《一种过氧化氢生物传感器及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种过氧化氢生物传感器及其制备方法.pdf（9页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102495116 A (43)申请公布日 2012.06.13 CN 102495116 A *CN102495116A* (21)申请号 201110388435.4 (22)申请日 2011.11.29 G01N 27/30(2006.01) G01N 27/327(2006.01) (71)申请人 上海师范大学 地址 200234 上海市徐汇区桂林路 100 号 (72)发明人 杨海峰 接德丽 (74)专利代理机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 31227 代理人 吴瑾瑜 (54) 发明名称 一种过氧化氢生物传感器及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了。
2、一种过氧化氢生物传感器及其 制备方法， 采用自组装方法， 利用肌醇六磷酸钙作 为连接剂， 通过磷酸酯键及 Ca2+的静电和螯合作 用将 HRP 吸附到电极表面， 获得了 Nafion/HRP/ Ca-IP6/GCE 传感器， 所制备的传感器与酶底物的 亲和力高， 能够实现辣根过氧化物酶的直接电子 转移， 对过氧化氢的响应时间短， 检测限低， 灵敏 度高等性能， 同时， 本发明制备方法简单， 环保经 济。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 1/1 。
3、页 2 1. 一种过氧化氢生物传感器的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： (1) 将肌醇六磷酸钙溶液在 90下加热回流 30 分钟 ； (2) 将步骤 (1) 所得肌醇六磷酸钙溶液滴涂在经预处理的玻碳电极表面于 4 8冰 箱内晾干， 得肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极 ； (3) 将辣根过氧化物酶溶液滴涂固定到步骤 (2) 所得肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极 上， 置 4 8冰箱内晾干， 得辣根过氧化物酶 - 肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极 ； (4) 将全氟磺酸溶液滴加到步骤 (3) 所得的辣根过氧化物酶 - 肌醇六磷酸钙膜修饰的 玻碳电极上， 置48冰箱内晾干后， 制备得辣根过氧化物酶-植。
4、酸钙膜修饰的玻碳电极。 2.根据权利要求1所述的过氧化氢生物传感器的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中所 述肌醇六磷酸钙溶液的浓度为 0.001 0.002mol/L。 3.根据权利要求1所述的过氧化氢生物传感器的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)所述 预处理的过程如下 ： 用氧化铝粉抛光处理玻碳电极， 再依次用去离子水， 无水乙醇， 去离子 水清洗， 最后超声清洗 3 5 分钟。 4. 根据权利要求 1 所述的过氧化氢生物传感器的制备方法， 其特征在于， 步骤 (3) 中 HRP 溶液为 HRP 的 PBS 溶液， 浓度为 3 8mg/mL， 溶液 pH 为 7.4 7.5。 5.根据。
5、权利要求1所述的过氧化氢生物传感器的制备方法， 其特征在于， 步骤(4)中溶 液全氟磺酸溶液的浓度为 1wt 1.5wt。 6.根据权利要求15所述制备方法制得的过氧化氢生物传感器， 其特征在于， 包括玻 碳电极， 玻碳电极表面修饰有肌醇六磷酸钙膜， 肌醇六磷酸钙膜上修饰辣根过氧化物酶， 辣 根过氧化物酶膜表面再修饰一层全氟磺酸膜。 权 利 要 求 书 CN 102495116 A 2 1/4 页 3 一种过氧化氢生物传感器及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物材料领域， 具体涉及一种过氧化氢生物传感器及其制备方法。 背景技术 0002 H2O2作为一种重要的化工产品， 兼具杀菌、 。
6、漂白、 氧化和消毒等多种功效。它的应 用十分广泛， 所以对 H2O2含量的测定在生物制药、 食品科学、 工业分析、 环境监测和临床化 学等领域具有非常重要的意义。现在检测 H2O2时采用的主要手段有荧光法、 化学发光法、 电化学法、 光谱法和滴定法等。近年来， 电化学方法， 尤其是基于酶的直接电化学的无媒介 体生物传感器得到了迅速的发展， 这是因为用电化学方法研制的 H2O2生物传感器其制备简 单， 成本低， 并且具有很高的选择性和灵敏度。 0003 另外， 酶在生物体内以及药物和食物中有极为重要的作用， 而 H2O2作为生物体内 许多过氧化酶参与酶促反应的副产物， 对其浓度进行准确测定则具有。
7、十分重要的研究意 义。生物传感器具有对酶的分子识别和催化选择功能， 使用它来检测 H2O2浓度不但能体现 出操作便捷， 响应迅速快的特点， 而且只需少量的试样就可以检测出 H2O2的浓度。因此， 如 何在对 H2O2进行精确检测时充分发挥生物传感器的信号检测高灵敏性和反应高度专一性 等优势， 将会是研究者们为之不断奋斗的目标。 0004 生物纳米材料具有生物兼容性好、 比表面积大和稳定性高等特点， 并且其表面所 带有的功能基团能对酶的电化学行为产生特有的催化效应。 环境友好型试剂肌醇六磷酸钙 (Ca-IP6)， 其分子的结构上含有 6 个非共平面的磷酸酯键， 使其具有很强的螯合多价金属离 子的。
8、能力， Ca2+也具有很强的螯合能力， 因此肌醇六磷酸钙比其他肌醇六磷酸盐都易与带正 电的蛋白质或金属和金属氧化物纳米粒子通过螯合和静电作用结合。 这些独特的性质类似 于生物磷酸酯膜， 与蛋白质或酶结合， 为酶在生物传感器的固定上提供良好的微环境， 实现 酶与电极之间的直接电子转移， 用于高灵敏度检测 H2O2。 0005 迄今为止， 国内外尚未有利用 “绿色经济” 肌醇六磷酸钙膜制备的检测过氧化氢的 生物传感器。 所以发明一种检测限低， 响应时间短， 米氏常数较小， 灵敏度高， 稳定性好的检 测 H2O2的生物传感器是一个迫切需要解决的重要技术问题。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一。
9、种检测限低， 响应时间短， 米氏常数较小， 灵敏度高， 稳定 性好的检测 H2O2生物传感器及其制备方法。 0007 本发明的目的是通过如下技术方案实现的 ： 0008 一种过氧化氢生物传感器的制备方法， 包括如下步骤 ： 0009 (1) 将肌醇六磷酸钙溶液在 90下加热回流 30 分钟 ； 0010 (2) 将步骤 (1) 所得肌醇六磷酸钙溶液滴在经预处理的玻碳电极 (GCE) 表面并于 4 8冰箱内晾干， 得肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极 ； 0011 (3) 将辣根过氧化物酶 (HRP) 溶液滴涂固定到步骤 (2) 所得肌醇六磷酸钙膜修饰 说 明 书 CN 102495116 A 3 2。
10、/4 页 4 的玻碳电极上， 置 4 8冰箱内晾干， 得辣根过氧化物酶 - 肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电 极 ； 0012 (4)将全氟磺酸(Nafion)溶液滴加到步骤(3)所得的辣根过氧化物酶-肌醇六磷 酸钙膜修饰的玻碳电极上， 于 4 8冰箱内晾干 ； 0013 步骤 (1) 中所述肌醇六磷酸钙溶液的浓度为 0.001 0.002mol/L。 0014 步骤 (2) 所述预处理的过程如下 ： 用氧化铝粉抛光处理玻碳电极， 再依次用去离 子水， 无水乙醇， 去离子水清洗， 最后超声清洗 3 5 分钟， 使得玻碳电极表面无划痕。 0015 步骤 (3) 中 HRP 溶液为 HRP 的 PBS 。
11、溶液， 浓度为 3 8mg/mL， 溶液 pH 为 7.4 7.5。 0016 步骤 (4) 中溶液全氟磺酸溶液浓度为 1wt 1.5wt。 0017 根据以上技术方案制得的过氧化氢生物传感器， 其特征在于， 包括玻碳电极， 玻碳 电极表面修饰有肌醇六磷酸钙膜， 肌醇六磷酸钙膜上修饰辣根过氧化物酶， 辣根过氧化物 酶膜表面再修饰一层全氟磺酸膜。 0018 本发明采用自组装方法， 利用肌醇六磷酸钙作为连接剂， 通过磷酸酯键及 Ca2+的 静电和螯合作用将 HRP 吸附到电极表面， 获得了 Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE 传感器， 所采用的 肌醇六磷酸钙是一种用途广泛的药物原料， 其具。
12、有生物相容性好、 易降解、 无毒副作用等优 良的生物性能。 0019 由于上述技术方案的采用， 本发明制备的电极中的辣根过氧化物酶保持了很好的 生物活性， 实现了与电极表面的直接电子转移， 对过氧化氢有很好的响应， 并具有检测限 低、 响应时间短、 电催化活性高和稳定性良好等优点， 是一种优良的检测过氧化氢的新型生 物传感器。同时， 本发明的制备方法还具有操作简单、 绿色环保、 成本较低的优点。 附图说明 0020 图 1 为本发明中不同修饰层数的电极的电化学交流阻抗图。 0021 图 2 为本发明中 Ca-IP6、 HRP 这两种溶液及混合溶液的紫外 - 可见吸收光谱图。 0022 图 3 。
13、为不同修饰电极的循环伏安图。 0023 图 4 为本发明传感器对不同浓度 H2O2的循环伏安图。 0024 图 5 为本发明传感器在 PBS 中连续加入 H2O2的计时电流响应曲线。 0025 图 6 为本发明响应电流与 H2O2浓度的校正曲线的计时电流图。 具体实施方式 0026 下面结合附图和具体实施例， 进一步阐述本发明。 0027 实施例 ： 0028 本实施例电化学实验在 CHI 660D 型电化学工作站 ( 上海辰华仪器有限公司 ) 上 进行 ； 紫外 - 可见 (UV-vis) 光谱实验采用 UV-8500 型紫外 - 可见分光光度计 ( 上海天美科 学仪器有限公司 ) ； 其他。
14、仪器为 FE20 实验室 pH 计 ( 梅特勒 - 托利多仪器上海有限公司 ) ； SK2200H 超声仪 ( 上海科导超声仪器有限公司 )。 0029 本发明过氧化氢生物传感器的制备方法如下 ： 0030 (1) 将 0.001mol/L 的肌醇六磷酸钙溶液在 90下加热回流 30 分钟 ； 说 明 书 CN 102495116 A 4 3/4 页 5 0031 (2) 移取 4L 上述肌醇六磷酸钙溶液滴加到预处理过的玻碳电极表面 (7mm2)， 于 4冰箱内晾干， 得到修饰肌醇六磷酸钙 (Ca-IP6) 膜的玻碳电极 (Ca-IP6/GCE) ； 0032 (3)取4L 5mg/mL的辣根。
15、过氧化物酶溶液滴涂在上述玻碳电极上， 置4冰箱内 晾干， 得辣根过氧化物酶 - 肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极 (HRP/Ca-IP6/GCE) ； 0033 (4) 将质量分数为 5的全氟磺酸溶液用 pH 7.0 磷酸缓冲液稀释至质量分数为 1、 pH 7.0， 滴加 3L 所得全氟磺酸溶液， 置 4冰箱内晾干， 即得本发明的过氧化氢生 物传感器 (Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE)。 0034 电化学交流阻抗技术 (EIS) 可以根据电极在修饰过程中阻抗的变化表征电极组 装的不同阶段， 是一种研究表面修饰电极界面性质的有效手段。 0035 图 1 是不同修饰层数的电极的电化学交流阻。
16、抗图， 利用电化学交流阻抗法 (EIS) 表征了 Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE 制备过程 ： 0036 曲线 (a) 是裸玻碳电极的交流阻抗曲线， 近似为一条直线， 表明裸玻碳电极表面 的电子迁移几乎不受什么阻碍， 其表面传递的电子受扩散控制 ； 曲线 (b) 是在裸电极上 修饰了 Ca-IP6后的交流阻抗谱， 由图可观察到一个微小的半圆， 表明 Ca-IP6膜的形成使 Fe(CN)64-/3-在电极表面的电子转移阻力加大 ； 曲线(c)是自组装HRP之后的交流阻抗谱， 由图看出 HRP/Ca-IP6/GCE(c) 半径明显增大， 这说明 HRP 通过与 Ca-IP6的磷酸酯键和。
17、 Ca2+ 的螯合作用， 吸附于电极表面， 在电极表面形成了介电子层， 阻碍了 Fe(CN)63-/Fe(CN)64-在 电极表面的电子传递过程 ； 由曲线 (d) 可以看出， Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE 阻抗弧的半径表 明电子在电极表面的迁移更加困难， 因此证明 HRP 成功地固定到了玻碳电极上。 0037 紫外可见光谱能够有效的监测亚铁血红素基团吸收带的变化， 以表征其结构的变 化。 0038 图 2 是本发明中 Ca-IP6、 HRP 这两种溶液及混合溶液的紫外 - 可见吸收光谱图 ： 0039 在波长 396nm 处出现 HRP(b) 的吸收峰， 而 Ca-IP6(a)。
18、 在所给的波长范围内没有任 何吸收峰 ； 当 HR 和 Ca-IP6混合后， 混合溶液 HRP-Ca-IP6(c) 中 HRP 的 Soret 吸收带位置与 纯 HRP 溶液中的 Soret 吸收带位置基本一致， 说明在 Ca-IP6溶液中的 HRP 能够保持自身天 然的生物活性和天然结构。 0040 图 3 为不同修饰电极的循环伏安图， 显示 (a) 裸玻碳电极， (b)Nafion/Ca-IP6/ GCE， (c)Nafion/HRP/GCE 和 (d)Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE 在 PBS 中的循环伏安 (CV) 响应信 号。 0041 结果表明， 在裸玻碳电极 (a) 。
19、和 Nafion/Ca-IP6/GCE(b) 中未观察到任何峰， 在曲 线(d)Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE上可以观察到一对明显的氧化还原峰， 而在(c)Nafion/HRP/ GCE 上有一对小峰， 这说明 Ca-IP6的存在促进 HRP 在电极表面的直接电化学行为， 为 HRP 提 供一个具有生物相容性的界面， 有效地加快 HRP 的直接电子转移速率。另外， Nafion 膜起 到了保护 HRP 生物活性， 防止酶流失的作用。 0042 图 4 为本发明传感器对不同浓度 H2O2的循环伏安图， 考察了 Nafion/HRP/Ca-IP6/ GCE 对 H2O2的电催化性能。 。
20、0043 从图上可以观察到， 在 PBS(pH 7.0) 溶液中， 当 H2O2加入到 PBS 后， Nafion/HRP/ Ca-IP6/GCE中HRP的Fe3+的还原峰电流随着H2O2浓度的增加而逐渐增大， 对应的HRP的Fe2+ 的氧化峰电流逐渐减小乃至消失， 表明 Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE 对 H2O2具有良好的电催化 说 明 书 CN 102495116 A 5 4/4 页 6 还原性能， 也进一步证明了 Ca-IP6保持了 HRP 的电催化活性。 0044 图 5 是本发明传感器 Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE 在 -0.25V 的工作电位下， 向 P。
21、BS(pH 7.0) 中连续加入 H2O2的计时电流响应曲线， 随着 H2O2浓度的不断增大， 还原电流逐渐增大。 0045 图 6 为本发明响应电流与 H2O2浓度的校正曲线的计时电流图， 反映了该传感器在 不同 H2O2浓度下对催化电流的线性校正关系， 看出响应电流和过氧化氢的浓度成线性关 系， 在 2.6710-7 1.06710-6mol L-1浓度范围内， 相关系数为 0.998(n 10)， 最低检测 限为 1.310-7mol L-1( 信噪比 S/N 3)。表观米氏常数 (apparent Michaelis-Menten constant，) 是一种与酶的浓度无关的酶促反应特。
22、征常数， 它可以表征酶与底物之间亲 合力的大小。可以通过 Lineweaver-Burk 方程求得 ： 0046 0047 式中， Iss 是加入底物后测得的稳态电流， C 是底物浓度， Imax 是底物达饱和后测 得的最大电流。米氏常数可根据稳态电流的倒数和 H2O2浓度的倒数作图后， 所得到的斜率 和截距求得。按此公式测得 Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE 的米氏常数为 0.259mmol L-1， 此处表 观米氏常数较低的米氏常数远远小于文献中所报道的值， 表明用该方法制作的传感器 对辣根过化物酶有较高的活性， 且具有更大的亲和力。 0048 将本发明传感器 Nafion/HR。
23、P/Ca-IP6/GCE 对同一浓度 H2O2溶液 (0.1mmol L-1) 进 行测定， 重复 5 组数据的相对标准偏差 (R.S.D.) 为 3.0。用相同方法所制备的 6 支不 同 Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE 电极， 对 H2O2溶液 (0.1mmol L-1) 的电流检测的相对标准偏差为 6.8， 这表明 Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE 有较好的重现性。 0049 将修饰好的电极在 pH 为 7.0 的 PBS 溶液中在扫速为 100mV-1下进行循环扫描 50 圈， 峰电位不变， 峰电流仅下降 3.6。实验后将修饰电极于 4下置于 pH 为 7.0 的 。
24、PBS 溶 液中放置一周， 其响应信号基本不变 ； 20 天后， 其响应信号为初始信号的 94， 一个月后， 其响应信号仍为初始信号的 91， 这表明 Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE 具有较好的稳定性。 0050 上述实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。 在阅读 了本发明记载的内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等效变 化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。 说 明 书 CN 102495116 A 6 1/3 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102495116 A 7 2/3 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102495116 A 8 3/3 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102495116 A 9 。