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1、(10)申请公布号 CN 102507395 A (43)申请公布日 2012.06.20 CN 102507395 A *CN102507395A* (21)申请号 201110309068.4 (22)申请日 2011.10.13 G01N 15/00(2006.01) (71)申请人 东南大学 地址 211189 江苏省南京市江宁开发区东南 大学路 2 号 (72)发明人 孔婧琳 吴宏文 孙峰 易红 刘全俊 (74)专利代理机构 南京天翼专利代理有限责任 公司 32112 代理人 周静 (54) 发明名称 实时监测溶液中病毒颗粒的方法 (57) 摘要 本发明涉及实时监测溶液中病毒颗粒的方。
2、 法， 可以实现快速检测病毒颗粒。 所述实时监测溶 液中病毒颗粒的方法为， 在偏置电压作用下， 使包 含病毒颗粒的样品溶液通过纳米孔， 检测电信号， 通过与包含标准病毒的溶液通过纳米孔时获得的 电信号相比， 确定样品溶液中包含病毒颗粒的信 息。 优选， 通过与包含标准病毒的溶液通过纳米孔 时获得的电信号的幅度、 持续时间、 时间分布、 频 率、 电信号波形特性或相位特性中的至少一种相 比， 确定样品溶液中包含病毒颗粒的信息。 本发明 具有动态实时、 高灵敏度、 高通量的特点， 满足环 境中病毒计数、 分类及实时分析等工作的要求。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图。
3、 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种实时监测溶液中病毒颗粒的方法， 其特征在于， 在偏置电压作用下， 使包含病毒 颗粒的样品溶液通过纳米孔， 检测电信号， 通过与包含标准病毒的溶液通过纳米孔时获得 的电信号相比， 确定样品溶液中包含病毒颗粒的信息。 2. 如权利要求 1 所述的实时监测溶液中病毒颗粒的方法， 其特征在于， 所述样品溶液 中包含病毒颗粒的信息为包含病毒颗粒的种类、 数量或状态中的至少一种信息。 3. 如权利要求 1 所述的实时监测溶液中病毒颗粒的方法， 其特征在于， 通过。
4、与包含标 准病毒的溶液通过纳米孔时获得的电信号的幅度、 持续时间、 时间分布、 频率、 电信号波形 特性或相位特性中的至少一种相比， 确定样品溶液中包含病毒颗粒的信息。 4.如权利要求1或2所述的实时监测溶液中病毒颗粒的方法， 其特征在于， 所述纳米孔 尺寸为 100-250nm。 5. 如权利要求 4 所述的实时监测溶液中病毒颗粒的方法， 其特征在于， 所述纳米孔经 偶联剂分子、 DNA 单链或双链分子、 RNA 分子、 PNA 分子或蛋白质分子表面修饰。 6. 如权利要求 5 所述的实时监测溶液中病毒颗粒的方法， 其特征在于， 所述纳米孔经 病毒抗体表面修饰。 7.如权利要求1或2所述的实。
5、时监测溶液中病毒颗粒的方法， 其特征在于， 所述包含病 毒颗粒的样品溶液通过纳米孔之前， 通过亚微米级滤器进行预处理。 权 利 要 求 书 CN 102507395 A 2 1/3 页 3 实时监测溶液中病毒颗粒的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种实时监测溶液中病毒颗粒的方法。 背景技术 0002 病毒在众多微生物中个体最小、 结构特殊、 致病性强。 广泛存在于空气， 水， 土壤以 及人体血液， 体液， 粪便中， 对公共卫生造成极大威胁。以水环境为例， 目前已发现的 700 多 种介水传播病毒中， 轮状病毒、 肝炎病毒和肠道病毒占主导， 可引起腹泻、 肝炎等多种病症。 其中， 轮状病毒每。
6、年导致114亿例腹泻， 在发展中国家每年导致87万例死亡Albert， M.J.， et al.， Bangladesh.Journal of clinical microbiology， 1999.37(11) ： p.3458。 A型和E 型肝炎病毒的传染通常与不合格供应的水有关， E 型肝炎在孕妇中尤其严重， 其死亡率高达 25 Aggarwal， R.andK.Krawczynski， Jou rnal of gastroenterology and hepatology， 2000.15(1) ： p.9-20。 2004年， 我国四川省因饮用水污染暴发传染病流行， 123名学生罹患。
7、 甲肝 任金法 . 中国卫生检验杂志， 2009(004) ： p.942-944。由此可见， 病毒对人体危害巨 大， 污染水源会对公共卫生造成极大威胁。而存在于血液中的肝炎病毒， HIV 病毒等， 以及 存在于空气中的流感病毒， 风疹病毒等同样会对人的健康造成影响。为了保障环境及人体 的卫生安全， 实时检测各类环境中的病毒的方法及小型便携设备成为临床和日常生活中的 迫切需求。 0003 目前临床常用的病毒检测方法包括 ： 电镜观察， 电泳分离以及间接酶联免疫法 (ELISA)， 分别从病毒颗粒的大小形态， 电荷性质和表面特异性识别方面对病毒的种类、 特 点进行检测和鉴定。 然而这些方法都必须。
8、在实验室条件下进行， 且耗时较长， 未能实现实时 检测， 技术流程较为复杂， 很难进行临床推广。因此， 一种高灵敏度实时检测环境中病毒的 方法和便携设备亟待开发。 纳米孔技术， 作为新一代单分子检测的热点， 同样可以在高灵敏 度病毒检测方面得到出色的应用。 0004 在 1996 年 Kasianowicz 及 其 同 事 首 次 报 道 Kasianowicz， J.J.， et al.， Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1996.93(24) ： p.13770。
9、-13773 了单链 DNA 或 RNA 在电场作用下通过 - 溶血素 纳米孔， 并且得到分子通过孔时产生了阻塞电流 (blockade current) 的现象， 可以依次获 得每一个碱基通过纳米孔时阻塞电流幅度。 由于不同的碱基产生的阻塞电流都有相应的降 低幅度， 根据这个可以区分出四种碱基， 以获得了 DNA 或者 RNA 分子的序列成分。另外还可 以通过阻塞电流持续的时间推算出阻塞整个分子的长度。经过近几十年的不断的努力， 纳 米孔作为单分子检测的方法研究日益升温， 最主要的原因就是这种方法具有方便、 快速、 廉 价等优点。 发明内容 0005 本发明提供一种实时监测溶液中病毒颗粒的方。
10、法， 可以实现快速检测病毒颗粒。 0006 申请人经研究发现， 在病毒检测中， 病毒颗粒的粒径大小， 形状同样可以通过对阻 说 明 书 CN 102507395 A 3 2/3 页 4 塞电流大小， 信号持续时间的分析得到 ； 此外， 孔壁的特异性抗体修饰还能够实现特定病毒 种类的定向捕获， 从而与其他颗粒区别开来。 与传统的电镜观察， 电泳分离以及间接酶联免 疫法 (ELISA) 相比具有检测速度快， 操作便捷， 灵敏度高等特点， 是一种极具吸引力的病毒 检测方法。 通过这种方法， 原理上可以实现快速检测病毒颗粒， 通过病毒颗粒通过纳米孔时 形成阻塞电流的幅值和持续时间， 分辨其种类， 数量。
11、和状态。 0007 所述实时监测溶液中病毒颗粒的方法为， 在偏置电压作用下， 使包含病毒颗粒的 样品溶液通过纳米孔， 检测电信号， 通过与包含标准病毒的溶液通过纳米孔时获得的电信 号相比， 确定样品溶液中包含病毒颗粒的信息。 所述病毒颗粒优选为轮状病毒、 乙型肝炎病 毒或人类疱疹病毒。 0008 优选， 通过与包含标准病毒的溶液通过纳米孔时获得的电信号的幅度、 持续时间、 时间分布、 频率、 电信号波形特性或相位特性中的至少一种相比， 确定样品溶液中包含病毒 颗粒的信息。 0009 优选， 所述纳米孔尺寸为 100-250nm。更优选， 所述纳米孔经偶联剂分子、 DNA 单链 或双链分子、 R。
12、NA 分子、 PNA 分子或蛋白质分子表面修饰。 0010 作为本发明的改进， 所述包含病毒颗粒的样品溶液通过纳米孔之前， 通过亚微米 级滤器进行预处理， 滤去细菌及其他大颗粒杂质。 0011 本发明所使用的检测装置为现有技术， 包括 ： 用带有纳米孔的芯片将两个溶液池 隔开， 使得两个溶液池仅通过纳米孔导通。 在两个溶液池内各安置一个电极， 通过屏蔽导线 和数据采集与分析一起串联形成检测系统。 0012 所述实时病毒检测方法包括下述过程中的全部或部分步骤 ： 0013 样品准备 ： 将待测样品 ( 空气， 土壤， 水样中收集物的水溶液， 血液及生物体液， 分 泌物 ) 配制成氯化钾溶液， 并。
13、用亚微米级滤膜过滤。 0014 信号检测 ： 将纳米孔安装于上述检测体系中。 在电极两端加上偏置电压， 记录电信 号。 0015 结果比对 ： 以已知常见病毒溶液作为标准病毒溶液， 通过纳米孔， 检测其电信号， 得到标准病毒在不同条件下的过孔阻塞电流特征值 ( 包括阻塞电流的幅值， 持续时间， 频 率， 波形和相位 )。将所得结果进行统计分析， 确定未知样品中特定病毒的有无及数量。 0016 本发明具有动态实时、 高灵敏度、 高通量的特点， 满足环境中病毒计数、 分类及实 时分析等工作的要求。 附图说明 0017 图 1 示出固体纳米孔立体图 (1a) 和中心剖视图 (1b) ； 0018 图。
14、 2 示出与滤器装置相连的检测器件示意图 ； 0019 图 3 示出固态纳米孔用于生物传感检测的系统示意图 ； 0020 图 4 示出纳米孔病毒检测方法检测水体中轮状病毒的实验结果 ； 0021 图 5 示出纳米孔病毒检测方法检测水体中乙型肝炎病毒的实验结果 ； 0022 图 6 示出人类疱疹病毒通过 EBV-Ab 修饰纳米孔时的电流信号图。 0023 其中， 1 ： 纳米孔 ； 2 ： 氮化硅薄膜 ； 3 ： 带有纳米孔的芯片 ； 4 ： 电极 ； 5 ： 电解质溶液 ； 6 ： 亚微米级滤器 ； 7 ： 信号采集分析系统。 说 明 书 CN 102507395 A 4 3/3 页 5 具体。
15、实施方式 0024 实施例 1 0025 水体中主要病毒的检测方法 ： 0026 样品准备 ： 分别将 0.0745g 氯化钾加入 10ml 超纯水， 10ml 目标病毒标准品 ( 如轮 状病毒， 乙型肝炎病毒 ) 和 10ml 待测水样中， 配置成 100mM 的氯化钾溶液 A， 标准病毒液 B 和待测样液 C。以 220nm 滤膜分别过滤两种液体， 滤去细菌及其他大颗粒杂质。 0027 装置 ： 用带有直径100nm纳米孔1的芯片3将两个溶液池隔开， 使得两个溶液池仅 通过纳米孔导通。 在两个溶液池内各安置一个电极4， 电极通过屏蔽导线数据采集与分析系 统 7 相连。 0028 标准品测试。
16、 ： 室温条件下， 在芯片两侧的腔内分别加入 50l 氯化钾溶液和轮状 病毒标准病毒液， 插入电极， 与数据采集系统连接， 关好屏蔽箱。调整电极施加的偏置电压 为 200mV， 记录标准病毒过孔阻塞电流的幅值， 持续时间， 频率， 波形， 作为判定此种病毒的 标准。以轮状病毒和乙型肝炎病毒为例， 两种病毒过孔时电流信号如图 4 和图 5 所示。其 阻塞电流幅值， 持续时间及波形形状都具有明显的差别。 0029 检测过程 ： 室温条件下， 在芯片两侧的腔内分别加入 50l 氯化钾溶液和样液， 插入电极， 与数据采集系统连接， 关好屏蔽箱， 采集并准确记录标准病毒过孔阻塞电流的幅 值， 持续时间，。
17、 频率， 波形和相位特征， 并进行统计分析， 最终得到不同病毒的过孔阻塞电流 特征。 0030 因此， 水样中的各种目标病毒都可以被准确快速的检测出来。 0031 实施例 2 0032 经修饰纳米孔特异性识别人类疱疹病毒 0033 纳米孔修饰 ： 把带有直径 200nm 的芯片放在干燥洁净的 10ml 试管中， 取 4ml piranha 溶液 (75mL 浓硫酸 (98 ) 和 25mL 双氧水溶液 (30 ) 加入试管中， 用枪头小 心搅拌， 但不要接触芯片， 置于 100水浴加热 10-15min。清洗完毕后， 将芯片浸入 2 APTS(3- 氨基丙基三乙氧基硅烷 ) 溶液中， 室温结合。
18、 30min。取出芯片， 用甲醇， 超纯水多次 清洗。随后， 将芯片置于 0.5ml 活化缓冲液 (0.1M MES， 0.5M NaCl， pH 6.0) 中， 加入 0.2mg EDC， 0.3mg NHS， 反应 30min 后， 将 0.5ml pH7.2 的磷酸盐缓冲液加入其中， 5min 后加入 0.1M 人类疱疹病毒抗体 EBV-Ab。通过氨基与氨基酸残基的羧基反应， 结合于芯片纳米孔 内。 0034 样品准备 ： 取待测唾液样本 A( 含有 EBV)， 加入轮状病毒的唾液样品 B( 不含 EBV， 含有轮状病毒)和对照唾液样本C(不含有EBV和其他病毒)1ml， 分别与9ml 。
19、100mM氯化钾 溶液混匀。以 220nm 滤膜分别过滤两种液体， 滤去细菌及其他大颗粒杂质。 0035 检测过程 ： 室温条件下， 在芯片两侧的腔内分别加入 50l 氯化钾溶液和样液， 插入电极， 与数据采集系统连接， 关好屏蔽箱， 采集并准确记录标准病毒过孔阻塞电流的幅 值， 持续时间， 频率， 波形和相位特征， 并进行统计分析， 最终得到不同病毒的过孔阻塞电流 特征。人类疱疹病毒通过 EBV-Ab 修饰孔过程电流信号如图 6 所示。结果显示， 只有存在 EBV-Ab特异性识别的抗原病毒EBV时， 才会出现阻塞电流持续下降的现象。 通过这种方法， 可以实现病毒的准确快速检测。 说 明 书 CN 102507395 A 5 1/3 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102507395 A 6 2/3 页 7 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102507395 A 7 3/3 页 8 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102507395 A 8 。