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肺炎球菌性肺炎的严重度判定方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104246503 A (43)申请公布日 2014.12.24 CN 104246503 A (21)申请号 201380017629.0 (22)申请日 2013.03.29 2012-081038 2012.03.30 JP G01N 33/569(2006.01) G01N 33/53(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人大塚制药株式会社地址日本东京都 (72)发明人福岛喜代康田中裕美 (74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司 11227 代理人金世煜苗堃 (54。

2、) 发明名称肺炎球菌性肺炎的严重度判定方法 (57) 摘要本发明提供一种使用受试者的血液，能够更客观且迅速地判定肺炎球菌性肺炎的严重度的方法。是以从受试者采取的血液中有无肺炎球菌抗原和选自血中C反应性蛋白质浓度(CRP)、白血球数 (WBC) 和血中尿素氮浓度 (BUN) 的 1 种以上的生化检查值为指标的肺炎球菌性肺炎的严重度的判定方法。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.09.28 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/JP2013/059564 2013.03.29 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/147173 J。

3、A 2013.10.03 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 10 页附图 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书10页附图10页 (10)申请公布号 CN 104246503 A CN 104246503 A 1/1 页 2 1. 一种肺炎球菌性肺炎严重度判定方法，其特征在于，以从受试者采取的血液中有无肺炎球菌抗原以及选自血中C反应性蛋白质浓度即CRP、白血球数即WBC和血中尿素氮浓度即 BUN 中的 1 种以上的生化检查值作为指标。 2. 根据权利要求 1 所述的判定方法，其中，肺炎球菌抗原是阳性且生化。

4、检查值为以下的情况时，评价为严重或超严重， CRP ： 10mg/dL 以上 WBC ： 10000 个 /mm3以下 BUN ： 20mg/dL 以上。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，肺炎球菌抗原是选自C-多糖抗原、荚膜抗原和细胞膜多糖抗原中的 1 种以上。 4. 根据权利要求 1 3 中的任意一项所述的方法，其中，一同评价肺炎球菌性菌血症。权利要求书 CN 104246503 A 2 1/10 页 3 肺炎球菌性肺炎的严重度判定方法技术领域 0001 本发明涉及利用受试者的血液判定肺炎球菌性肺炎的严重度的方法。背景技术 0002 作为社区性肺炎、下。

5、呼吸道感染症的病原菌，肺炎球菌 (S.pneumoniae) 是检测频度最高的菌，不仅在日本在全世界范围内也是罹患率、死亡率高的病原菌之一。肺炎球菌感染症，不仅频度高，而且易于严重化，因此尽可能在早期确定病原菌，选择确切的治疗药，在预后的改善、医疗成本的削减、预防耐药菌出现的方面是重要的。 0003 肺炎的诊断，一般基于临床症状、身体观察结果、一般检查观察结果、胸部 X 线照片等综合进行，被诊断为肺炎患者后继续按照 “成人社区获得性肺炎诊疗指南” ( 非专利文献 1) 示出的 A-DROP 系统进行严重度的判定，基于该结果来选择门诊治疗、入院治疗、。

6、 ICU 治疗。其中， A-DROP 系统是用 1) 男性 70 岁以上、女性 75 岁以上， 2)BUN 是 21mg/dL 以上或存在脱水， 3)SpO2是 90以下 (PaO2为 60Torr 以下 )、 4) 存在意识障碍， 5) 血压 ( 收缩期 )90mmHg 以下的 5 个指标中的符合数量来确定严重度的系统 ( 参见图 1)。 0004 接下来，其后，进行致病菌检查，根据检出的致病菌确立治疗方针。但是，由于判明利用培养检查的致病菌的鉴定和药剂敏感性检查的结果需要数日，因此，最近，在初期从咯痰、鼻咽拭子或者尿等使用对肺炎球菌抗原特异的抗体的诊断药( “R。

7、APIRUN(注册商标)肺炎球菌” ( 大冢制药株式会社 )、“RAPIRUN( 注册商标 ) 肺炎球菌 HS( 中耳副鼻腔炎 )” ( 大冢制药株式会社 )、“BinaxNOW( 注册商标 ) 肺炎球菌” (Alere Medical 株式会社 ) 进行迅速检查，在早期确立治疗方针。 0005 此外，报道有发现肺炎中以 10的频度伴有菌血症的并发，特别是肺炎球菌中达到60以上，因此，检出血液中的菌变得重要。作为血液中的菌的检测法，可举出血液培养、 RT-PCR 法、抗原检查。血液培养在肺炎中尽可能被实施，但是获得检查结果需要花费时间，与RT-PCR相比较检出率低。

8、，仅为20左右，需求紧急性时，不能说是有效的方法。 RT-PCR的检出率高，但是需要专用的器械，而且昂贵，因此在临床上未得到实现普及。关于抗原检查，在原理上用ELISA等检出血清中的C-多糖抗原(C-ps)等的报道(非专利文献2、 3)、但是，由于前处理法的必要性以及 ELISA 是缺少迅速性的检测法，所以现状是难以实现实用化。 0006 因此，期望将现行中仅用临床症状、生化标记物的信息来判断的肺炎的严重度的判断以及还包含致病菌的推定，能够更客观且迅速地进行的手段。 0007 现有技术文献 0008 非专利文献 0009 非专利文献 1: 日本呼吸器学会 “与呼。

9、吸器感染症相关的指南” 成人社区获得性肺炎诊疗指南 . 日本呼吸器学会、 2007.p9-12 0010 非专利文献 2:Gillespie SH,et al.1995,J Clin Pathol ； 48:803-806 0011 非专利文献 3:Coonrod JD,et al.1973,J.Lab.Clin.Med.81:778-786 说明书 CN 104246503 A 3 2/10 页 4 发明内容 0012 本发明提供一种使用受试者的血液，能够更客观且迅速地判定肺炎球菌性肺炎的严重度的方法。 0013 本发明人等对能够在初期诊断时简易且客观地判定肺炎球菌性肺炎的严重度的。

10、方法进行研究的结果发现测定患者的血液中的肺炎球菌抗原，组合该信息与特定的生化标记的测定值 ( 生化检查值 ) 时，能够良好区别通过 A-DROP 系统被判定为严重和超严重的患者和被判定为轻度和中度的患者，能够进行肺炎球菌性严重肺炎的判定。此外，根据该方法，由于测定血液中的肺炎球菌抗原，因此同时也能进行肺炎球菌性菌血症的判定。 0014 本发明是涉及下述 1) 4) 的发明。 0015 1) 一种肺炎球菌性肺炎的严重度的判定方法，其以从受试者采取的血液中的肺炎球菌抗原的有无和选自血中C反应性蛋白质浓度(CRP)、白血球数(WBC)和血中尿素氮浓度 (BUN) 的 1 种。

11、以上的生化检查值为指标。 0016 2) 根据上述 1) 所述的判定方法，其中，肺炎球菌抗原是阳性，生化检查值为以下的情况时，评价为严重或超严重， 0017 CRP ： 10mg/dL 以上 0018 WBC ： 10,000 个 /mm3以下 0019 BUN ： 20mg/dL 以上。 0020 3)根据上述1)或2)所述的方法，其中，肺炎球菌抗原是选自C-多糖抗原、荚膜抗原和细胞膜多糖抗原的 1 种以上。 0021 4) 根据上述 1) 3) 中的任意一项所述的方法，其中，一同评价肺炎球菌性菌血症。 0022 根据本发明的方法，能够将现行中仅用临床症状、生化标。

12、记物的信息来判断的肺炎的严重度、基于此而确定的治疗时的标准 ( 门诊治疗、入院治疗、 ICU 治疗 ) 的判断以及还包括致病菌的推定，更客观且迅速地进行。 0023 由此，能够在早期进行适当的抗菌剂的选择，实现预后的改善、医疗成本的削减、预防耐药菌出现。 0024 此外，根据本发明的方法，由于能够以与 RT-PCR 法相同程度的灵敏度检出血液中的肺炎球菌抗原，因此也能够同时进行肺炎球菌性菌血症的判定。附图说明 0025 图 1 是表示利用 A-DROP 系统的严重度分类和治疗场所的关系的图。 0026 图 2 是表示各个血清稀释倍率的谱线强度 ( 肺炎球菌抗原检出灵。

13、敏度 ) 的图和表。 0027 图 3 是表示各个采血法的谱线强度 ( 肺炎球菌抗原检出灵敏度 ) 的图。 0028 图 4 是表示血中肺炎球菌抗原的检出和 CRP 的组合与严重度的相关性的图。 0029 图 5 是表示血中肺炎球菌抗原的检出和 WBC 的组合与严重度的相关性的图。 0030 图 6 是表示血中肺炎球菌抗原的检出和 BUN 的组合与严重度的相关性的图。 0031 图 7 是表示血中肺炎球菌抗原的检出和中性粒细胞的组合与严重度的相关性的图。说明书 CN 104246503 A 4 3/10 页 5 0032 图 8 是表示血中肺炎球菌抗原的检出和 Na 的组合与严重度的。

14、相关性的图。 0033 图 9 是表示血中肺炎球菌抗原的检出和 Cr 的组合与严重度的相关性的图。 0034 图 10 是表示血中肺炎球菌抗原的检出和 BNP 的组合与严重度的相关性的图。具体实施方式 0035 作为本发明的方法适用的受试者可举出肺炎球菌性肺炎患者、疑似罹患肺炎球菌性肺炎的患者、疑似肺炎球菌性呼吸道感染症的患者、疑似肺炎球菌性全身感染症的患者、疑似肺炎球菌性炎症的患者以及疑似即将罹患以上述为代表的肺炎球菌性疾患的健康人等。此外，此处所谓患者不局限于人，人以外的哺乳动物也可以成为本发明的对象。 0036 从受试者采取的 “血液” 包括血液 ( 全血 )、血浆、。

15、血清。 0037 肺炎球菌抗原的测定中，优选使用血清或血浆，稀释 1 10 倍、优选稀释 2 倍使用则在提高检出灵敏度方面优选。 0038 作为本发明的方法所使用的肺炎球菌抗原，可举出细胞壁抗原 (C- 多糖抗原 (C-polysaccharide ； C-ps)、荚膜抗原 (Capsular polysaccharide)、细胞膜多糖抗原 (F-antigen ； LipoTeichoic acid/Teichoic acid) 等，其中优选 C-ps、荚膜抗原、细胞膜多糖抗原，更优选同时测定检出 C-ps、荚膜抗原和细胞膜多糖抗原。 0039 本发明的方法中，。

16、测定血液中有无该肺炎球菌抗原，而测定包含定量的或非定量的测定。作为非定量的测定，例如，可举出单纯进行肺炎球菌抗原是否存在的测定、肺炎球菌抗原是否以一定量以上存在的测定、将肺炎球菌抗原的量与其他试样 ( 例如，对照组试样等 ) 进行比较的测定等。作为定量的测定可举出肺炎球菌抗原的浓度的测定、肺炎球菌抗原的量的测定等。 0040 本发明中，肺炎球菌抗原为阳性是指，至少血中存在肺炎球菌抗原。 0041 作为肺炎球菌抗原的测定法，可以优选举出使用与上述肺炎球菌抗原对应的抗体的免疫学的测定法。作为与肺炎球菌抗原对应的抗体，与肺炎球菌抗原特异的结合即可，不限定抗体的来。

17、源、种类 ( 单克隆、多克隆 ) 以及形状。具体的可以使用小鼠抗体、大鼠抗体、人抗体、嵌合抗体、人型化抗体等公知的抗体。 0042 源自哺乳动物的单克隆抗体包含利用杂交瘤而产生的抗体以及产自通过基因工程手法对含有抗体基因的表达载体进行形质转换的宿主的抗体。使用基本的公知技术，将肺炎球菌抗原作为致敏抗原使用，按照常见的免疫方法将其免疫，按照通常的细胞融合法将得到的免疫细胞与公知的母细胞融合，通过常见的筛选法，筛选出单克隆的抗体产生细胞，从而制作单克隆抗体产生杂交瘤。 0043 此外，在该抗体不失去识别肺炎球菌抗原的特性的范围内，可以是抗体断片 ( 片段 ) 。

18、等低分子化抗体、抗体的修饰物等。作为抗体断片的具体例，例如可举出 Fab、 Fab、 F(ab )2、 Fv、 Diabody 等。 0044 作为针对肺炎球菌抗原的抗体的具体例，可举出属于对 C-ps 的抗体的、例如在 1)Nielsen 等， Antibodies against pneumococcal C-polysaccharide are not protective,Microbial Pathogenesis14:299-305(1993) ； 2)Gillespie 等， Detection of C-polysaccharide in serum of patie。

19、nts with Streptococcus pneumoniae bacteremia， J Clin Pathol 48:803-806(1995) ； 3)United States Patent:6824997(1997) ； 4) 说明书 CN 104246503 A 5 4/10 页 6 Ehara 等， A novel method for rapid detection of Streptoeoccus pneumoniae antigen in sputum and its application in adult respiratory tract infection，。

20、 Journal of Medical Microbiolog 57 ： 820-82(2008) 中记载的抗体，属于对荚膜抗原的抗体的、例如在 1)Coonrod 等， Detection of type-specifi c pneumococcal antigens by counterimmunoelectrophoresis.11.Etiologic diagnosis of pneumococcal pneumonia,J.Lab.Clin.Med.81.778-786(1973) ； 2)Feigin 等，Countercurrent immunoelectrophoresi。

21、s of urine as well as of CSF and blood for diagnosis of bacterial meningitis，The Journal of Pediatrics89.773-775(1976) ； 3) Ajello 等， Commercial Latex Agglutination Tests for Detection of Haemophilus influenza Type b and Streptococcus pneumoniae Antigens in Patients with Bacteremic Pneumonia，JOURNAL。

22、 OF CLINICAL MICROBIOLOGY,25(8) ； 1388-1391(1987) ； 4)Ballaed 等 ,Comparison of three latex agglutination kits and counterimmunoelectrophoresis for the detection of bacterial antigens in a pediatric populatio， Pediatr.Infect.Dis.J.6(7) ； 630-634(1987) ； 5) 小林等，肺炎球菌尿中抗原迅速检测试剂盒的社区性肺炎中有用性的研究，感染症学杂志第。

23、76 卷第 12 号； 995-1002(2002) 中记载的抗体，属于对细胞膜多糖抗原的抗体的、例如在 Hotomi 等， Evaluation of a Rapid Immunochromatographic ODK-0901 Test for Detection of Pneumococcal Antigen in Middle Ear Fluids and Nasopharyngeal Secretions.PLoS one,7(3) ； e33620(2012) 中记载的抗体。 0045 作为使用对肺炎球菌抗原的抗体的免疫学的测定法，可以使用本领域公知的任意的免疫测定方法。。

24、例示性地可举出放射免疫分析 (RIA)、 ELISA 等酶免疫分析 (EIA)、胶乳免疫比浊法 (LTIA) 和免疫色谱。在提高检出灵敏度方面，优选使用夹心法。此外，从简便性和迅速性的观点出发，优选免疫色谱。使用免疫色谱法时，能在短时间内在床边或患者就诊中就可进行诊断。 0046 作为上述免疫学的测定中使用的标记，可举出该领域使用的任意的标记。例示性的地可举出辣根过氧化酶(HRP)、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶等酶、 125I、 32P、 14C、 35S或3H 等放射性同位素 (RI)、 FITC、四甲基罗丹明异氰酸酯等荧光物质、化学发光等发光物质以及金胶体、着色。

25、胶乳粒子等可视化物质。进而也可举出使用以生物素一次标记后，使用被上述标记所标记的亲和素的致敏系统和用地高辛等低分子物质一次标记后，使用被上述标记所标记的抗体等的具有与该低分子物质亲和性的物质的检测法。 0047 本发明的肺炎球菌抗原的测定中，也可以使用市售的肺炎球菌检测试剂盒 “RAPIRUN 肺炎球菌 HS( 中耳副鼻腔炎 )” ( 大冢制药株式会社 )、“BinaxNOW 肺炎球菌” (Alere Medical 株式会社 ) 等。 0048 本发明中使用的生化检查值是选自血中 C 反应性蛋白质浓度 (CRP)、白血球数 (WBC) 和血中尿素氮浓度 (BUN) 中的 1 。

26、种以上。 0049 (1)C 反应性蛋白质 (C-reactive protein ： CRP) 0050 CRP 是在体内炎症反应或组织破坏发生时血中出现的蛋白质，其具有与肺炎球菌的 C 多糖体结合的性质。通常，作为炎症标记物被利用。 0051 CRP 在 2000 年制定的旧指南的 “成人社区获得性肺炎诊疗的基本的思考方法” 中说明书 CN 104246503 A 6 5/10 页 7 虽然被用作判定肺炎的严重度的参数，但是 2007 年制定的 “与呼吸器感染症相关的指南” 的验证中报道了其不能正确反映严重度，从而在新指南中，将其从严重度的判定项目中进行了删除 ( 参见。

27、上述非专利文献 1)。 0052 然而，通过将 CRP 与肺炎球菌抗原的检出 ( 阳性 ) 组合，能够进行肺炎球菌性肺炎的严重和超严重的判定 ( 参见实施例 3)。这种情况下的 CRP 的临界值是 10 20mg/dL。 0053 即，本发明中，作为肺炎球菌性肺炎的严重和超严重的指标的 CRP 是 10mg/dL 以上，优选为 20mg/dL。 0054 本发明中， CRP 的测定没有特别限定，例如，可举出胶乳免疫比浊法。 0055 (2) 白血球数 (WBC) 0056 已知血液中的白血球数 (WBC)，通常在细菌性感染时上升，但是严重性肺炎中由于在肺局部化，其血中。

28、浓度降低。WBC 与 CRP 同样，过去被用作判定肺炎的严重度的参数，但是，在 2007 年制定的新指南中，将其从严重度的判定项目中进行了删除 ( 参见上述非专利文献 1)。 0057 然而，关于 WBC，通过与肺炎球菌抗原的检出 ( 阳性 ) 组合，也能够进行肺炎球菌性肺炎的严重和超严重的判定 ( 参见实施例 3)。这种情况下的 WBC 的临界值是 10000 个 / mm3 6000 个 /mm3。 0058 即，本发明中，作为肺炎球菌性肺炎的严重和超严重的指标的 WBC 在健康人的分布范围内，或者在其以下时例如为 10000 个 /mm3以下，优选为 600。

29、0 个 /mm3以下。 0059 本发明中， WBC 的测定没有特别限制，例如，可举出能够进行血球计算的自动测定器。 0060 (3) 血中尿素氮浓度 (BUN) 0061 BUN 是表示源自血中尿素的氮量的参数，作为肾功能标记物被利用。 0062 已知 BUN 在脱水和异化亢进较大的严重肺炎患者中变为高值。通过与肺炎球菌抗原的检出 ( 阳性 ) 组合，能够更高精度地进行肺炎球菌性肺炎的严重和超严重的判定 ( 参见实施例 3)。此时的 BUN 的临界值可举出约 20mg/dL。 0063 即，本发明中，作为肺炎球菌性肺炎的严重和超严重的指标的 BUN，例如可举出 20mg/。

30、dL 以上。 0064 本发明中， BUN 的测定没有限制，例如，可举出脲酶 GLDH 法、脲酶 ICDH 法。其中优选使用脲酶 GLDH 法。 0065 此外，根据本发明的方法，由于测定血液中的肺炎球菌抗原，能够同时进行肺炎球菌性菌血症的判定。其中，“肺炎球菌性菌血症” 是指血液中有肺炎球菌存在。即，本发明的方法中，血液中肺炎球菌抗原是阳性，则可以推测为肺炎球菌性菌血症。以往的肺炎球菌性菌血症的判定，通过血液培养中的肺炎球菌的检出进行，但是认为血液培养不仅对于肺炎球菌，对于微生物的检出率低，近年开始使用利用 RT-PCR 的检出 (Resti 等， Com。

31、munity-Acquired Bacteremic Pneumococcal Pneumonia in Children:Diagnosis and Serotyping by Real-Time Polymerase Chain Reaction Using Blood Samples,Clinical Infectious Diseases.51(9):1042-1049(2010)。使用本发明的方法时，不使用 RT-PCR 就能够简易地进行肺炎球菌性菌血症的推测。 0066 实施例说明书 CN 104246503 A 7 6/10 页 8 0067 材料和方法 0068 在获。

32、取知情同意书的情况下从患者采取全血，将其利用常见的离心分离法或沈降法分离为血清或血浆后， -80保存。 0069 (1) 样本的调制 0070 血清是通过将血液采取到装有血清分离体的采血管，离心后而得到血清成分。血浆是通过将血液采取到 EDTA2Na 或华法林采血管，离心或者静置后，采取上清而得到的。所有样本均在 -80保存。 0071 (2) 用于肺炎球菌抗原测定的血清 / 血浆的最佳稀释率的评价 0072 血清 / 血浆的最佳稀释率的评价中使用 “RAPIRUN 肺炎球菌 HS( 中耳副鼻腔炎 )” ( 大冢制药株式会社 )。使用试剂盒附带的样本提取试剂将血清 / 血浆进行。

33、梯度稀释，求出得到最强的测试谱线强度的稀释率。应予说明，测定后的谱线，用市售数码相机摄影后，使用密度计 (ATTO 社 ) 评价其强度。 0073 (3) 肺炎球菌抗原测定 0074 使用以下示出的市售的试剂盒，测定血中肺炎球菌抗原的有无。 0075 1)RAPIRUN 肺炎球菌 HS( 中耳副鼻腔炎 )( 大冢制药株式会社 ) 0076 (2)将被判断为最佳稀释率的2倍稀释血清/血浆以150L分别注入试剂盒附带的样品杯，将测试棒 ( 试剂本身 ) 的样品应用部浸入其中，然后按照附带说明书进行测定。 0077 2)“BinaxNOWR肺炎球菌” (Alere Medical。

34、株式会社 ) 0078 1) 将调制的 2 倍稀释血清 / 血浆中浸入试剂盒附带的棉棒，然后按照附带说明书进行测定。 0079 (4) 其他测定项目 0080 1) 生化标记物 0081 将血清作为样本，用日立自动分析装置 LABOSPECT 008 测定 CRP、 WBC、中性粒细胞、 BUN、 Na、 Cr、 BNP。 0082 2) 培养 0083 为了致病菌的推定，实施血液培养和咯痰培养。各样本的培养，按照Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI，临床检查标准协会 ) 的规格进行。 0084 3)PCR 008。

35、5 按照已报道 (Ehara N,et al.2008,Journal of Medical Microbiology 57:820-826)的方法，以肺炎球菌的PspA基因为对象进行血清中的肺炎球菌PspA DNA的定量。应予说明，该设施中检出灵敏度是 200copies/gDNA。 0086 实施例 1 0087 (1) 严重度判定 0088 对使用成人社区获得性肺炎诊疗指南 ( 上述非专利文献 1) 记载的 A-DROP 系统进行了严重度判定的下述的病例，实施生化标记物和血液中肺炎球菌抗原的评价。各个严重度判定的病例数在表 1 示出。 0089 表 1 0090 说。

36、明书 CN 104246503 A 8 7/10 页 9 0091 * 非结核性抗酸菌症、支气管炎、支气管哮喘、肺气肿、脱水 0092 (2) 最佳样本浓度调整 0093 将 “RAPIRUN 肺炎球菌 HS( 中耳副鼻腔炎 )” 作为指标，用试剂盒附带的样本提取试剂，将不同的 5 种血清样品稀释为血清原液 ( 稀释倍率 1 倍 )， 2 倍， 6 倍， 18 倍后用该试剂盒测定，将谱线强度进行比较研究。各个稀释倍率的谱线强度在图 2 示出。 0094 根据图 2，所有血清样本中， 2 倍稀释中谱线强度显示最高值。应予说明，发现在血清原液中粘性高，有流速慢的趋势，。

37、认为2倍稀释(原液：样本提取液1 ： 1)，在迅速性、谱线强度方面均为最佳样本浓度。 0095 (3) 采血法间的差异 ( 样本种类 ) 0096 对采取自 1 位患者的血液，调制血清 1 种、图 3 示出的血浆 4 种，使用 “RAPIRUN 肺炎球菌 HS( 中耳副鼻腔炎 )” 评价谱线的强度。其结果一并在图 3 示出。 0097 所有的采血法 ( 血清、 EDTA-2Na 血浆、华法林血浆 )、所有的分离法 ( 离心法、静置分离法 ) 中谱线的强度是相同的，认为不受采血法、分离法的影响。因此，在以后的评价中，使用通过离心分离调整的血清。 0098 (4)。

38、各患者的血中肺炎球菌抗原的检出灵敏度和特异度 0099 对各患者的血中肺炎球菌抗原的检出灵敏度和特异度，以咯痰培养检查结果作为基准进行了计算。灵敏度是表示咯痰培养阳性例中的在各测定法中也判定为阳性的例数的比例。此外，特异度是表示咯痰培养阴性例中的在各测定法中也判定为阴性的例数的比例 ( 表 2) 0100 表 2 0101 说明书 CN 104246503 A 9 8/10 页 10 0102 发现 “RAPIRUN 肺炎球菌 HS” 和 “BinaxNOW 肺炎球菌” ，均随着肺炎的严重度的上升，灵敏度有上升的趋势，其检出率与作为高灵敏度的肺炎球菌检测法而被知的 RT。

39、-PCR 相同。 0103 实施例 2 严重、超严重病例中的解析结果 0104 而且，以被判定为严重、超严重的肺炎病例为对象，将血液中肺炎球菌抗原使用 “RAPIRUN 肺炎球菌 HS” 、“BinaxNOW 肺炎球菌” 进行测定，将其与血液 PCR 的结果进行了比较研究。其结果表明，咯痰培养中肺炎球菌所检出的严重、超严重病例的 5 例均在两试剂盒中显示阳性。此外， PCR 中除了 1 例以外的 4 例是阳性。 0105 表 3 0106 说明书 CN 104246503 A 10 9/10 页 11 0107 * 测定当日严重度不明，但是 2 天后判明为超严重性肺炎。

40、 0108 NT ： not tested 0109 RAPIRUN HS ： RAPIRUN 肺炎球菌 HS、 Binax ： BinaxNOW 肺炎球菌 0110 实施例 3 临床经过 0111 评价了一位患者的临床经过。在样本采取第一天的时间点上， PCR、“RAPIRUN 肺炎球菌 HS” 、“BinaxNOW 肺炎球菌” 均是阴性，但是 2 天后均转为阳性，判断为 PCR、“RAPIRUN 肺炎球菌 HS” 、“BinaxNOW 肺炎球菌” 的检出效率基本相同 ( 表 4)。 0112 表 4 0113 0114 RAPIRUN HS ： RAPIRUN 肺炎球菌 HS、 Bi。

41、nax ： BinaxNOW 肺炎球菌 0115 * 诊断为支气管炎 0116 实施例 3 严重度与生化测定值的组合的相关性 0117 (1) 将肺炎病例分类为严重超严重组和其他 + 中度以下 ( 包含轻度 ) 组，进而将各组细分为 “RAPIRUN 肺炎球菌 HS” ( 图中表示为 HS) 的阳性、阴性例。将此时的生化标记物 (CRP、 WBC、 BUN) 的测定值在纵轴上绘制。 0118 1)CRP( 图 4) 0119 CRP 和 “RAPIRUN 肺炎球菌 HS” 的组合中，能够提取肺炎球菌 PCR 阳性组。作为此时的 CRP 的临界值认为 20mg/dL 是最佳的。说。

42、明书 CN 104246503 A 11 10/10 页 12 0120 2)WBC( 图 5) 0121 WBC 和 “RAPIRUN 肺炎球菌 HS” 的组合中，能够高效地检出 PCR 阳性例。作为此时的 WBC 的临界值，认为能够采用成人的健康分布宽度的上限 10000 个 /mm3。 0122 3)BUN( 图 6) 0123 BUN 和 “RAPIRUN 肺炎球菌 HS” 的组合中，能够高效地检出 PCR 阳性例。作为此时的 BUN 的临界值，认为能够采用 20mg/dL。 0124 比较例 0125 将肺炎病例分类为严重超严重组和其他 + 中度以下 ( 包含轻度 )。

43、组，进而将各组细分为 “RAPIRUN 肺炎球菌 HS” ( 图中表示为 HS) 的阳性、阴性例。将此时的生化标记物 ( 中性粒细胞、 Na、 Cr、 BNP) 的测定值在纵轴上绘制。 0126 结果在图 7 10 示出。使用中性粒细胞、 Na 时，各组间没有得到显著的差异。此外，尽管用 Cr、 BNP 标记的重病例的 RAPIRUN 肺炎球菌 HS 阳性例中，观察到高值例，但是局限于一部份病例，没有发现临床意义。 0127 工业上的利用可能性 0128 单独用生化标记物的诊断中，能够在某种程度上进行疑似肺炎的病例的严重度的予测，但是不限于肺炎球菌，因此无法与其他。

44、的感染症鉴别。虽然报道有成人社区获得性肺炎的原因微生物约 50-80是细菌性的，其中 12-27是肺炎球菌性肺炎，但是，为肺炎球菌性时特别易于严重化，因此其他致病微生物的鉴别在临床上变得重要。进而，认为迅速断定致病细菌，选择最佳的抗菌剂，对治疗时间的短期化，在防御各种致病细菌的耐性化方面也是重要的。指南上要求对于肺炎球菌将青霉素系抗菌剂作为第一选择。因此，生化标记物和血液中肺炎球菌抗原检出系的组合中，能够迅速确定单独用生化标记物不能判断的严重性的肺炎球菌性肺炎，此外能够一同判断出单独用肺炎球菌抗原检出系不能判定的肺炎严重度，因此对最佳的抗菌剂的选择和入。

45、院治疗的判断非常有意义。说明书 CN 104246503 A 12 1/10 页 13 图 1 说明书附图 CN 104246503 A 13 2/10 页 14 图 2 说明书附图 CN 104246503 A 14 3/10 页 15 图 3 说明书附图 CN 104246503 A 15 4/10 页 16 图 4 说明书附图 CN 104246503 A 16 5/10 页 17 图 5 说明书附图 CN 104246503 A 17 6/10 页 18 图 6 说明书附图 CN 104246503 A 18 7/10 页 19 图 7 说明书附图 CN 104246503 A 19 8/10 页 20 图 8 说明书附图 CN 104246503 A 20 9/10 页 21 图 9 说明书附图 CN 104246503 A 21 10/10 页 22 图 10 说明书附图 CN 104246503 A 22 。

摘要
申请专利号：	CN201380017629.0	申请日：	2013.03.29
公开号：	CN104246503A	公开日：	2014.12.24
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 33/569申请公布日:20141224\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/569申请日:20130329\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N33/569; G01N33/53; C12Q1/04; C12Q1/68	主分类号：	G01N33/569
申请人：	大塚制药株式会社
发明人：	福岛喜代康; 田中裕美
地址：	日本东京都
优先权：	2012.03.30 JP 2012-081038
专利代理机构：	北京集佳知识产权代理有限公司 11227	代理人：	金世煜;苗堃
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内容摘要

本发明提供一种使用受试者的血液，能够更客观且迅速地判定肺炎球菌性肺炎的严重度的方法。是以从受试者采取的血液中有无肺炎球菌抗原和选自血中C反应性蛋白质浓度(CRP)、白血球数(WBC)和血中尿素氮浓度(BUN)的1种以上的生化检查值为指标的肺炎球菌性肺炎的严重度的判定方法。

权利要求书

权利要求书
1.  一种肺炎球菌性肺炎严重度判定方法，其特征在于，以从受试者采取的血液中有无肺炎球菌抗原以及选自血中C反应性蛋白质浓度即CRP、白血球数即WBC和血中尿素氮浓度即BUN中的1种以上的生化检查值作为指标。

2.  根据权利要求1所述的判定方法，其中，肺炎球菌抗原是阳性且生化检查值为以下的情况时，评价为严重或超严重，
CRP：10mg/dL以上
WBC：10000个/mm3以下
BUN：20mg/dL以上。

3.  根据权利要求1或2所述的方法，其中，肺炎球菌抗原是选自C-多糖抗原、荚膜抗原和细胞膜多糖抗原中的1种以上。

4.  根据权利要求1～3中的任意一项所述的方法，其中，一同评价肺炎球菌性菌血症。

说明书

说明书肺炎球菌性肺炎的严重度判定方法
技术领域
本发明涉及利用受试者的血液判定肺炎球菌性肺炎的严重度的方法。
背景技术
作为社区性肺炎、下呼吸道感染症的病原菌，肺炎球菌(S.pneumoniae)是检测频度最高的菌，不仅在日本在全世界范围内也是罹患率、死亡率高的病原菌之一。肺炎球菌感染症，不仅频度高，而且易于严重化，因此尽可能在早期确定病原菌，选择确切的治疗药，在预后的改善、医疗成本的削减、预防耐药菌出现的方面是重要的。
肺炎的诊断，一般基于临床症状、身体观察结果、一般检查观察结果、胸部X线照片等综合进行，被诊断为肺炎患者后继续按照“成人社区获得性肺炎诊疗指南”(非专利文献1)示出的A-DROP系统进行严重度的判定，基于该结果来选择门诊治疗、入院治疗、ICU治疗。其中，A-DROP系统是用1)男性70岁以上、女性75岁以上，2)BUN是21mg/dL以上或存在脱水，3)SpO2是90％以下(PaO2为60Torr以下)、4)存在意识障碍，5)血压(收缩期)90mmHg以下的5个指标中的符合数量来确定严重度的系统(参见图1)。
接下来，其后，进行致病菌检查，根据检出的致病菌确立治疗方针。但是，由于判明利用培养检查的致病菌的鉴定和药剂敏感性检查的结果需要数日，因此，最近，在初期从咯痰、鼻咽拭子或者尿等使用对肺炎球菌抗原特异的抗体的诊断药(“RAPIRUN(注册商标)肺炎球菌”(大冢制药株式会社)、“RAPIRUN(注册商标)肺炎球菌HS(中耳·副鼻腔炎)”(大冢制药株式会社)、“BinaxNOW(注册商标)肺炎球菌”(Alere Medical株式会社))进行迅速检查，在早期确立治疗方针。
此外，报道有发现肺炎中以10％的频度伴有菌血症的并发，特别是肺炎球菌中达到60％以上，因此，检出血液中的菌变得重要。作为血液中的菌的检测法，可举出血液培养、RT-PCR法、抗原检查。血液培养在肺炎中尽可能被实施，但是获得检查结果需要花费时间，与RT-PCR相比较检出率低，仅为20％左右，需求紧急性时，不能说是有效的方法。RT-PCR的检出率高，但是需要专用的器械，而且昂贵，因此在临床上未得到实现普及。关于抗原检查，在原理上用ELISA等检出血清中的C-多糖抗原(C-ps)等的报道(非专利文献2、3)、但是，由于前处理法的必要性以及ELISA是缺少迅速性的检测法，所以现状是难以实现实用化。
因此，期望将现行中仅用临床症状、生化标记物的信息来判断的肺炎的严重度的判断以及还包含致病菌的推定，能够更客观且迅速地进行的手段。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:日本呼吸器学会“与呼吸器感染症相关的指南”成人社区获得性肺炎诊疗指南.日本呼吸器学会、2007.p9-12
非专利文献2:Gillespie SH,et al.1995,J Clin Pathol；48:803-806
非专利文献3:Coonrod JD,et al.1973,J.Lab.Clin.Med.81:778-786
发明内容
本发明提供一种使用受试者的血液，能够更客观且迅速地判定肺炎球菌性肺炎的严重度的方法。
本发明人等对能够在初期诊断时简易且客观地判定肺炎球菌性肺炎的严重度的方法进行研究的结果发现测定患者的血液中的肺炎球菌抗原，组合该信息与特定的生化标记的测定值(生化检查值)时，能够良好区别通过A-DROP系统被判定为严重和超严重的患者和被判定为轻度和中度的患者，能够进行肺炎球菌性严重肺炎的判定。此外，根据该方法，由于测定血液中的肺炎球菌抗原，因此同时也能进行肺炎球菌性菌血症的判定。
本发明是涉及下述1)～4)的发明。
1)一种肺炎球菌性肺炎的严重度的判定方法，其以从受试者采取的血液中的肺炎球菌抗原的有无和选自血中C反应性蛋白质浓度(CRP)、白血球数(WBC)和血中尿素氮浓度(BUN)的1种以上的生化检查值为指标。
2)根据上述1)所述的判定方法，其中，肺炎球菌抗原是阳性，生化检查值为以下的情况时，评价为严重或超严重，
CRP：10mg/dL以上
WBC：10,000个/mm3以下
BUN：20mg/dL以上。
3)根据上述1)或2)所述的方法，其中，肺炎球菌抗原是选自C-多糖抗原、荚膜抗原和细胞膜多糖抗原的1种以上。
4)根据上述1)～3)中的任意一项所述的方法，其中，一同评价肺炎球菌性菌血症。
根据本发明的方法，能够将现行中仅用临床症状、生化标记物的信息来判断的肺炎的严重度、基于此而确定的治疗时的标准(门诊治疗、入院治疗、ICU治疗)的判断以及还包括致病菌的推定，更客观且迅速地进行。
由此，能够在早期进行适当的抗菌剂的选择，实现预后的改善、医疗成本的削减、预防耐药菌出现。
此外，根据本发明的方法，由于能够以与RT-PCR法相同程度的灵敏度检出血液中的肺炎球菌抗原，因此也能够同时进行肺炎球菌性菌血症的判定。
附图说明
图1是表示利用A-DROP系统的严重度分类和治疗场所的关系的图。
图2是表示各个血清稀释倍率的谱线强度(肺炎球菌抗原检出灵敏度)的图和表。
图3是表示各个采血法的谱线强度(肺炎球菌抗原检出灵敏度)的图。
图4是表示血中肺炎球菌抗原的检出和CRP的组合与严重度的相关性的图。
图5是表示血中肺炎球菌抗原的检出和WBC的组合与严重度的相关性的图。
图6是表示血中肺炎球菌抗原的检出和BUN的组合与严重度的相关性的图。
图7是表示血中肺炎球菌抗原的检出和中性粒细胞的组合与严重度的相关性的图。
图8是表示血中肺炎球菌抗原的检出和Na的组合与严重度的相关性的图。
图9是表示血中肺炎球菌抗原的检出和Cr的组合与严重度的相关性的图。
图10是表示血中肺炎球菌抗原的检出和BNP的组合与严重度的相关性的图。
具体实施方式
作为本发明的方法适用的受试者可举出肺炎球菌性肺炎患者、疑似罹患肺炎球菌性肺炎的患者、疑似肺炎球菌性呼吸道感染症的患者、疑似肺炎球菌性全身感染症的患者、疑似肺炎球菌性炎症的患者以及疑似即将罹患以上述为代表的肺炎球菌性疾患的健康人等。此外，此处所谓患者不局限于人，人以外的哺乳动物也可以成为本发明的对象。
从受试者采取的“血液”包括血液(全血)、血浆、血清。
肺炎球菌抗原的测定中，优选使用血清或血浆，稀释1～10倍、优选稀释2倍使用则在提高检出灵敏度方面优选。
作为本发明的方法所使用的肺炎球菌抗原，可举出细胞壁抗原(C-多糖抗原(C-polysaccharide；C-ps))、荚膜抗原(Capsular polysaccharide)、细胞膜多糖抗原(F-antigen；LipoTeichoic acid/Teichoic acid)等，其中优选C-ps、荚膜抗原、细胞膜多糖抗原，更优选同时测定·检出C-ps、荚膜抗原和细胞膜多糖抗原。
本发明的方法中，测定血液中有无该肺炎球菌抗原，而测定包含定量的或非定量的测定。作为非定量的测定，例如，可举出单纯进行肺炎球菌抗原是否存在的测定、肺炎球菌抗原是否以一定量以上存在的测定、将肺炎球菌抗原的量与其他试样(例如，对照组试样等)进行比较的测定等。作为定量的测定可举出肺炎球菌抗原的浓度的测定、肺炎球菌抗原的量的测定等。
本发明中，肺炎球菌抗原为阳性是指，至少血中存在肺炎球菌抗原。
作为肺炎球菌抗原的测定法，可以优选举出使用与上述肺炎球菌抗原对应的抗体的免疫学的测定法。作为与肺炎球菌抗原对应的抗体，与肺炎球菌抗原特异的结合即可，不限定抗体的来源、种类(单克隆、多克隆)以及形状。具体的可以使用小鼠抗体、大鼠抗体、人抗体、嵌合抗体、人型化抗体等公知的抗体。
源自哺乳动物的单克隆抗体包含利用杂交瘤而产生的抗体以及产自通过基因工程手法对含有抗体基因的表达载体进行形质转换的宿主的抗体。使用基本的公知技术，将肺炎球菌抗原作为致敏抗原使用，按照常见的免疫方法将其免疫，按照通常的细胞融合法将得到的免疫细胞与公知的母细胞融合，通过常见的筛选法，筛选出单克隆的抗体产生细胞，从而制作单克隆抗体产生杂交瘤。
此外，在该抗体不失去识别肺炎球菌抗原的特性的范围内，可以是抗体断片(片段)等低分子化抗体、抗体的修饰物等。作为抗体断片的具体例，例如可举出Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv、Diabody等。
作为针对肺炎球菌抗原的抗体的具体例，可举出属于对C-ps的抗体的、例如在1)Nielsen等，Antibodies against pneumococcal C-polysaccharide are not protective,Microbial Pathogenesis14:299-305(1993)；2)Gillespie等，Detection of C-polysaccharide in serum of patients with Streptococcus pneumoniae bacteremia，J Clin Pathol 48:803-806(1995)；3)United States Patent:6824997(1997)； 4)Ehara等，A novel method for rapid detection of Streptoeoccus pneumoniae antigen in sputum and its application in adult respiratory tract infection，Journal of Medical Microbiolog 57：820-82(2008)中记载的抗体，属于对荚膜抗原的抗体的、例如在1)Coonrod等，Detection of type-specific pneumococcal antigens by counterimmunoelectrophoresis.11.Etiologic diagnosis of pneumococcal pneumonia,J.Lab.Clin.Med.81.778-786(1973)；2)Feigin等，Countercurrent immunoelectrophoresis of urine as well as of CSF and blood for diagnosis of bacterial meningitis，The Journal of Pediatrics89.773-775(1976)；3)Ajello等，Commercial Latex Agglutination Tests for Detection of Haemophilus influenza Type b and Streptococcus pneumoniae Antigens in Patients with Bacteremic Pneumonia，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,25(8)；1388-1391(1987)；4)Ballaed等,Comparison of three latex agglutination kits and counterimmunoelectrophoresis for the detection of bacterial antigens in a pediatric populatio，Pediatr.Infect.Dis.J.6(7)；630-634(1987)；5)小林等，肺炎球菌尿中抗原迅速检测试剂盒的社区性肺炎中有用性的研究，感染症学杂志第76卷第12号；995-1002(2002)中记载的抗体，属于对细胞膜多糖抗原的抗体的、例如在Hotomi等，Evaluation of a Rapid Immunochromatographic ODK-0901 Test for Detection of Pneumococcal Antigen in Middle Ear Fluids and Nasopharyngeal Secretions.PLoS one,7(3)；e33620(2012)中记载的抗体。
作为使用对肺炎球菌抗原的抗体的免疫学的测定法，可以使用本领域公知的任意的免疫测定方法。例示性地可举出放射免疫分析(RIA)、ELISA等酶免疫分析(EIA)、胶乳免疫比浊法(LTIA)和免疫色谱。在提高检出灵敏度方面，优选使用夹心法。此外，从简便性和迅速性的观点出发，优选免疫色谱。使用免疫色谱法时，能在短时间内在床边或患者就诊中就可进行诊断。
作为上述免疫学的测定中使用的标记，可举出该领域使用的任意的标记。例示性的地可举出辣根过氧化酶(HRP)、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶等酶、125I、32P、14C、35S或3H等放射性同位素(RI)、FITC、四甲基罗丹明异氰酸酯等荧光物质、化学发光等发光物质以及金胶体、着色胶乳粒子等可视化物质。进而也可举出使用以生物素一次标记后，使用被上述标记所标记的亲和素的致敏系统和用地高辛等低分子物质一次标记后，使用被上述标记所标记的抗体等的具有与该低分子物质亲和性的物质的检测法。
本发明的肺炎球菌抗原的测定中，也可以使用市售的肺炎球菌检测试剂盒“RAPIRUN肺炎球菌HS(中耳·副鼻腔炎)”(大冢制药株式会社)、“BinaxNOW肺炎球菌”(Alere Medical株式会社)等。
本发明中使用的生化检查值是选自血中C反应性蛋白质浓度(CRP)、白血球数(WBC)和血中尿素氮浓度(BUN)中的1种以上。
(1)C反应性蛋白质(C-reactive protein：CRP)
CRP是在体内炎症反应或组织破坏发生时血中出现的蛋白质，其具有与肺炎球菌的C多糖体结合的性质。通常，作为炎症标记物被利用。
CRP在2000年制定的旧指南的“成人社区获得性肺炎诊疗的基本的思考方法”中虽然被用作判定肺炎的严重度的参数，但是2007年制定的“与呼吸器感染症相关的指南”的验证中报道了其不能正确反映严重度，从而在新指南中，将其从严重度的判定项目中进行了删除(参见上述非专利文献1)。
然而，通过将CRP与肺炎球菌抗原的检出(阳性)组合，能够进行肺炎球菌性肺炎的严重和超严重的判定(参见实施例3)。这种情况下的CRP的临界值是10～20mg/dL。
即，本发明中，作为肺炎球菌性肺炎的严重和超严重的指标的CRP是10mg/dL以上，优选为20mg/dL。
本发明中，CRP的测定没有特别限定，例如，可举出胶乳免疫比浊法。
(2)白血球数(WBC)
已知血液中的白血球数(WBC)，通常在细菌性感染时上升，但是严重性肺炎中由于在肺局部化，其血中浓度降低。WBC与CRP同样，过去被用作判定肺炎的严重度的参数，但是，在2007年制定的新指南中，将其从严重度的判定项目中进行了删除(参见上述非专利文献1)。
然而，关于WBC，通过与肺炎球菌抗原的检出(阳性)组合，也能够进行肺炎球菌性肺炎的严重和超严重的判定(参见实施例3)。这种情况下的WBC的临界值是10000个/mm3～6000个/mm3。
即，本发明中，作为肺炎球菌性肺炎的严重和超严重的指标的WBC在健康人的分布范围内，或者在其以下时例如为10000个/mm3以下，优选为6000个/mm3以下。
本发明中，WBC的测定没有特别限制，例如，可举出能够进行血球计算的自动测定器。
(3)血中尿素氮浓度(BUN)
BUN是表示源自血中尿素的氮量的参数，作为肾功能标记物被利用。
已知BUN在脱水和异化亢进较大的严重肺炎患者中变为高值。通过与肺炎球菌抗原的检出(阳性)组合，能够更高精度地进行肺炎球菌性肺炎的严重和超严重的判定(参见实施例3)。此时的BUN的临界值可举出约20mg/dL。
即，本发明中，作为肺炎球菌性肺炎的严重和超严重的指标的BUN，例如可举出20mg/dL以上。
本发明中，BUN的测定没有限制，例如，可举出脲酶GLDH法、脲酶ICDH法。其中优选使用脲酶GLDH法。
此外，根据本发明的方法，由于测定血液中的肺炎球菌抗原，能够同时进行肺炎球菌性菌血症的判定。其中，“肺炎球菌性菌血症”是指血液中有肺炎球菌存在。即，本发明的方法中，血液中肺炎球菌抗原是阳性，则可以推测为肺炎球菌性菌血症。以往的肺炎球菌性菌血症的判定，通过血液培养中的肺炎球菌的检出进行，但是认为血液培养不仅对于肺炎球菌，对于微生物的检出率低，近年开始使用利用RT-PCR的检出(Resti等，Community-Acquired Bacteremic Pneumococcal Pneumonia in Children:Diagnosis and Serotyping by Real-Time Polymerase Chain Reaction Using Blood Samples,Clinical Infectious Diseases.51(9):1042-1049(2010))。使用本发明的方法时，不使用RT-PCR 就能够简易地进行肺炎球菌性菌血症的推测。
实施例
材料和方法
在获取知情同意书的情况下从患者采取全血，将其利用常见的离心分离法或沈降法分离为血清或血浆后，-80℃保存。
(1)样本的调制
血清是通过将血液采取到装有血清分离体的采血管，离心后而得到血清成分。血浆是通过将血液采取到EDTA·2Na或华法林采血管，离心或者静置后，采取上清而得到的。所有样本均在-80℃保存。
(2)用于肺炎球菌抗原测定的血清/血浆的最佳稀释率的评价
血清/血浆的最佳稀释率的评价中使用“RAPIRUN肺炎球菌HS(中耳·副鼻腔炎)”(大冢制药株式会社)。使用试剂盒附带的样本提取试剂将血清/血浆进行梯度稀释，求出得到最强的测试谱线强度的稀释率。应予说明，测定后的谱线，用市售数码相机摄影后，使用密度计(ATTO社)评价其强度。
(3)肺炎球菌抗原测定
使用以下示出的市售的试剂盒，测定血中肺炎球菌抗原的有无。
1)RAPIRUN肺炎球菌HS(中耳·副鼻腔炎)(大冢制药株式会社)
(2)将被判断为最佳稀释率的2倍稀释血清/血浆以150μL分别注入试剂盒附带的样品杯，将测试棒(试剂本身)的样品应用部浸入其中，然后按照附带说明书进行测定。
2)“BinaxNOWR肺炎球菌”(Alere Medical株式会社)
1)将调制的2倍稀释血清/血浆中浸入试剂盒附带的棉棒，然后按照附带说明书进行测定。
(4)其他测定项目
1)生化标记物
将血清作为样本，用日立自动分析装置LABOSPECT 008测定CRP、WBC、中性粒细胞、BUN、Na、Cr、BNP。
2)培养
为了致病菌的推定，实施血液培养和咯痰培养。各样本的培养，按照Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI，临床·检查标准协会)的规格进行。
3)PCR
按照已报道(Ehara N,et al.2008,Journal of Medical Microbiology 57:820-826)的方法，以肺炎球菌的PspA基因为对象进行血清中的肺炎球菌PspA DNA的定量。应予说明，该设施中检出灵敏度是200copies/μgDNA。
实施例1
(1)严重度判定
对使用成人社区获得性肺炎诊疗指南(上述非专利文献1)记载的A-DROP系统进行了严重度判定的下述的病例，实施生化标记物和血液中肺炎球菌抗原的评价。各个严重度判定的病例数在表1示出。
[表1]

*非结核性抗酸菌症、支气管炎、支气管哮喘、肺气肿、脱水
(2)最佳样本浓度调整
将“RAPIRUN肺炎球菌HS(中耳·副鼻腔炎)”作为指标，用试剂盒附带的样本提取试剂，将不同的5种血清样品稀释为血清原液(稀释倍率1倍)，2倍，6倍，18倍后用该试剂盒测定，将谱线强度进行比较研究。各个稀释倍率的谱线强度在图2示出。
根据图2，所有血清样本中，2倍稀释中谱线强度显示最高值。应予说明，发现在血清原液中粘性高，有流速慢的趋势，认为2倍稀释(原液：样本提取液＝1：1)，在迅速性、谱线强度方面均为最佳样本浓度。
(3)采血法间的差异(样本种类)
对采取自1位患者的血液，调制血清1种、图3示出的血浆4种，使用“RAPIRUN肺炎球菌HS(中耳·副鼻腔炎)”评价谱线的强度。其结果一并在图3示出。
所有的采血法(血清、EDTA-2Na血浆、华法林血浆)、所有的分离法(离心法、静置分离法)中谱线的强度是相同的，认为不受采血法、分离法的影响。因此，在以后的评价中，使用通过离心分离调整的血清。
(4)各患者的血中肺炎球菌抗原的检出灵敏度和特异度
对各患者的血中肺炎球菌抗原的检出灵敏度和特异度，以咯痰培养检查结果作为基准进行了计算。灵敏度是表示咯痰培养阳性例中的在各测定法中也判定为阳性的例数的比例。此外，特异度是表示咯痰培养阴性例中的在各测定法中也判定为阴性的例数的比例(表2)
[表2]

发现“RAPIRUN肺炎球菌HS”和“BinaxNOW肺炎球菌”，均随着肺炎的严重度的上升，灵敏度有上升的趋势，其检出率与作为高灵敏度的肺炎球菌检测法而被知的RT-PCR相同。
实施例2严重、超严重病例中的解析结果
而且，以被判定为严重、超严重的肺炎病例为对象，将血液中肺炎球菌抗原使用“RAPIRUN肺炎球菌HS”、“BinaxNOW肺炎球菌”进行测定，将其与血液PCR的结果进行了比较研究。其结果表明，咯痰培养中肺炎球菌所检出的严重、超严重病例的5例均在两试剂盒中显示阳性。此外，PCR中除了1例以外的4例是阳性。
[表3]

*测定当日严重度不明，但是2天后判明为超严重性肺炎
NT：not tested
RAPIRUN HS：RAPIRUN肺炎球菌HS、Binax：BinaxNOW肺炎球菌
实施例3 临床经过
评价了一位患者的临床经过。在样本采取第一天的时间点上，PCR、“RAPIRUN肺炎球菌HS”、“BinaxNOW肺炎球菌”均是阴性，但是2天后均转为阳性，判断为PCR、“RAPIRUN肺炎球菌HS”、“BinaxNOW肺炎球菌”的检出效率基本相同(表4)。
[表4]

RAPIRUN HS：RAPIRUN肺炎球菌HS、Binax：BinaxNOW肺炎球菌
*诊断为支气管炎
实施例3 严重度与生化测定值的组合的相关性
(1)将肺炎病例分类为严重·超严重组和其他+中度以下(包含轻度)组，进而将各组细分为“RAPIRUN肺炎球菌HS”(图中表示为HS)的阳性、阴性例。将此时的生化标记物(CRP、WBC、BUN)的测定值在纵轴上绘制。
1)CRP(图4)
CRP和“RAPIRUN肺炎球菌HS”的组合中，能够提取肺炎球菌PCR阳性组。作为此时的CRP的临界值认为20mg/dL是最佳的。
2)WBC(图5)
WBC和“RAPIRUN肺炎球菌HS”的组合中，能够高效地检出PCR阳性例。作为此时的WBC的临界值，认为能够采用成人的健康分布宽度的上限10000个/mm3。
3)BUN(图6)
BUN和“RAPIRUN肺炎球菌HS”的组合中，能够高效地检出PCR阳性例。作为此时的BUN的临界值，认为能够采用20mg/dL。
比较例
将肺炎病例分类为严重·超严重组和其他+中度以下(包含轻度)组，进而将各组细分为“RAPIRUN肺炎球菌HS”(图中表示为HS)的阳性、阴性例。将此时的生化标记物(中性粒细胞、Na、Cr、BNP)的测定值在纵轴上绘制。
结果在图7～10示出。使用中性粒细胞、Na时，各组间没有得到显著的差异。此外，尽管用Cr、BNP标记的重病例的RAPIRUN肺炎球菌HS阳性例中，观察到高值例，但是局限于一部份病例，没有发现临床意义。
工业上的利用可能性
单独用生化标记物的诊断中，能够在某种程度上进行疑似肺炎的病例的严重度的予测，但是不限于肺炎球菌，因此无法与其他的感染症鉴别。虽然报道有成人社区获得性肺炎的原因微生物约50-80％是细菌性的，其中12-27％是肺炎球菌性肺炎，但是，为肺炎球菌性时特别易于严重化，因此其他致病微生物的鉴别在临床上变得重要。进而，认为迅速断定致病细菌，选择最佳的抗菌剂，对治疗时间的短期化，在防御各种致病细菌的耐性化方面也是重要的。指南上要求对于肺炎球菌将青霉素系抗菌剂作为第一选择。因此，生化标记物和血液中肺炎球菌抗原检出系的组合中，能够迅速确定单独用生化标记物不能判断的严重性的肺炎球菌性肺炎，此外能够一同判断出单独用肺炎球菌抗原检出系不能判定的肺炎严重度，因此对最佳的抗菌剂的选择和入院治疗的判断非常有意义。