疾病风险的患者的方法，包括以下步骤：
（a）使人β1-肾上腺素受体与所述患者的生物样品接触，从而使得包含在所述生物样品中的一种或多种分子或化合物能够结合至人β1-肾上腺素受体；
（b）使（a）的人β1-肾上腺素受体与可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤的抗体或其衍生物接触，从而使得所述抗体或其衍生物能够结合至未被包含在（a）的所述生物样品中的一种或多种分子或化合物结合的人β1-肾上腺素受体；
（c）使未用（a）的所述生物样品接触的人β1-肾上腺素受体接触抗体或其衍生物，其可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤，从而使得所述抗体或其衍生物能够结合至未与（a）的所述生物样品接触的所述人β1-肾上腺素受体；
（d）测量
（i）步骤（b）的人β1-肾上腺素受体和抗体或其衍生物之间的结合信号，和
（ii）步骤（c）的人β1-肾上腺素受体和抗体或其衍生物之间的结合信号；并且
（e）比较在（d）（i）中测得的结合信号和在（d）（ii）中测得的结合信号，
其中在（d）（i）中测得的结合信号，其至少40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%低于在（d）（ii）中测得的结合信号，表明所述患者患有所述疾病或有发展所述疾病的风险。
在本发明的范围内，在（d）（i）中测得的结合信号，其至少40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%低于在（d）（ii）中测得的结合信号，表明所述患者患有所述疾病或有发展所述疾病的风险。特别地，在（d）（i）中测得的结合信号，其至少65%低于在（d）（ii）中测得的结合信号，表明测试患者患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病的风险。
在一种进一步的用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的分析中，可以如在5.1.1至5.1.3部分的随附实施例中所示出的来确认因子（K）和测定截止值。在该分析中，样品、NC（例如来自健康志愿者的血清（对照样品））和PC（例如来自健康志愿者的掺加有可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的抗β1-AR大鼠13F6抗体的血清）的竞争效力，被分别计算为抗体23-6-7结合的百分比抑制，抗体23-6-7可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤。为此，每个测得的结合信号（光 密度（OD）值）除以，例如，通过抗体23-6-7测得的值，乘以100，然后从100中减去得到的值。
例如23-6-7小鼠抗体的OD值的没有减小产生了0%抑制，而全部的OD值减少则对应于100%抑制。因此，在本发明的范围内，基于分析作为对照样品的来自健康受试者（其并不患有与相关人β1-肾上腺素受体的疾病）的血清（NC），通过使用以下公式（1）、（2）和（3）可以确定因子K：
（1）抑制%筛查截止=平均抑制%行数据（对照样品）+2×标准偏差（SD）
（2）Ki=（抑制%筛查截止i-平均抑制%NC i）/平均抑制%PC1
（3）K=（K1+K2+K3）/3
在一种进一步的分析中，通过使用公式（1）、（2）和（3），可以获得因子（K）=0.143。
可以在具有例如20个空白单独样品的三个平板上确定Ki（i=1至3）。对于所有进一步的平板"i"，可以应用以下截止公式（4）：
（4）抑制%截止i=平均抑制%NC i+K(0.143)×平均抑制%
这种抑制%截止计算的方式可以避免分析在每个平板上的大量的单独空白样品的必要性。为了调节来自不同平板的抑制%行数据（样品），必须考虑到各自的抑制%截止。
（5）抑制%=平均抑制%行数据（样品）-抑制%截止
如图11所示，在用于确定患有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法中，开发了一种竞争性分析法：对于对细胞的β1-AR的结合，人抗β1-AR（自身）抗体与小鼠单克隆抗体（如例如可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞的抗体23-6-7）竞争。因而，在包含例如结合至β1-AR的第二胞外环的自身抗β1-AR抗体的生物样品存在的条件下测量一次人β1-AR和本发明的抗体之间的结合信号。作为对照样品，在没有包含例如结合至β1-AR的第二胞外环的自身抗β1-AR抗体的生物样品的情况下测量人β1-AR和本发明的抗体之间的结合信号。如上文说明的，测得的本发明的抗体的结合信号的没有减小表示0%抑制，而完全减小（没有可测量的信号）则表示100%抑制。在本发明的范围内，如在以上公式中所指示的抑制截止值在40%至 75%之间。因此，在本发明的范围内，抑制截止值是在40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%和75%之间。
在本发明的方法中待测试的与人β1-肾上腺素受体相关的疾病包括但不限于心脏病，包括特发性扩张型心肌病（DCM）、缺血性心肌病（ICM）、感染性和非感染性心脏病、缺血性和非缺血性心脏病、炎性心脏病和心肌炎、心脏扩张、特发性心肌病、免疫性心肌病、心脏衰竭、以及任何心律失常，包括室性心律失常、查加斯病和室上性过早搏动。
在本发明的方法的范围内，在与生物样品或本发明的结合化合物接触以前，将人β1-肾上腺素受体（β1-AR）固定于固相。
在本发明的方法的范围内，在与生物样品或本发明的结合化合物/抗体接触以后，将人β1-肾上腺素受体（β1-AR）固定在固相的表面上。
可以以各种方式，将受体，优选人β1-肾上腺素受体（β1-AR）（如在本文中所使用的）固定在固相上。适当的方法取决于各种因素，如例如，受体或固相的材料的类型。可以共价地或通过吸附来进行固定。根据本发明的方法的一种优选的实施方式（如在随附实施例中示出的），受体是在SF9细胞中表达并被固定在固相（优选在聚-L-赖氨酸涂覆的培养板）上的人β1-肾上腺素受体。为了固定为蛋白质的受体，描述了其中借助于被动吸附将受体直接固定在固相上的方法。通常，适当的固相由高分子塑料材料（例如，聚苯乙烯、聚乙烯、胶乳）构成并且例如以微量滴定板或多孔板、膜或球形"珠"（颗粒形式的交联聚合物）的形式用于此目的（Lowman,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26(1997),401-24）。
此外，在根据本发明的方法的范围内，固相的材料选自由聚-L-赖氨酸；聚-L-赖氨酸预涂覆的琼脂糖凝胶、胶乳、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯、硝化纤维素和硅酮组成的组。
进一步优选地，在根据本发明的方法中的固相是膜、珠、芯片或（培养）板。所提及的板的实例是微量滴定板或多孔板。优选地，它们具有6、12、24、48、96、128、356、1024或更多孔。在本发明的实施例4中，描述了一种方法，其中使用96孔板。此外，在用于确定（如上文所述）患 有与人β1-肾上腺素受体相关的疾病或有发展与人β1-肾上腺素受体相关的疾病风险的患者的方法的情况下，在步骤（a）中，检测人β1-肾上腺素受体或这种受体的片段与第一结合分子之间的结合信号，使生物样品与本文描述的结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的结合化合物接触，其在使第一结合分子与人β1-肾上腺素受体结合以后是可接近的。这种优选的实施方式涉及例如利用ELISA的机械原理的方法。此原理通常是技术人员已知的并且尤其描述于Stryer,Biochemie,Spektrum Akademischer Verlag,1996。此外，在随附实施例5中描述了一种相应方法。此外，在本文描述的方法的情况下，如本文描述的抗体是标记的。此外，优选的是，本文描述的结合分子的标记包括发射信号系统。上述发射信号系统的一个实例是以上描述的具有放射性同位素的标记。同样地，如本文描述的荧光标记结合化合物产生使用根据本发明的发射信号系统的标记，其中信号是在适当刺激染料以后发射的荧光信号。按照本文描述的发明，进一步优选地，发射信号的系统包含发射信号的酶。上述酶的实例包括碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶和脲酶。适当实例以及借助于酶促反应用于检测的必要底物的使用是技术人员已知的，特别地按照市售检测试剂盒的包装说明书。这些市售试剂盒经常包含一种或多种第二分子或化合物，其识别特定物种，例如，抗小鼠的一种或多种结合化合物（抗体），并且发射信号的酶与其结合。因此，相应的抗体是一种或多种第二分子或化合物的实例，其识别如本文描述的一种或多种结合化合物（抗体）的特定标记，其是它的Fc部分。
在如本文描述的方法的情况下，一种或多种第二分子或化合物选自由肽、多肽、低分子量物质、抗体或它们的片段或它们的衍生物组成的组。
术语"肽"通常是指具有上达至30个氨基酸的氨基酸链。术语"多肽"是指通常包含30个以上氨基酸的肽并且包括蛋白质。术语"低分子量物质"或小分子是指具有50g/mol至3000g/mol，然而，更经常为75g/mol至2000g/mol并且主要地在100g/mol至1000g/mol范围内的分子量的低分子复杂性的分子。低分子量物质可以是有机的低分子量物质或无机的低分子量物质。
本发明还涉及用于检测一种或多种分子或化合物的诊断试剂盒，其至少包括本发明的一种或多种结合化合物、至少本发明的宿主细胞或至少本发明的诊断药剂/分子诊断。有利地，本发明的试剂盒进一步包括可选的一 种或多种缓冲液、存储溶液和/或其余试剂或用于进行医学、科学或诊断分析和目的所需要的材料。此外，可以将本发明的试剂盒的部分单独包装在小瓶或瓶中或以组合包装在容器或多容器单元中。
因此，在本发明的范围内，（诊断）试剂盒是指用于检测自身抗β1-肾上腺素能抗体的试剂盒，其中试剂盒包括至少产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3121的杂交瘤的抗体。本发明还涉及用于检测自身抗β1-肾上腺素能抗体的试剂盒，其中试剂盒包括至少产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤的抗体。本发明还涉及用于检测自身抗β1-肾上腺素能抗体的试剂盒，其中试剂盒包括至少产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3175的杂交瘤的抗体。本发明还涉及用于检测自身抗β1-肾上腺素能抗体的试剂盒，其中试剂盒包括至少产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3176的杂交瘤的抗体。本发明还涉及用于检测自身抗β1-肾上腺素能抗体的试剂盒，其中试剂盒包括至少产生自/可获自宿主细胞，例如保藏号为DSM ACC3177的杂交瘤的抗体。
可以有利地使用本发明的试剂盒，尤其，用于进行本发明的方法并且可以用于各种各样的应用，在本文中例如称作诊断试剂盒、作为研究工具或医疗工具。另外，本发明的试剂盒可以包括适用于科学、医学和/或诊断目的的用于检测的装置。优选按照本领域技术人员已知的标准步骤来制造试剂盒。
附图说明
图1：ELISA结合测定，其中使用26-聚体肽（His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-GIu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg（SEQ ID NO:17））
当利用ELISA结合测定通过使用涂覆在微量滴定板的塑料表面上的26聚体肽（His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg（SEQ ID NO:17））时，考虑抗β1-AR阳性的患有特发性扩张型心肌病的患者（DCM患者）和健康志愿者（对照患者）的百分比。
图2：基于ELISA测定不同克隆的单克隆小鼠抗体对人β1-肾上腺素受体的第二胞外域（β1-ECII AR）的亲和力
在SF9细胞（在杆状病毒感染以后过表达人β1-肾上腺素受体（β1-AR））中孵育增加浓度的各种单克隆抗体克隆（范围为从0.00017至133nM）。通过G蛋白层析法自杂交瘤上清纯化每种单克隆抗体。通过BCA蛋白质含量分析来确定浓度并通过考马斯染色来分析纯度。示出来自一个代表性的实验的OD值的重复测定的平均值和SD偏差。
图3：对结合至人β1-AR的、由杂交瘤克隆23-6-7、47-12-9、50-1-5、55-3-10和28-2-7产生的5种小鼠单克隆抗体的具有半最大疗效响应（EC50）值的浓度的总结。
由四个独立的实验确定具有半最大疗效响应（EC50）值的平均浓度。如通过比较相应的pEC50值（log10(EC50)）并通过方差分析（ANOVA）接着是随后多重比较LSD所确定的，杂交瘤克隆23-6-7的平均EC50值显著（p<0.05）低于杂交瘤克隆47-12-9、50-1-5、55-3-10和28-2-7的平均EC50值。
图4：获自小鼠、大鼠和山羊的各种抗体分别与在SF9细胞中（在存在或不存在0.1%吐温20的条件下）过表达的人β1-AR的结合特性。
在SF9细胞（其在杆状病毒感染以后过表达人β1-AR）上孵育提高浓度的各种抗体（范围为从0.001至100nM）。相对于抗体浓度（对数尺度）绘制具有标准偏差的重复测定的OD比值的平均值。
图5：在存在或不存在吐温20的条件下，比较基于ELISA的测定的各种抗体对抗β1-AR ECII的亲和力。
在SF9细胞上（其在杆状病毒感染以后过表达人β1-AR），在有/没有吐温20的条件下孵育提高浓度的各种抗体（范围为0.001至100nM）。相对于抗体浓度（对数尺度）绘制具有标准偏差的重复测定的OD比的平均值。
图6：由环(Ala-Asp-Glu-AIa-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln)（参照SEQ ID NO16）竞争单克隆小鼠（23-6-7）抗体对第二β1-AR结合。
针对通过杆状病毒感染过表达人β1-AR的SF9细胞，将各种浓度的环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln)（如在SEQ ID NO16中描述的），范围为从0.0001μM至10μM，与如由以登录号DSM ACC3121保藏的杂交瘤（23-6-7）产生的小鼠单克隆抗β1-AR-ECII抗体一起共同孵育。绘制了具有S.E.M.的4个独立测量结果的平均值。
图7：高于获自单独的特发性扩张型心肌病（DCM）患者的血清的截止的抑制值。
基于在表达人β-AR的细胞与对照细胞（不表达人β1-AR）中由单克隆小鼠抗β1-AR-ECII抗体（23-6-7）诱发的信号的比率将数值计算为血清样品的抑制。示出以%计的抑制，降低95%置信区间并超过65%截止值。示出来自进行的三个独立实验的结果（每个重复进行）。小棒（bars）指示具有S.E.M.的平均值。
图8：高于获自健康志愿者的血清的截止的抑制值。
基于在表达人β1-AR的细胞与对照细胞（不表达人β1-AR）中由单克隆小鼠抗β1-AR-ECII抗体（23-6-7）诱发的信号的比率将数值计算为血清样品的抑制。示出以%计的抑制，降低95%置信区间和超过65%截止值。示出来自进行的三个独立实验的结果（每个重复进行）。小棒指示具有S.E.M.的平均值。
图9：在DCM患者或健康对照中，测定结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的阳性自身抗β1-AR抗体的百分比。
通过65%抑制的截止，并且如果重复测量结果的95%置信区间也超过上述值则确定偏差为阳性。利用此值，仅在测试的健康对照组（43人）的一位中可以确定自身抗β1-AR抗体，而在82位患有DCM的患者的22位中可以确定自身抗β1-AR抗体。
图10：通过竞争单克隆小鼠抗β1-AR-ECII抗体23-6-7，ELISA测量人抗β1-AR（人β1-肾上腺素受体）抗体的原理。
利用微静态板格式，ELISA模拟对β1-AR的体内自身抗体结合特性。为了避免其他人抗体与各种细胞膜蛋白的交叉结合，开发了一种有竞争方 法：人抗β1-AR（自身）抗体与小鼠单克隆抗体，如例如可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞的抗体23-6-7竞争结合至细胞的β1-AR。
图11：可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞/杂交瘤的小鼠单克隆抗体的结合亲和力
获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞/杂交瘤的小鼠单克隆抗β-lAR-ECII抗体23-6-7与（在杆状病毒感染以后在SF9细胞中过表达的）完全重组人β1-AR的结合亲和力。绘制了至少4个独立测量结果的具有S.E.M.的平均值。来自患者血清的功能相关的人抗β1-AR自身抗体的特征在于它们的以下能力：结合至相同或重叠表位并替换测试结合分子/抗体、并因此降低免疫或生物信号如ELISA信号，其可以通过例如利用基于过氧化物酶（POD）的发射系统加以测量。
图12：在稳定表达人β1-AR的人胚肾HEK293细胞中，通过Epac-FRET测量cAMP水平。
通过利用稳定表达人β1-AR的人胚肾HEK293细胞（如在DE10 2010018 878Al中描述的）呈现独立实验的代表性的FRET比率踪迹（ratio traces）（%，对应于YFP/CFP强度比率的相对变化）。FRET的降低反映了细胞内cAMP的增加。
（A）在活细胞中，没有失活对照抗体诱导显著的cAMP反应。在实验结束时，通过浓度为2.5mol/L的异丙基肾上腺素（Iso）的另外的刺激证明了细胞的生存能力，其诱发全cAMP反应。
（B）相反，添加小鼠单克隆抗β-l AR-ECII抗体23-6-7（其获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞/杂交瘤）诱发相关信号，其对应于38.2%的最大可能的信号，如在此实验结束时由另外给予异丙基肾上腺素（Iso）所诱导的。
（C）信号强度和动力学与来自先前判断为抗β1-AR抗体阳性的DCM患者血清的信号强度和动力学相当。
图13：由多克隆山羊抗β1-AR抗体竞争可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞/杂交瘤的小鼠单克隆抗抗体23-6-7的结合。
将各种浓度（范围为从0.0至1.400nmol/L（nM））的多克隆山羊抗体与可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞（杂交瘤）的小鼠单克隆抗β-l AR-ECII抗体23-6-7（最终浓度为0.26nM）共同孵育。添加源自健康志愿者的10%血清池与缓冲液对照相比较，并产生类似的剂量依赖效应。通过至少10nM羊抗体来施加抑制。绘制至少4个独立测量结果的具有S.E.M.的平均值。
图14：在DCM患者或健康对照（图（A）和（B））以及ICM（图（C））患者中，测定自身抗β1-AR抗体结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）。
（A）利用ELISA并借助于过表达β1-AR的SF9细胞与对照SF9细胞（对于β1-AR是阴性的），总结了DCM患者（n=167）和并没有报道任何已知心脏病的对照受试者（n=110）的β1-AR结合活性。通过测量与单克隆抗β1-AR抗体23-6-7的竞争确定结合活性。绘制了3个独立测量结果的具有S.E.M.的平均值。
（B）相对于26聚体肽His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg；SEQ ID NO:17），分析了DCM患者（n=167）和并没有报告任何已知心脏病的对照受试者（n=110）的相同的血清样品。结合活性计算为比率（样品光密度（OD）与对照孔的26聚体/样品OD）。抗β1-AR抗体阳性得分被定义为>1.5的比率。绘制了2个独立测量结果的具有S.E.M.的平均值。
（C）利用ELISA并借助于过表达β1-AR的SF9细胞与对照SF9细胞（对于β1-AR是阴性的），总结了ICM患者（n=156）和并没有报告任何已知心脏病的对照受试者（n=110）的β1-AR结合活性。通过测量与可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞/杂交瘤的单克隆抗β1-AR抗体23-6-7的竞争来确定结合活性。绘制了3个独立测量结果的具有S.E.M.的平均值。
图15：比较未改变的血清和相应的抗体耗尽的血清部分的抑制效果
比较未改变的血清和相应的抗体耗尽的血清部分的抑制效果。20个血清样品被测试为阳性的，具有13.1%的平均抑制值。相反，所有G蛋白处理的样品被测试为阴性的，具有低于截止值的平均抑制值。
实施例：
实施例1：生产针对人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的抗体
1.1生产和纯化融合蛋白GST-β1ECII构建体
编码人β1-肾上腺素受体的第二胞外环的DNA片段，加上侧翼跨膜氨基酸（氨基酸195-225；ECII）。更精确地，通过聚合酶链反应（PCR）并借助于用于亚克隆的上游BamHI和下游EcoRl限制位点扩增DNA片段，该DNA片段编码第二胞外环的氨基酸197-222（His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg；SEQ ID NO:17）加上人β1肾上腺素受体（β1-AR）的侧翼跨膜区的氨基酸195（Lys）、196（Met）、223（Ala）、224（Tyr）和225（Ala）。限制性酶切PCR片段，并与细菌谷胱甘肽-S-转移酶的编码序列的3'端插入框内具有的pGEX-1λT-载体（Pharmacia,Uppsala，瑞典）。在大肠杆菌XL-1蓝色细胞（Stratagene,Heidelberg，德国）转化以前，通过测序来控制获得的GST-β1-AR-ECII融合蛋白构建体。
在30℃下，用1mM异丙基-l-硫代-b-D-半乳糖并-吡喃糖苷（IPTG）诱导表达GST-β1-AR-ECII融合蛋白3小时。随后，在冰上收获细胞，沉淀（4000x g，4℃，10分钟），再悬浮于1/10体积的冰冷PBS（磷酸盐缓冲盐水：140mM NaCl，2.7mM C1，10.1mM Na2HP04，1.8mM KH2P04，pH7.3）中，然后用弗氏压碎器（SLM Instruments,Rochester,NY,USA），在12000psi下，并在20μg/ml DNA酶I（Sigma）和2mM Mg2SO4存在下裂解。在添加0.2mM苯甲磺酰氟（PMSF）、5mM乙二胺四乙酸（EDTA）和1%Triton X-100以后，离心（10000x g，4℃，15分钟）裂解液，并将可溶性蛋白质级分吸附于谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B柱（Pharmacia,Uppsala，瑞典）。在用PBS洗涤以后，用10mM还原谷胱甘肽（在50mM Tris-HCl中，pH8.0）洗脱结合的蛋白。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯蓝染色来控制洗出液的纯度。所有获得的产物基本上是纯的（80-90%）；可检测的仅有的污染物是29kDa的断裂产物，对应于细菌谷胱甘肽-S-转移酶。纯化融合蛋白的产量为2.5mg至15mg/升诱导的细菌培养物（Jahns,Eur J Pharmacol316（1996）,111-121）。
1.2生产针对人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的单克隆鼠类抗体
1.2.1免疫
如上文在项目1.1下所描述的，用与31聚体肽（GST-β1-AR-ECII）连接的GST融合蛋白经39天皮下免疫八周龄BALB/c雌性小鼠。用50μg/鼠的GST-β1--AR-ECII融合蛋白用弗氏完全佐剂加上弗氏不完全佐剂每两周免疫小鼠三次。
用溶解于250μl PBS、200μl弗氏不完全佐剂和50μl弗氏完全佐剂中的GST-β1-AR-ECII（50μg）进行第一次免疫。用溶解于250μl PBS和250μl弗氏不完全佐剂中的GST-β1-AR-ECII（50μg）进行第二次免疫和第三次免疫。将500μl的总体积分布到各个位置用于皮下注射。在39天以后，在第三次免疫以后的第11天，自脾脏中分离脾细胞，然后用聚乙二醇以4:1的比率与永生化的骨髓瘤细胞SP2/0融合。在HAT培养基（次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷培养基）中孵育融合细胞10天。平行于两个单细胞克隆步骤，通过ELISA筛选杂交瘤培养上清并加以选择，其中利用GST融合蛋白，线性25聚体肽（Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln；SEQ ID NO:18）或18聚体环肽（即，环（Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln，具有Cys-Cys）；SEQ ID NO:16）作为固定抗原。5种不同的杂交瘤细胞克隆源自这种杂交瘤融合方式，即，杂交瘤克隆23-6-7、28-2-7、47-12-9、50-1-5和55-4-10。
1.2.2从杂交瘤细胞培养上清液中纯化抗体
在37℃5%CO2下，在DMEM（包含4.5g/L葡萄糖、丙酮酸钠、2x10-3M L-谷氨酰胺、2x10-3M非必需氨基酸、5x10-6M2-巯基乙醇、15%FCS、l00mg/L链霉素、250μg/L两性霉素（Amphotericin））中培养杂交瘤细胞。随后，通过G蛋白亲和层析法纯化来自杂交瘤细胞培养克隆的上清。通过快速蛋白G琼脂糖凝胶4（Protein G Sepharose4Fast Flow，Thermo Fisher,目录号17-0618-05）纯化来自细胞培养克隆的包含抗体的上清。在柱上加载样品以前，在14000g和4℃下离心上清15分钟并与相同体积的20mM Na2PO4和1/20体积的快速蛋白G琼脂糖凝胶4混合。在20℃下孵育l小 时以后，将混合物转移至离心柱（Thermo Scientific,目录号89897）。用30x柱体积的20mM Na2PO4洗涤柱。用l00mM甘氨酸（pH2.7）洗脱抗体。在洗脱后立即用1M Tris/HCl pH9.0将pH恢复到pH7.5。在4℃下相对于PBS透析样品过夜。通过考马斯蓝染色来控制纯度并通过在280nm处测量光密度来确定浓度。
1.2.3小鼠单克隆抗体23-6-7的保藏
表达结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的小鼠单克隆抗体23-6-7的杂交瘤克隆23-6-7已于2011年3月15日由Corimmun GmbH,Fraunhoferstr.17,D-82152Martinsried保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig，德国。杂交瘤（23-6-7）的保藏名称和DSM登录号是“blECII E3,23-6-7（抗β1-AR）”和“DSM ACC3121（DSMZ ACC3121）”。
1.2.4小鼠单克隆抗体28-2-7的保藏
表达结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的小鼠单克隆抗体28-2-7的杂交瘤克隆28-2-7已于2012年5月16日由Corimmun GmbH,Fraunhoferstr.17,D-82152Martinsried保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig，德国。杂交瘤（28-2-7）的保藏名称和DSM登录号是"blECII,28-2-7"和"DSM ACC3175（DSMZ ACC3175）"。
1.2.5小鼠单克隆抗体47-12-9的保藏
表达结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的小鼠单克隆抗体47-12-9的杂交瘤克隆47-12-9已于2012年5月16日由Corimmun GmbH,Fraunhoferstr.17,D-82152Martinsried保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig，德国。杂交瘤（47-12-9）的保藏名称和DSM登录号是"blECII,47-12-9"和"DSM ACC3176（DSMZ ACC3176）"。
1.2.6小鼠单克隆抗体50-1-5的保藏
表达结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的小鼠单克隆抗体50-1-5的杂交瘤克隆50-1-5已于2012年5月16日由Corimmun GmbH,Fraunhoferstr.17,D-82152Martinsried保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig，德国。杂交瘤（50-1-5）的保藏名称和DSM登录号是"blECII,50-1-5"和"DSM ACC3177（DSMZ ACC3177）"。
1.3.生产针对人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的单克隆大鼠和山羊多克隆抗体
按照和上文描述的用于小鼠单克隆抗体（参见上述的项目1.2.1和1.2.2,）的相同方案生产大鼠单克隆抗体克隆13F6。更精确地，由In Vivo Biotech Services GmbH利用GST-β1-ECII融合蛋白（参见上述的项目1.1），其与用于小鼠单克隆抗体相同（参见上述的项目1.2.1和1.2.2）生产大鼠单克隆抗体克隆13F6。随后根据制造商的说明通过蛋白G亲和层析法纯化大鼠抗体并溶解于PBS。
表达结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的大鼠单克隆抗体13F6的杂交瘤（宿主细胞）已于2012年5月16日由Corimmun GmbH,Fraunhoferstr.17,D-82152Martinsried保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig，德国。表达大鼠单克隆抗体（克隆）13F6的杂交瘤细胞（宿主细胞）的保藏名称和DSM登录号是"13/F6"和"DSM ACC3174（DSMZ ACC3174）"。
由Biogenes GmbH，柏林产生山羊多克隆抗体（批号：28498）。通过利用GST融合蛋白（GSTβ1-AR-ECII）在第7、14、28、70、105、133天的6次加强（boost）来进行免疫山羊，该GST融合蛋白对应于人β1-AR的第二胞外环的氨基酸197-222，加上的人β1肾上腺素受体（β1-AR）的侧翼跨膜区的氨基酸195（L）、196（M）、223（A）、224（Y）和225（A）（参见上述的项目1.1）。在第161天，获得包含抗体的血清，然后根据制造商的指示通过亲和层析法并加以纯化。因而，将25聚体肽（Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln（SEQ ID NO:18），其对应于人β1-AR的第二胞外环的氨基酸200-222（Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn- Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg（SEQ ID NO:19））加上在SEQ ID NO:1的位置1处的氨基酸和在SEQ ID NO:18的位置25处的Gln）连接至CNBr-活化的琼脂糖凝胶4B（GE Healthcare,目录号17-0430-01）。将抗体溶解在甘氨酸缓冲液中，pH7.5，250mM NaCl，0.02%硫汞撒（Thimerosal）。
实施例2：确定抗人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-ECII）的单克隆抗体的可变区的编码序列
2.1确定可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞（杂交瘤）的小鼠单克隆抗体23-6-7的可变区的编码序列
使用Oligotex Direct mRNA试剂盒（QIAGEN，德国），从5xl06个细胞中分离杂交瘤细胞（克隆）"blECII E3,23-6-7（抗β1-AR）"（以DSM ACC3121保藏）的mRNA。使用III First-Strand Synthesis System（Invitrogen,USA）进行cDNA合成。根据来自Dilbel,J Immunol Methods.175(1994),89-95的方案并通过PCR进行可变区序列的扩增。简要地，用2μl cDNA、200μm dNTP、5%DMSO、10pmol每个引物和0.5μl Herculase II Fusion（Agilent Technologies,USA）以及lx Herculase反应缓冲液进行PCR。用引物组合Bi8/Bi5扩增轻链可变区的可变区序列并且通过使用Bi3/Bi4以及Bi3d/Bi4作为扩增引物扩增重链序列；关于引物序列，参见以下表2。作为用于cDNA质量的阳性对照，使用了用于扩增β-肌动蛋白的引物（正向引物：5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3'（SEQ ID NO:20），反向引物：5'-GTCAGGCAGCTCGTAGCTCT-3'（SEQ ID NO:21））。阴性对照使用水而不是cDNA。开始在95℃下初始变性2分钟起始扩增，接着是94℃1分钟、52℃2分钟、72℃1分钟的35个循环，以及72℃最后延伸5分钟。由1.6%琼脂糖凝胶（高分辨率琼脂糖凝胶）分离PCR片段，然后根据制造商的方案使用GFX PCR DNA和Gel Band纯化试剂盒（GE Healthcare,UK）纯化。用引物Bi5seq（5'-GGGAAGATGGATCCAGT TG-3'（轻链；SEQ ID NO:27））和Bi4seq（5'-CAGGGGCCAGTGGATAGA-3'（重链；SEQ ID NO:28））测序纯化的PCR片段并用NCBI IgBlast程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）分析。
2.2确定可获自保藏号为DSM ACC3175、DSM ACC3176和DSM ACC3177的宿主细胞（杂交瘤）的小鼠单克隆抗体28-2-7、47-12-9和50-1-5的可变区的编码序列。
使用Oligotex Direct mRNA试剂盒（QIAGEN，德国），从5x106个细胞中分离杂交瘤（克隆）（i）以DSM ACC3175保藏的"blECII,28-2-7"、（ii）以DSM ACC3176保藏的"blECII,47-12-9"和（iii）以DSM ACC3176保藏的"blECII,50-1-5"的mRNA。使用III First-Strand Synthesis System（Invitrogen,USA）来进行cDNA合成。按照来自Dilbel,J Immunol Methods.175(1994),89-95的方案通过PCR进行可变区序列的扩增。简要地，用0.5-1.0μl cDNA、200μm dNTP、2.5%DMSO、10pmol每个引物和0.5μl Herculase II Fusion（Agilent Technologies,USA）以及lx Herculase反应缓冲液进行PCR。用引物组合Bi8/Bi5扩增轻链可变区的可变区序列并且通过使用Bi3/Bi4和Bi3d/Bi4作为扩增引物扩增重链序列；关于引物序列，参见以下表2。作为用于cDNA质量的阳性对照，使用了用于扩增β-肌动蛋白的引物（正向引物：5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3'（SEQ ID NO:20），反向引物：5'-GTCAGGCAGCTCGTAGCTCT-3'（SEQ ID NO:21））。阴性对照使用水而不是cDNA。在95℃下初始变性2分钟起始扩增，接着是94℃1分钟、52℃2分钟、72℃1分钟的35个循环，以及72℃最后延伸5分钟。由1.6%琼脂糖凝胶（高分辨率琼脂糖凝胶）分离PCR片段，然后根据制造商的方案使用GFX PCR DNA和Gel Band纯化试剂盒（GE Healthcare,UK）纯化。用引物Bi5seq（5'-GGGAAGATGGATCC AGTTG-3'（轻链；SEQ ID NO:27））和Bi4seq（5'-CAGGGGCCAGTGGATA GA-3'（重链；SEQ ID NO:28））测序纯化的PCR片段并用NCBI IgBlast程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）分析。
2.3确定可获自保藏号为DSM ACC3174的杂交瘤（宿主细胞）的大鼠单克隆抗体13F6的可变区的编码序列
使用Oligotex Direct mRNA试剂盒（QIAGEN，德国），从5x106个细胞中分离杂交瘤细胞（克隆）（i）以DSM ACC3174保藏的"13F6"的mRNA。使用III First-Strand Synthesis System（Invitrogen,USA）进行cDNA合成。根据来自Dilbel,J Immunol Methods.175(1994),89-95的方案通过PCR进行可变区序列的扩增。简要地，用0.5-1.0μl  cDNA、200μm dNTP、2.5%DMSO、10pmol每种引物和0.5μl Herculase II Fusion（Agilent Technologies,USA）以及lx Herculase反应缓冲液进行PCR。用引物组合Bi7/Bi5扩增轻链可变区的可变区序列并通过使用Bi3/dBi4作为扩增引物扩增重链序列；关于引物序列，参见以下表2。作为用于cDNA质量的阳性对照，使用了用于扩增β-肌动蛋白的引物（正向引物：5'-GGCATCCTCA CCCTGAAGTA-3'（SEQ ID NO:20），反向引物：5'-GTCAGGCAGCTCGTA GCTCT-3'（SEQ ID NO:21））。阴性对照使用水而不是cDNA。在95℃下初始变性2分钟起始扩增，接着是94℃1分钟、52℃2分钟、72℃1分钟的35个循环，以及72℃最后延伸5分钟。由1.6%琼脂糖凝胶（高分辨率琼脂糖凝胶）分离PCR片段，然后根据制造商的方案使用GFX PCR DNA和Gel Band纯化试剂盒（GE Healthcare,UK）纯化。用引物Bi5seq（5'-GGGAAGATGGATCCAGTTG-3'（轻链；SEQ ID NO:27））和Bi4seq（5'-CAGGGGCCAGTGGATAGA-3'（重链；SEQ ID NO:28））测序纯化的PCR片段的并用NCBI IgBlast程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）分析。
表2：
引物结构域5'->3'序列Bi7 GGTGATATC(A/T)TG(A/C)TGACCCAA(A/T)CTCCACTCTC(SEQ ID NO:29)Bi8κ链可变区GGTGATATCGT(G/T)CTCAC(C/T)CA(A/G)TCTCCAGCAAT(SEQ ID NO:22)Bi5κ链恒定区GGGAAGATGGATCCAGTTGGTGCAGCATCAGC(SEQ ID NO:23)Bi3重链可变区GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGACCTAGCCTGGTG(SEQ ID NO:24)Bi3d重链可变区AGGT(C/G)CAGCTGCAG(C/G)AGTC(A/T)GG(SEQ ID NO:25)Bi4γ链恒定区CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT(SEQ ID NO:26)
实施例4：在Sf9昆虫细胞中异源表达人β1-肾上腺素受体
在27℃下，在用10%胎牛培养基、100U/ml青霉素和100g/ml链霉素补充的格雷斯氏昆虫培养基（Grace's Insect Medium，Invitrogen）中以粘附培养生长昆虫细胞Sf9细胞（草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda），ATCC登录号CRL1711）。在3-4天的生长后，当它们已达到约70-100%汇合时，使细胞脱离培养烧瓶。此后，在20℃下离心（400x g，5分钟）它们并重新悬浮在细胞培养基中（用10%胎牛培养基、100U/ml青霉素和100[μg/ml链霉素补充的格雷斯氏昆虫培养基）。在20℃下，用携带用于人β1-肾上腺素受体（Bl-AR）的基因的杆状病毒（MOI6）感染悬浮细胞。无转基因的杆状病毒作为对照。在总共200μl培养基（用10%胎牛培 养基、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素补充的格雷斯氏昆虫培养基（Invitrogen））中，以30,000个细胞/孔的密度，将细胞悬浮液直接接种于聚L-赖氨酸涂覆的96孔细胞培养板（Biocoat,#356516）。在27℃的温度下孵育72小时以后，除去100μl无细胞培养上清并添加100μl2x PFA（多聚甲醛）固定液（2%PFA，在PBS中的最终溶液中）。在室温并在不断振摇下（Heidolph Titramax1000,450rpm）孵育细胞15分钟。随后除去上清并用PBS-T（PBS Dulbecco（Cat No.LI820,Biochrom AG）+0.1%吐温20（PBS-T））洗涤固定的细胞三次。
在基于细胞的ELISA测定（参见实施例5.1）中，为了提供作为用于自身抗β1-肾上腺素能抗体的结合表位的天然和功能活性的人β1-肾上腺素受体，用携带用于人β1-AR的基因的杆状病毒感染SF9细胞。由于由高度多样化的人抗体池对细胞表面表位的强背景结合信号，不可能直接测量患者的自身抗β1-AR抗体（自身抗β1-AR抗体滴度）。为了避开这个问题，进行竞争测定，借此将抗人β1-AR的高亲和力抗体用于产生对产生人β1-AR的SF9细胞的特异性结合信号，其可以受到来自人血清的特异性抗βL-AR自身抗体的竞争（图11）。
4.1鉴定和表征结合至β1-肾上腺素受体（β1-AR）的第二胞外域的单克隆和多克隆抗体
然而，对于此类竞争法的先决条件是产生对人β1-AR具有高特异性和亲和力的抗体。通过使用杂交瘤细胞系方法（参见实施例1.2）产生结合至的人β1-肾上腺素受体（β1-肾上腺素受体）的第二胞外环的（β1-AR ECII）不同的单克隆小鼠抗体。分析了5个杂交瘤细胞克隆23-6-7、28-2-7、47-12-9、50-1-5和55-3-10与（天然）人β1-AR的结合特性。
图2和3显示，与其他类似地产生的抗体（即，杂交瘤细胞克隆28-2-7、47-12-9、50-1-5和55-3-10）相比，杂交瘤细胞克隆23-6-7的结合亲和力显著更好。杂交瘤细胞克隆23-6-7提供了最高的结合亲和力，Kd=0.43nM（等于EC50），以及低本底水平。这些性能显著增强了用抗β1-AR ECII与人自身抗体的竞争替换。
为了进一步表征抗体23-6-7（其可获自保藏的杂交瘤细胞（克隆）DSM ACC3121），测试了对人β1-肾上腺素受体的第二胞外域的结合特异性。因此，测量了不同浓度的抗体23-6-7（其可获自保藏的杂交瘤细胞（克 隆）DSM ACC3121）对重组的过表达β1-AR的SF9细胞的结合并在没有任何竞争物的情况下初始测量了它的结合特性。结果示于图12，其证实了上述实验并说明对于抗体23-6-7（其可获自保藏的杂交瘤细胞（克隆）DSM ACC3121）的0.43nM的结合亲和力。
为了确定23-6-7抗β1-AR抗体克隆的功能，通过顺序激活Gs蛋白和腺苷酸环化酶（AC）我们研究了其激活受体介导的细胞内环磷酸腺苷（cAMP）累积的能力。检测这种细胞内cAMP增加的一种方法是使用在融合至Epacl的cAMP结合结构域的青色荧光蛋白（CFP）和融合至Epacl的cAMP结合结构域的黄色荧光蛋白（YFP）之间的荧光共振能量转移（FRET）（Nikolaev.J Am Coll Cardiol50(2007),423-43）。在DE10 2010018 878Al中描述了通过使用共振能量转移（FRET）技术来确定细胞内cAMP增加的装置和方法。添加克隆23-6-7明显地激活了稳定表达人β1-AR的HEK293细胞，如通过利用这种FRET分析所确定的（图12（B）），具有慢动力学，如通常由来自DCM患者的抗β1-AR自身抗体所施加的（图12（C））。相反，阴性对照抗体是无效的（图12（A））。
因此，考虑到可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞（杂交瘤）的抗体与β1-肾上腺素受体抗体克隆的高结合亲和力，使用其可以可靠地进行竞争测定。
另外，还用GST-β1-ECII融合构建体免疫了大鼠和山羊（参见实施例1.1），其由此产生了结合至人β1-肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR-ECII）的抗体。在大鼠的情况下，还通过杂交瘤细胞系法产生了单克隆抗体13F6（参见实施例1.3）。用β1-AR-ECII肽通过亲和层析法纯化多克隆山羊抗体（参见实施例1.4）。在图3和图4中示出用小鼠23-6-7、大鼠单克隆抗体和山羊多克隆抗体获得的结果的比较。
总之，如从本发明的图3和图4显而易见的是，由杂交瘤细胞克隆23-6-7（如以登录号DSM ACC3121保藏的）生产的小鼠单克隆抗体以最高的亲和力结合至人β1-AR（在SF9细胞中表达），接着是大鼠单克隆抗体13F6和山羊多克隆抗体。和大鼠单克隆抗体13F6和山羊多克隆抗体的比较中，小鼠单克隆抗体23-6-7的0.41nM的EC50值低10倍以上。此外，在将0.1%吐温加入分析孵育和洗涤缓冲液以后，测量了信号强度，相应 地OD值增加。然而，除去去污剂吐温20的，由于非常低的信噪比，对于人自身抗体的竞争测量是不充分的。
为了证明抗体23-6-7对于在SF9细胞中过表达的重组β1-AR的结合特异性，我们添加了18-聚体肽（环(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln)；SEQ ID NO:16），其对应于人β1肾上腺素受体的第二胞外环（β1-AR ECII环）的核心区，以竞争抗体结合。结果示于图6，其示出在低纳摩尔范围内的IC50浓度。
实施例5：酶联免疫测定（ELISA）
5.1细胞ELISA测定
在室温下，用补充有3%奶粉的200μl PBS-T（PBS Dulbecco（Cat No.LI820,Biochrom AG）+0.1%吐温20）封闭PFA固定的细胞1小时。此后，用PBS-T洗涤平板三次。在0.1%吐温20和3%BSA（牛血清白蛋白）存在下，以血清0.26nM的固定浓度添加获自杂交瘤融合法的，即杂交瘤细胞克隆23-6-7的（参见上述的实施例1）小鼠单克隆抗β1-AR抗体，然后，在0.1%吐温20存在下，通过添加分别来自健康志愿者或来自DCM患者的人血清（1:10稀释）来竞争结合。在第一系列的实验中，研究了来自82位DCM患者的血清和获自健康志愿者的43份血清（参见实施例5.3），如在图7至图9中所示出和说明的。
由也用于竞争的限定浓度（760nM）生产的单克隆大鼠抗体13F6来提供阳性对照样品，上述单克隆大鼠抗体13F6可获自以DSM ACC3174保藏的杂交瘤细胞（克隆）（参见上述实施例1）。在室温和持续振摇下孵育2小时以后，用PBS-T洗涤细胞三次并添加二抗（Dianova,目录号715-035-151）溶液（1:5000稀释在PBS-T+3%奶粉中）。在室温下孵育平板l小时。在用PBS-T的四次进一步洗涤步骤以后，在20℃下，由100μl TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物溶液来可视化结合在复合物中的过氧化物酶。在用100μl的1M硫酸停止酶促反应以后，在450nm处，以及在595nm的参比波长处确定产生的颜色的强度。颜色强度与样品中的人抗β1受体抗体的量成反比。
将由小鼠单克隆抗体23-6-7（以登录号DSM ACC3121保藏的）引起的光密度（OD）信号（表达人β1-AR的Sf9细胞）减去相应的OD本底 信号（对照细胞）记分为100%，并重复确定每种血清的抑制能力。计算了每种血清的至少3次独立实验的平均值以及SEM。
各组之间的差异是强烈显著性的（对于DCM与健康对照，p<0.00005）。通过超声波心动描记法已研究了患有特发性扩张型心肌病的患者（DCM患者）并通过具有小于45%的射血分数来表征。另外，通过侵入性导管检查，已排除了冠心病。没有已知心脏病的受试者作为对照（健康志愿者）。患有特发性扩张型心肌病的测试患者（DCM患者）的总数是82位而健康志愿者（不患有任何已知心脏病）的总数是43位。确定测定截止值以分类自身β1-肾上腺素能抗体阳性（AR自身抗体阳性）和自身β1-肾上腺素能抗体阴性（AR自身抗体阴性）。大于65%的抑制，如果重复测量结果的95%置信区间还超过该值，则被认为是阳性的。
利用此值，健康对照组的仅一位个体（1/43）（等于2.33%）被认为是阳性的。相比之下，40.24%的DCM患者（33/82）被认为是抗β1-AR自身抗体阳性的。为了分别进行每个DCM患者或健康对照的抑制能力（%）的总结，以直方图绘制了结果（图9）。
5.1.1基于细胞的β1-AR竞争测定
根据标准的细胞培养方案，以粘附培养来生长Sf9（草地贪夜蛾，ATCC登录号CRL1711）细胞（关于培养的详情，参见上述的项目实施例4）。在3-4天的生长以后，当它们已达到约70-100%汇合时，使细胞脱离培养烧瓶。此后，将它们离心（400x g，5分钟）并重悬浮在细胞培养基中。用携带用于人β1-AR的基因的杆状病毒（MOI6）感染悬浮细胞。无转基因杆状病毒作为对照。以30,000个细胞/孔的密度将细胞悬浮液直接接种于聚L-赖氨酸涂覆的96孔细胞培养板（Biocoat,#356516）。孵育72小时以后，除去一半的细胞培养上清（200μl/孔）并添加100μl2x PFA固定液（2%PFA，在最终溶液中）。在室温下并在不断摇晃下，孵育细胞15分钟。随后除去上清并用PBS（PBS Dulbecco（目录号LI820,Biochrom AG）+0.1%吐温20（PBS-T）洗涤固定的细胞三次。可选地，在-80℃下冷冻微量滴定板长达至6个月。
在室温下用200μl PBS-T+3%奶粉封闭PFA固定的细胞1小时。此后，用PBS-T洗涤平板三次。添加可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞的小鼠单克隆抗β1-AR抗体23-6-7，然后通过添加分别来自健康志愿 者或来自DCM患者的人血清竞争23-6-7结合。通过限定浓度的单克隆大鼠抗β1-AR抗体13F6（其可获自保藏号为DSM ACC3174的宿主细胞）提供阳性对照样品，其还用于竞争。在室温和持续振摇下孵育2小时以后，用PBS-T洗涤细胞三次并添加二抗溶液（1:5000，在PBS-T+3%奶粉中）。在室温下孵育平板1小时。在进一步的洗涤步骤（用3x PBS-T）以后，通过TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物溶液来可视化结合在复合物中的过氧化物酶。在用硫酸停止酶促反应以后，在450nm处，以及在595nm的参比波长处，确定产生的颜色的强度。
将人样品，NC（来自健康志愿者的血清）和PC（掺加有抗β1-AR大鼠13F6抗体的来自健康志愿者的血清）的竞争效力分别计算为小鼠抗体（23-6-7）结合的百分比抑制。为此，将每个OD值除以鼠抗体（23-6-7）值，乘以100，并从100中减去得到的值。
（23-6-7）小鼠抗体的OD值没有减小产生0%抑制，而完全的OD值减少则对应于100%抑制。
对于系数（K）和测定截止值的确定，进行测定验证。在基于来自20位健康志愿者的血清分析的三次独立的实验中，通过使用方程式（1、2、3）获得系数（K）=0.143。
抑制%筛查截止=平均抑制%行数据（对照样品）+2x SD    （1）
Ki=（抑制%筛查截止i-平均抑制%Nci/平均抑制%Pci    （2）
K=（K1+K2+K3）/3    （3）
Ki（i=1至3）的确定是基于具有20个空白单独样品的三个平板。
对于所有进一步的平板"i"，应用以下截止公式（4）：
抑制%截止i=平均抑制%NCi+K(0.143)x平均抑制%Pci    （4）
这种抑制%截止计算的方式避免了分析在每个平板上的大量的单独空白样品的必要性。
为了调节来自不同平板的抑制%行数据（样品），必须考虑到各自的抑制%截止。
抑制%=平均抑制%行数据（样品）-抑制%截止    （5）
该假设是：通过与来自患有与人β1-肾上腺素受体相关疾病的患者（例如，患有DCM的患者；参见图11中的示意性总结）的血清的共同孵育将改变单克隆抗β1-AR抗体23-6-7（其可获自以DSM ACC3121保藏的杂交瘤细胞（克隆））与过表达β1-AR的SF9细胞的结合。取决于在相应样品中抗β1-AR抗体的存在，应该发生可获自保藏号为DSM ACC3121的宿主细胞的23-6-7抗体的结合的竞争性减少。为了阐明添加这种人血清池对测定的影响，还以相同的测定方法在对照缓冲液中添加多克隆山羊抗β1-AR抗体。图13示出对于两个条件的竞争曲线的高度相似性（关于剂量依赖性和最大信号）。为了验证此测定，由来自健康志愿者的血清池构成的阴性对照被视为是必要的。当使用多克隆羊抗β1-AR抗体用于竞争时，在10nM下确定了测定灵敏度。
5.1.2确认β1-AR ELISA
为了保证测定间（inter-assay）的可比较性，对每个微量滴定板测量由来自健康志愿者的汇集的人血清样品构成的阴性对照样品（NC），和由掺加有大鼠抗β1-AR抗体13F6（其可获自以DSM ACC3174保藏的杂交瘤细胞（克隆））的人血清池构成的阳性对照（PC）。由于它的可重现的可用性，我们使用了单克隆大鼠13F6抗体（其可获自以DSM ACC3174保藏的杂交瘤细胞（克隆））而不是多克隆山羊抗β1-AR抗体。
为了分类人血清样品的抑制（%），考虑平板特定抑制%截止。在单次测定之间的响应会变化，因此相应地改变截止值。使用阴性对照加上预定系数（K）来评估在每次测定中的截止值使得能够校正随着时间的推移非特异性结合（NSB）的变化。在截止公式中另外使用阳性对照使得甚至能够更好的归一化，由于仅阳性对照的OD值能够评估测定灵敏度。
测定截止点值：基于测定的非特异性背景的水平和那些基质样品（针对其检测阳性响应）的响应统计地确定截止值。在三次独立的实验中，检查了来自20位健康志愿者的血清样品。计算平均值+2.0x SD以确定截止。为了解释在单次测定之间的一些较小的变化，通过乘以特定的归一化因子（其确定自预研究确认数据）计算调整后的截止值。
灵敏度：将测定灵敏度确定为浓度，在该浓度下抗体制剂产生等于截止值的测定读数。由于到目前为止不可能充分地由患者血清来纯化人抗 β1-AR抗体，所以通过使用多克隆山羊抗β1-AR抗体（如上文在项目5.1.1下所述的）来确定测定灵敏度。在大约10nM下确定截止值。
回收：为了确定回收，以760nM的测定浓度将来自健康志愿者的20份血浆样品掺加大鼠13F6抗β1-AR抗体（其可获自以DSM ACC3174保藏的杂交瘤细胞（克隆））。所有20个样品显示具有2.54%的平均变异系数（CV）的高于截止点值的抑制值，因而完全满足回收的标准。
精确度：通过使用确认样品（VS）和阳性对照（PC）（两者分别以253nM和760nM的测定浓度掺加有大鼠13F6抗体）评价测定内（intra-assay）（再现性）和测定间（中间精确度）可变性。在每个平板上使用四次重复，其是在三个不同的日期进行。分别地，对于VS，我们测得4.8%的平均测定内CV和16.2%的测定间CV，以及对于PC，我们测得3.6%的平均测定内CV和15.4%的测定间CV。
在三个独立测量中，测量167个人DCM血清样品和110名年龄匹配的志愿者的样品产生对于患者组14.4%的平均测定间CV，和对于对照组的16.9%的平均测定间CV。
稳定性：对于VS研究了储存条件和血液血清样品稳定性。在22℃下3小时或在4℃下16小时的储存对大鼠13F6和抗β1-AR抗体的测量没有负面影响并产生95.1%和92.3%的回收（相比于无张力（unstressed）VS）。同样重复三次的冻结/解冻循环对VS的结果没有影响。
另外，在全血样品中分析了抗β1-AR抗体检测的稳定性。将10个DCM样品，对于抗β1-AR抗体其被测试为阳性，存储在20℃下20小时并再次分析。确定了94.7%（SD±10.4）的回收，从而显示与在血清中的稳定性可比的在全血中的高抗体稳定性。
5.1.3DCM患者与志愿者的筛查结果
分析了在具有<45%的左心室舒张期末体积（LV-EF）的167位DCM患者和110位在血液采样以后其报告没有已知的心脏病的年龄匹配的志愿者中抗β1-AR抗体的存在。
已经通过超声波心动描记法研究了167位DCM患者（参考图14（A）和14（B））并且特点在于具有小于45%的射血分数。将来自当地血液供体库的严格年龄匹配的受试者（n=110）的血清作为对照。在血液采样以 后，所有这些对照受试者（n=l10）没有报告心血管病。平均患者年龄是60.9+11.2岁，在志愿者组中其并没有显著差异（双尾t检验）。
通过应用在上述项目5.1.2下确定的标准参数，在DCM组中，对于相关的抗β1-AR抗体，这些样品的62.2%被鉴定为阳性的，而在年龄匹配的对照组中则仅为8.2%（图14A）。
从图8和9与图14（A）的比较而显而易见的（假）阳性对照受试者的不同的患病率涉及以下事实：在本研究中研究的健康受试者的对照组（其构成图7至9所示结果的基础）相比于患病的DCM组（其构成图14（A）所示的结果的基础）并不是年龄匹配的。在图7至9中呈现的这些对照受试者明显比患病群体年轻。
在图14（A）中示出的数据涉及在年龄匹配的基础上系统地比较健康受试者对照组的方式。许多研究者（例如，Effors B.Stress,immunity and aging.Marcel Dekker,New York,NY,1984）已发现，在健康受试者的对照组中，假阳性的生物标志物的数量随着所研究的对照群体的年龄的增加而显著增加。
5.1.4ICM患者与志愿者的筛查结果
在血液采样以后，分析了在患有由严重冠状动脉疾病引起的"缺血性心肌病"患者（ICM患者）（n=156）和110位年龄匹配的志愿者（其没有报道已知的心脏病）中抗β1-AR抗体的存在。
通过超声波心动描记法检查已研究了在构成图14（C）的基础的研究中所使用的由严重冠状动脉疾病引起的"缺血性心肌病"患者（ICM患者）并且其特点在于具有小于45%的左心室射血分数（LV-EF）。另外，已通过侵入性导管检查证实了冠心病。没有已知的心脏病的受试者作为对照（健康志愿者）。
在ICM组中，通过应用在上述项目5.1.1和5.1.2下确定的标准参数，和年龄匹配的对照组相比，对于相关的抗β1-AR抗体，ICM组的显著更大数量的样品被鉴定为阳性的（图14（C））。
5.1.5比较未改变的血清和相应的抗体耗尽血清部分的抑制效应
为了证明在基于细胞的ELISA中确定的抑制值实际上归因于IgG抗体，通过蛋白G琼脂糖凝胶消除IgG免疫球蛋白来耗尽20份抗β1-AR抗体阳性DCM血清。收集来自每个血清样品的流穿液（flow-through）并通过细胞ELISA比较负荷（未经处理的血清）来分析。已观察到，在所有研究的抗体耗尽样品中，ELISA确定的抗β1AR滴度完全消失（正常平均抑制%从13.1%减小到-31.1%；图15）。
5.2基于肽的ELISA测定
用于在人血清中确定自身抗β1-肾上腺素能抗体的一种广泛使用的方法是基于肽的ELISA测定。在这种基于肽的ELISA测定系统中，在室温下，用10μg/ml的26聚体肽（His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg；SEQ ID NO:17）（其对应于人β1受体的第二胞外环的氨基酸序列（残基197-222））在0.1M Na2CO3中的溶液来涂覆微量滴定板（Nunc微量滴定最大吸附板）1小时。在用3%奶粉补充的PBS-T（PBS Dulbecco（目录号LI820,Biochrom AG）+0.1%吐温20）饱和孔以后，在相同的缓冲液（PBS-T+3%奶粉）中分别1:20稀释来自健康志愿者或来自DCM患者的人血清，并加入孔中。在4℃下孵育16小时以后，通过用过氧化物酶（Dianova,目录号109-035-088）标记的二级抗人IgG抗体（1:5000稀释在PBS-T+3%奶粉中）来检测结合的抗体。在每个步骤之间，进行3x PBS-T洗涤程序。此后，将100μl的TMB底物（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）溶液分配到所有孔中。覆盖平板并在20℃下孵育10-30分钟。通过向所有孔添加100μL停止液（1M硫酸）终止酶反应。在450nm处读取吸光度（参考滤光片650nm）。颜色强度的减小与样品中人β1-受体抗体的量直接相关。
进行基于肽的ELISA方法以阐明这种ELISA测定作为诊断工具的潜力。主要焦点集中于健康志愿者与DCM患者的相对表现。
通过超声波心动描记法已研究了特发性扩张型心肌病患者（DCM患者；n=82）并且特点在于具有小于45%的射血分数。另外，通过侵入性导管调查已排除冠心病。没有已知的心脏病的受试者作为对照（健康志愿者；n=43）。由图1显而易见的是在DCM患者和健康志愿者（对照组）中，观测到相同百分比的自身抗β1-肾上腺素能受体抗体。
变化到更低或更高截止比率并不显著改变结果（数据未示出）。这种高百分比的抗体阳性健康受试者并不是预期的并且可以通过（一种或多种）自身抗β1-肾上腺素能受体抗体的部分假阳性测定来解释。由这些发现，本发明者得出这样的结论：在固定在微量滴定板上以后，肽的构象可能并不反映人β1-肾上腺素受体EC II环的天然结构。肽的人工折叠可能产生可以是非特异性抗体结合原因的新表位。在类似的方法中，通过亲和柱纯化人血浆样品。为此，将相同的26聚体肽（His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg（SEQ ID NO:17））连接至CNBr-活化的琼脂糖凝胶4B（GE Healthcare,目录号17-0430-01）。根据制造商的说明进行纯化。然后在基于肽的ELISA测定中分析预纯化抗体级分，其中在DCM患者和健康志愿者之间没有观测到显著差异（数据未示出）。
5.2.1基于肽的ELISA测定
通过使用来自167位呈现左心室舒张期末体积（LV-EF）<45%的DCM患者和110位年龄匹配的志愿者（其在血液采样以后报告没有已知的心脏病）以及年龄匹配的对照组的，在基于细胞的SF9β1-AR ELISA测定中所使用的（如在上述项目5.1.3下描述的）相同的血清样品。
在4℃下，用在0.1M Na2CO3或仅缓冲液中的0.5g/ml肽，26聚体肽（His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg；SEQ ID NO:17）涂覆Nunc微量滴定最大吸附板16小时。在用以3%奶粉和0.1%吐温20补充的PBS饱和孔以后，在PBS-T+3%BSA+10%FCS中，分别1:20稀释来自健康志愿者或来自DCM患者的人血清并加入孔。在室温下孵育2小时以后，通过用过氧化物酶标记的1:20000稀释在PBS-T+3%奶粉中的二级抗人IgG抗体检测结合的抗体。在每个步骤之间，用PBS-T洗涤平板三次。此后，将100μl的TMB底物（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物溶液分配到所有孔。覆盖平板并在室温下孵育10-30分钟。通过向所有孔添加100μL停止液（1M硫酸）终止酶反应。在450nm处读取吸光度（参考滤光片650nm）。颜色强度的减小与样品中人抗β1受体抗体的量直接相关。强阳性被定义为1.5倍的背景强度。
如图14B所示，观测到29.9%抗β1-AR抗体阳性DCM患者与在对照组中的35.5%阳性结果。
如上文在项目5.1.3下所解释的，在基于细胞的ELISA测定中，通过使用来自167位DCM患者和健康对照组（n=110）的相同的血清样品，利用相同截止值（参见图14A和14B）在约60%的DCM患者中以及在约8%的健康志愿者（对照组）中检测到抗β1-AR抗体。在通过蛋白G吸附耗尽血清的IgG抗体以后，不再检测到抗β1-AR抗体滴度（定义为BIMAb结合的抑制）（参见图15）。因此，由基于细胞的ELISA测定获得的结果明显不同于产生大量的假阳性结果的用源自第二胞外β1-AR环的线性26聚体肽进行的基于肽的ELISA测定，从而排除DCM患者的任何具体鉴定。
5.4数据分析
通过使用来自Sigma plot软件，版本11的标准曲线分析（'四参数逻辑'）来计算IC50值。用EXCEL软件，版本2003/2007进行所有其他计算。



















PCT/RO/134表