TDP-43细胞内存在量关联疾患的认定方法
技术领域
本发明涉及TDP-43细胞内存在量关联疾患的认定方法、以及降低 细胞内特定的mt-tRNA的存在量的药剂的制造方法或者抑制TDP-43 与核酸或多肽结合的结合抑制剂的制造方法。
背景技术
肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis：以下有时简 称为“ALS”)是由于脑干、脊髄、运动神经元的病变导致的上运动神 经元障碍、下运动神经元障碍进展，与之伴随而出现因肌萎缩和肌肉 力量下降而导致的上肢功能障碍、歩行障碍、、吞咽障碍、呼吸障碍等 症状的难以治疗的疾患。虽然已有使用人工呼吸器而生存较长时间的 例子，但病势的进展通常比较迅速，多在平均发病后3.5年因呼吸肌的 麻痹而死亡。
ALS中5～10％伴有家族史，被称为家族性肌萎缩性侧索硬化症 (家族性ALS)。已有报告，家族性ALS的大约2成的去除自由基的 酶Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1：superoxide dismutase 1)的基因发 生突变(ALS1)(非专利文献1)，而SOD1基因被认为是ALS的致病 基因之一。另外，作为其他的ALS的致病基因，已报告有血管生成素 (angiogenin)(非专利文献2)、小泡膜结合蛋白(VAMP： vesicle-associated membrane protein)/小突触泡结合蛋白B(VAPB： synaptobrevin-associated membrane protein B)(非专利文献3)、TAR DNA结合蛋白43(TDP-43：TAR DNA-binding protein)(非专利文献 4)以及fused in sarcoma/translated in liposarcoma(FUS/TLS)(非专利 文献5)等的基因。然而，为何这些基因的异常使ALS发病、病情如 何进展，其具体的机理仍不明确。
Maruyama等(非专利文献6)公开了在6例家族性ALS患者的3 例中，涉及抑制参与细胞内信号转导的NFκB的视神经蛋白(optineurin) 的基因具有突变。突变型视神经蛋白丧失了NFκB的抑制活性，因此 暗示了NFκB抑制剂具有ALS的治疗效果的可能性。然而，ALS的90～ 95％是单发性的，而多数ALS患者中，相比视神经蛋白基因，更多是 在TDP-43基因发现有突变。因此，即使NFκB抑制剂具有ALS治疗 效果，也仅能在一小部分的ALS患者身上期待治疗效果。
Rothstein等(非专利文献7)确认了在具有突变型SOD1基因的 ALS患者的脊髓液中，与具有野生型SOD1基因的健康个体相比，谷 氨酸(以下有时简称为“Glu”)的浓度增加近3倍，以及在集体研究 中单发性ALS患者的大约40％的脊髓液中Glu的增加，因此暗示伴随 Glu的增加，Glu毒性在ALS的发病机理中发挥重要的作用。ALS患 者中的这样的Glu的增加被认为是由于星形细胞丧失吸收Glu的能力 所致，因此，单发性ALS是由于Glu毒性，特别是通过谷氨酸受体的 亚型α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体的Glu增加所 致的Glu毒性，引发神经障碍的结果导致发病的假说最为有利。还有 关于人ALS运动神经元的AMPA受体的亚单元的GluR2 Q/R部位的 RNA编辑率低，在单发性ALS的病情中发挥重要作用的报告，(非专 利文献8～12)，支持该假说。
Lacomblez等(非专利文献13)公开了利鲁唑(Riluzole)对于ALS 患者的生存时间虽然延长少但能够明显地延长这一临床试验结果。利 鲁唑是基于上述假说开发的谷氨酸的拮抗剂。目前，仅有该利鲁唑作 为ALS的治疗药被欧美以及日本认可(商品名：RILUTEK)。然而， 利鲁唑不是抑制ALS的原因的Glu增加，只不过是减轻Glu增加导致 的Glu毒效的对症疗法，对于ALS的主症状的肌肉力量下降或别的临 床症状没有有效性。
专利文献1中公开了通过甲基钴胺素(Methylcobalamin)的大量 投药，能够对ALS的临床症状具有一定的改善效果，现在，正在进行 甲基钴胺素的双盲比较试验。然而，本药剂也主要是基于对谷氨酸导 致的细胞死亡的抑制效果(非专利文献14)，无法期待使利鲁唑的效果 发生很大改善。同时，关于甲基钴胺素对于ALS的效果，除了抑制Glu 毒性的效果以外，还会竞争性地阻碍高浓度的甲基钴胺素由S‐腺苷甲 硫氨酸的DNA的甲基化，维持基因的高转录(非专利文献15)，因此 促进神经再生所必要的各种蛋白质的合成，作为其结果，有可以保护 脊髄或大脑的运动神经细胞的推测。然而，因为没有与ALS的病情、 发病机理显示关联性的证据，所以单纯停留在一般性的推论。
另外，直到现在为止，ALS的诊断还没有能够确诊的特异性的临 床检查方法，现行是通过病历或神经表现进行综合判定，而发病前的 预计、发病早期的诊断或发病后的准确的诊断是困难的。
如上所述，至今还没有确立对于ALS的高精度的诊断方法、根治 疗法、以及发展抑制或者发展延迟疗法，所以其开发受到急切期望。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特願平9-41604号公报
非专利文献
非专利文献1：Rosen D.R.,et al.1993,Nature,362(6415)：59-62.
非专利文献2：Greenway M.J.,et al.2004,Neurology,63(10)： 1936-8.
非专利文献3：Ratnaparkhi A.,et al.2008,PLoS One,3(6)：e2334.
非专利文献4：Arai T.,et al.2006,Biochem.Biophys.Res.Commun., 351(3)：602-11.
非专利文献5：Kwiatkowski T.J.Jr,2009,Science,323(5918)： 1205-8
非专利文献6：Maruyama H.,et al.,2010,Nature,465：223-226
非专利文献7：Rothstein J.D.,et al.,1990,Ann,Neurol.,28：18-25.
非专利文献8：Trotti D.,et al.,1999,Nat.Neurosci.,1999,2：427-433.
非专利文献9：Rothstein J.D.,1996,Neuron,16：675-686.
非专利文献10：Bruijn L.I.,et al.1997,Neuron,18：327-338.
非专利文献11：Howland D.S.,et al.2002,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A,；99：1604-1609.
非专利文献12：Rothstein,J.D.,2009,Ann.Neurol.,65(suppl)： S3-S9.
非专利文献13：Lacomblez L.,1996,Lancet,347：1425-1431.
非专利文献14：Akaike A.,et al.,1993,Eur.J.Pharmacol.,241：1-6.
非专利文献15：Pfohl-Leszkowicz A,et al.,1991,Biochemistry,30： 8045-8051.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的是开发、提供一种对于ALS或额颞叶变性症 (frontotemporal lobar degeneration：以下有时简称为“FTLD”。包括含 有皮克小体的皮克氏病。)等与TAR DNA结合蛋白质-43(TAR DNA-binding Protein 43kDa：在本说明书中，以下，有时简称为 “TDP-43”)的细胞内存在量关联疾患的认定方法，以及TDP-43结合 抑制剂的制造方法。
用于解决课题的方法
为了解决上述课题，本发明的发明人等对于ALS患者之中突变频 率高的TDP-43基因进行研究。发现TDP-43基因在家族性ALS以及单 发性ALS中都有突变，因此暗示ALS是主要的致病基因 (Lagier-Tourenne,C.,and Cleveland,D.W.,2009,Cell,136；1001to 1004；Arai,et al.,2006,Biochem.Biophys.Res.Commun.,351:602-611； Neumann,et al.,2006,Science,314,130-133；Chen-Plotkin,et al.,2010, Nat.Rev.Neurol.,6:211-220；Lagier-Tourenne,et al.,2010,Hum.Mol. Genet.19:R46-R64；Kabashi,et al.,2008,Nat.Genet.40:572-574； Sreedharan,et al.,2008,Science,319:1668-1672；and Pesiridis,G.S.,et al., 2009,Hum.Mol.Genet.,18:R156-R162)。另外，已知ALS患者的病灶 部的细胞的细胞质中蓄积有含有TDP-43的沉积物(Arai T,et al., Biochem Biophys Res Commun.,2006,351:602-611)。然而，TDP-43的 在细胞内的功能或TDP-43基因的突变与ALS的发病有怎样的关联， 其机理至今是完全不清楚的。虽然对多个在TDP-43有突变的单发性 ALS的病例，通过调查全组基因探索TDP-43的作用基因的研究仍在进 行，但至今尚未获得能够用于开发新治疗法以及其筛选法的结果 (Sephton C.F.,et al.,2011,J.Biol.Chem.286:1204-1215.；Polymenidou M,et al.,2011,Nat.Neurosci.,14(4):459-68.；and Tollervey J.R.,et al., 2011,Nat.Neurosci.,14(4):452-458)。
本发明的发明人等着眼于TDP-43的氨基酸序列中存在作为RNA 结合序列的RRM(RNA Recognition Motif)结构域，经过深入研究， 结果明确了TDP-43涉及4种的线粒体tRNA(以下简称“mt-tRNA”)， 即，mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro的生物合成 或者代谢和谷氨酸/谷氨酰胺以及天冬氨酸/天冬酰胺的氨基酸代谢，是 在该mt-tRNA或氨基酸的生物合成或者代谢时作为的支架的支架蛋白 质，而且控制该mt-tRNA或氨基酸在细胞内的存在量。另外，还明确 了TDP-43涉及能量代谢的控制，TDP-43在细胞内的存在量和ATP或 者活性氧的细胞内量具有相关关系。而且发现，因细胞内的TDP-43的 表达水平的增加而引发的细胞死亡和TDP-43与一部分的mt-tRNA的 结合量的增加相关，将该结合降低至正常值后不再发生细胞死亡。本 发明就是基于该认识而完成的发明，具体而言，提供以下的发明。
(1)一种与TDP-43的细胞内存在量相关联的疾患的认定方法， 其特征在于，包括：
测定工序，测定来自检测对象的细胞内的以下(a)～(e)中的至 少一项、以及
认定工序，将由所述测定工序获得的测定值与来自健康个体的细 胞内的对应的测定值相比较，在两者的值在统计学上具有显著差异的 情况下，将该检测对象认定为罹患了所述疾患，
(a)选自mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro中的至少一种mt-tRNA的存在量、
(b)谷氨酸和/或天冬氨酸的存在量、
(c)ATP或者活性氧的存在量、
(d)选自Aralar 1、Aralar 2、GDH以及Musashi 2中的至少一种 多肽与TDP-43的结合量、或者
(e)选自mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro中的至少一种mt-tRNA与TDP-43的结合量。
(2)如(1)所述的认定方法，其中，所述疾患是将来自检测对 象的细胞内的TDP-43的存在量与来自健康个体的细胞内的该存在量 相比较，在统计学上具有显著增加的疾患。
(3)如(1)或(2)所述的认定方法，其中，所述TDP-43是在 序列号1所示氨基酸序列中，以起始蛋氨酸为1位时，具有90位的丙 氨酸被缬氨酸(以下，有时简称为“A90V”)、169位的天冬氨酸被甘 氨酸(以下，有时简称为“D169G”)、267位的天冬酰胺被丝氨酸(以 下，有时简称为“N267S”)、287位的甘氨酸被丝氨酸(以下，有时简 称为“G287S”)、290位的甘氨酸被丙氨酸(以下，有时简称为“G290A”)、 292位的丝氨酸被天冬酰胺(以下，有时简称为“S292N”)、294位的 甘氨酸被丙氨酸(以下，有时简称为“G294A”)、294位的甘氨酸被缬 氨酸(以下，有时简称为“G294V”)、295位的甘氨酸被精氨酸(以下， 有时简称为“G295R”)、295位的甘氨酸被丝氨酸(以下，有时简称为 “G295S”)、298位的甘氨酸被丝氨酸(以下，有时简称为“G298S”)、 311位的蛋氨酸被缬氨酸(以下，有时简称为“M311V”)、315位的丙 氨酸被苏氨酸(以下，有时简称为“A315T”)、315位的丙氨酸被谷氨 酸(以下，有时简称为“A315E”)、331位的谷氨酰胺被赖氨酸(以下， 有时简称为“Q331K”)、332位的丝氨酸被天冬酰胺(以下，有时简称 为“S332N”)、335位的甘氨酸被天冬氨酸(以下，有时简称为“G335D”)、 337位的蛋氨酸被缬氨酸(以下，有时简称为“M337V”)、343位的谷 氨酰胺被精氨酸(以下，有时简称为“Q343R”)、345位的天冬酰胺被 赖氨酸(以下，有时简称为“N345K”)、348位的甘氨酸被半胱氨酸(以 下，有时简称为“G348C”)、352位的天冬酰胺被丝氨酸(以下，有时 简称为“N352S”)、352位的天冬酰胺被苏氨酸(以下，有时简称为 “N352T”)、357位的甘氨酸被丝氨酸(以下，有时简称为“G357S”)、 361位的精氨酸被丝氨酸(以下，有时简称为“R361S”)、363位的脯 氨酸被丙氨酸(以下，有时简称为“P363A”)、378位的天冬酰胺被天 冬氨酸(以下，有时简称为“N378D”)、379位的丝氨酸被半胱氨酸(以 下，有时简称为“S379C”)、379位的丝氨酸被脯氨酸(以下，有时简 称为“S379P”)、382位的丙氨酸被脯氨酸(以下，有时简称为“A382P”)、 382位的丙氨酸被苏氨酸(以下，有时简称为“A382T”)、383位的异 亮氨酸被缬氨酸(以下，有时简称为“I383V”)、384位的甘氨酸被精 氨酸(以下，有时简称为“G384R”)、390位的天冬酰胺被天冬氨酸(以 下，有时简称为“N390D”)、390位的天冬酰胺被丝氨酸(以下，有时 简称为“N390S”)、或393位的丝氨酸被亮氨酸(以下，有时简称为 “S393L”)取代的突变，或者，374位的酪氨酸以后缺失的突变。
(4)如(3)所述的认定方法，其中，所述突变是D169G、G298S 或者R361S。
(5)如(1)～(4)中任一项所述的认定方法，其中，所述疾患 是神经系统疾患。
(6)如(5)所述的认定方法，其中，所述疾患选自肌萎缩侧索 硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病以及额颞叶变性症。
(7)一种降低细胞内天冬氨酸、谷氨酸、ATP或者活性氧的存在 量的药剂的制造方法，其特征在于，包括：
导入工序，将药剂候补物质导入细胞内；
测定工序，测定含有所述药剂候补物质的细胞和不含所述药剂候 补物质的细胞中的所述天冬氨酸、谷氨酸、ATP或者活性氧的存在量；
选择工序，比较所述测定工序中获得的两种细胞的测定值，在含 有所述药剂候补物质的细胞的测定值在统计学上显著低的情况下，选 择该药剂候补物质作为目的药剂。
(8)一种TDP-43结合抑制剂的制造方法，其特征在于，包括：
混合工序，将下述(a)和/或(b)和TDP-43与药剂候补物质一 起混合，
(a)选自mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro的至少一种mt-tRNA，
(b)选自Aralar1、Aralar2、GDH以及Musashi 2的至少一种蛋白 质；
检测工序，检测所述mt-tRNA和/或所述蛋白质与所述TDP-43 的结合量；
选择工序，在所述结合未被检测的情况下，或者被检测的结合量 与不存在所述药剂候补物质时所对应的mt-tRNA和/或蛋白质与 TDP-43的结合量相比较，两者的值在统计学上具有显著差异的情况下， 选择该药剂候补物质作为TDP-43结合抑制剂。
(9)如(8)所述的制造方法，其中，所述药剂候补物质是在所 述(a)所示的mt-tRNA或者所述(b)所示的蛋白质之间，与TDP-43 竞争性结合的物质。
(10)如(8)所述的制造方法，其中，所述药剂候补物质是降低 细胞内的活性状态的所述(a)所示的mt-tRNA或者所述(b)所示的 蛋白质的存在量的物质。
(11)如(9)或(10)所述的制造方法，其中，所述药剂候补物 质是核酸分子、肽或者低分子化合物。
(12)如(11)所述的制造方法，其中，所述药剂候补物质是下 述(a)、(b)、(c)或者(d)：
(a)含有由序列号2、4或5所示的氨基酸序列组成的多肽的100 个氨基酸以下的多肽、
(b)含有在序列号2、4或5所示的氨基酸序列中包含1～3个氨 基酸的添加、缺失或取代的多肽的130个氨基酸以下的多肽、
(c)由与序列号2、4或5所示的氨基酸序列具有90％以上的同 一性的氨基酸序列组成的多肽、
(d)由序列号2、4或5所示的氨基酸序列组成的多肽的一部分。
(13)如(11)所述的制造方法，其中，所述药剂候补物质是与 含有由TGG或UGG以及/或者GTT或GUU组成的碱基序列的5～ 50个碱基的核酸分子结合的、由下述(a)、(b)或(c)构成的由9～ 20个氨基酸组成的肽，
(a)由序列号2所示的氨基酸序列组成的肽的一部分、
(b)由序列号2所示的氨基酸序列中含有1～3个氨基酸的添加、 缺失或取代的肽的一部分、
(c)由与序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨 基酸序列组成的肽的一部分。
(14)如(7)～(11)中任一项所述的制造方法，其中，所述TDP -43是在序列号1所示氨基酸序列中，以起始蛋氨酸为1位时，具有 A90V、D169G、N267S、G287S、G290A、S292N、G294A、G294V、 G295R、G295S、G298S、M311V、A315T、A315E、Q331K、S332N、 G335D、M337V、Q343R、N345K、G348C、N352S、N352T、G357S、 R361S、P363A、N378D、S379C、S379P、A382P、A382T、I383V、 G384R、N390D、N390S或S393L的突变，或者具有374位的酪氨酸 以后缺失的突变。
(15)如(14)所述的制造方法，其中，所述突变是D169G、G298S 或者R361S。
(16)如(7)～(15)中任一项所述的制造方法，其中，(7)所 述的降低氨基酸、ATP或者活性氧的细胞内存在量的药剂或者(8)～ (15)中任一项所述的TDP-43结合抑制剂是与TDP-43的细胞内存在 量相关联的疾患治疗剂的有效成分。
(17)如(16)所述的制造方法，其中，所述与TDP-43的细胞内 存在量相关联的疾患是，将来自检测对象的细胞内的TDP-43的存在量 与来自健康个体的细胞内的该存在量相比较，在统计学上有显著增加 的疾患。
(18)如(16)或(17)所述的制造方法，其中，所述疾患是神 经系统疾患。
(19)如(18)所述的制造方法，其中，所述疾患选自肌萎缩侧 索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病以及额颞叶变性症。
(20)一种TDP-43结合抑制剂，其含有两个以上由TG或UG和 /或GT或GU组成的碱基序列，抑制mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、 mt-tRNAGlu或者mt-tRNAPro与TDP-43的结合，由5～50个碱基的核酸 分子组成。
(21)如(20)所述的TDP-43结合抑制剂，其含有两个以上由 TGG或UGG以及/或者GTT或GUU组成的碱基序列，由6～50个 碱基的核酸分子组成。
(22)如(20)或(21)所述的TDP-43结合抑制剂，其中，所述 碱基序列含有连续的重复序列。
(23)如(22)所述的TDP-43结合抑制剂，其中，所述重复次数 为3～15次。
(24)如(23)所述的TDP-43结合抑制剂，其含有序列号43、 45或者46所示的碱基序列。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的《日本国特许出愿 2012-042256号》的说明书和/或附图所述的内容。
发明的效果
根据本发明的认定方法，能够以高精度认定检测对象是否罹患以 ALS以及FTLD为首的，与TDP-43在细胞内的存在量相相关联的疾患。
根据本发明的制造法，能够高效地选择可能成为对于以ALS以及 FTLD为首的，与TDP-43的细胞内存在量相关联的疾患治疗的有效成 分的物质。
根据本发明的TDP-43结合抑制剂，可能提供与TDP-43的细胞内 存在量相关联的疾患治疗的有效成分。
附图说明
图1表示通过拉下DAP-TDP-43而免疫共沉淀的RNA的尿素变性 PAGE的结果。框内的带1～3显示的是与DAP-TDP-43特异性结合的 RNA。右图是使左图的右侧两列过度曝光的图。
图2是纳米LS-MS/MS的结果。
图3的A表示将通过拉下DAP-TDP-43而免疫共沉淀的RNA经尿 素变性PAGE后使用SYBR金染色的结果。B表示以DAP-TDP-43免 疫共沉淀的mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAPro以及mt-tRNAGlu的 RNA印迹法的结果。
图4的A表示转染了TDP-43-siRNA或者对照(非特异性siRNA) 的HeLa细胞中的TDP-43蛋白质的蛋白质印迹法的检测结果。B表示 转染了TDP-43-siRNA或者对照的HeLa细胞的细胞增殖率。
图5表示由TDP-43-siRNA处理引起的各种RNA在HeLa细胞内 的存在量的变动。5.8S表示5.8S rRNA，U1表示U1snRNA，Asn表示 mt-tRNAAsn，Gln表示mt-tRNAGln，Leu表示mt-tRNALeu(UUR)。该结果 基于至少三次的独立实验结果。
图6的A表示当DAP-TDP-43过量表达时，对DAP-TDP-43和内 源性TDP-43进行蛋白质印迹法解析的结果。B表示当DAP-TDP-43过 量表达时，对mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln、以及5.8S rRNA进行RNA 印迹法解析的结果。
图7的A表示mt-tRNAAsn或者mt-tRNAGln的经时分解的图。B表 示与DAP-TDP-43的经时免疫共沉淀的结果。
图8的A表示野生型TDP-43以及各结构域缺失型TDP-43的构造 的示意图。黒棒以及白棒表示TPD-43中的结构域。棒下方的数值表示 在TDP-43的氨基酸序列中，以起始蛋氨酸为1位时的位置。B表示野 生型TDP-43以及各结构域缺失型TDP-43表达株中由强力霉素诱导表 达的细胞内的各蛋白质的蛋白质印迹法的结果。C表示与野生型 TDP-43以及各结构域缺失型TDP-43结合的mt-tRNAAsn以及 mt-tRNAGln的RNA印迹法的结果。
图9是表示由结构域缺失型TDP-43诱导的细胞毒性的图。该结果 基于至少三次的独立实验结果。
图10的A表示实验中使用的野生型TDP-43以及各突变型TDP-43 的示意图。图中，星标表示各突变型TDP-43中的突变(点突变)的位 置。D169G是TDP-43的氨基酸序列169位的D被G取代的突变、G298S 是TDP-43的氨基酸序列298位的G被S取代的突变、R361S是TDP-43 的氨基酸序列361位的R被S取代的突变。B是表示野生型以及各突 变型TDP-43表达株的生存率的图。
图11是表示通过强力霉素诱导野生型以及各突变型TDP-43表达 时各mt-tRNA在细胞内的存在量的图。所示各值为将未添加强力霉素 时(-dox)规定为1时的诱导表达时(+dox)的相对值。
图12表示通过拉下DAP-TDP-43而免疫共沉淀的新型TDP-43结 合蛋白质的蛋白质印迹法的结果。
图13的A表示aralar 1以及aralar 2的互换免疫沉降的结果。B表 示与aralar 1或者aralar 2免疫共沉淀的mt-tRNAAsn的结果。
图14表示通过拉下Musashi2而免疫共沉淀的mt-tRNA间的RNA 印迹法的结果。
图15是表示aralar 1或者aralar 2与结构域缺失型TDP-43的结合 的图。
图16的A是表示通过TDP-43-siRNA抑制TDP-43表达时每个细 胞的ATP存在量的图。B表示通过强力霉素诱导使DAP-TDP-43过量 表达时每个细胞的ATP存在量的图。
图17-1是表示各结构域缺失型TDP-43表达时的mt-tRNAAsn、 mt-tRNAGln以及tRNALeu的细胞内存在量的图。所示各值为将未添加强 力霉素时(-dox)规定为1时的诱导表达时(+dox)的相对值。
图17-2表示各结构域缺失型TDP-43表达时的ATP的测定结果。
图18表示具有ALS样突变型TDP-43(D169G、G298S、R361S) 的诱导表达型细胞系中，上述突变型TDP-43诱导后的ATP的细胞内 存在量的图。
图19表示将与TDP-43结合的4种mt-tRNA的序列比对的图。图 中的星号表示在全部4种mt-tRNA中皆被保留的碱基。另外，将相当 于各mt-tRNA形成高级结构时的D环、反密码子环、可变区域、T环 以及接受臂的碱基示于序列下部。
图20是表示与TDP-43结合的mt-tRNAAsn的二级结构。图中的附 有星号的碱基是图19中所示的与TDP-43结合的全部4种mt-tRNA中 皆被保留的碱基。图中的箭头表示与实施例13(2)的竞争性测试中使 用的TDP-43结合抑制剂候补寡核苷酸(D-loop、Anticodon、T-loop) 所对应的mt-tRNA的分割部位。需要说明的是，由于该图中将mt-tRNA 以DNA表示，因此U被T取代。
图21是表示通过TDP-43结合抑制剂候补寡核苷酸抑制TDP-43 与mt-tRNA结合的图。A表示通过Flag-IP而与DAP-TDP-43免疫共沉 淀的核酸的尿素变性PAGE的结果。图中所示的mt-tRNA表示与 TDP-43结合的4种mt-tRNA。B表示在竞争反应中与DAP-TDP-43免 疫共沉淀的mt-tRNAAsn的RNA印迹法的结果。
图22是表示通过具有重复序列的各种TDP-43结合抑制剂候补寡 核苷酸抑制TDP-43与mt-tRNA结合的图。A表示通过Flag-IP而与 DAP-TDP-43发生免疫共沉淀的寡核苷酸的尿素变性PAGE的结果。图 中的mt-tRNA表示与TDP-43结合的4种mt-tRNA。B表示在竞争反 应中与DAP-TDP-43免疫共沉淀的mt-tRNAAsn的RNA印迹法的结果。
图23是表示加入各浓度的(TG)12时抑制TDP-43与mt-tRNA结合 的图。A表示通过Flag-IP而与DAP-TDP-43免疫共沉淀的mt-tRNA的 尿素变性PAGE的结果。B表示在竞争反应中与DAP-TDP-43免疫共 沉淀的mt-tRNAAsn的RNA印迹法的结果。C为将B的结果图表化的 图。
图24是表示细胞内的TDP-43与活性氧量的经时关系的图。
具体实施方式
1.TDP-43细胞内存在量关联疾患的认定方法
1-1.概要
本发明的第1方式是TDP-43细胞内存在量关联疾患的认定方法。 本方式的方法的特征在于，通过测定从检测对象采集的细胞中的测定 物质的存在量或者测定物质与TDP-43的结合量等，认定该检测对象是 否罹患TDP-43细胞内存在量关联疾患。
1-2.对象疾患
本发明的对象疾患是“TDP-43细胞内存在量关联疾患”。在这里， “TAR DNA结合蛋白质-43(TDP-43：TAR DNA-binding Protein 43kDa)”是，不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein：hnRNP)的一种。TDP-43在分子内具有两个RNA 结合结构域，是能够在细胞内的核质和细胞质间往来的蛋白质。本说 明书中，TDP-43除了由序列号1所示氨基酸序列组成的人野生型 TDP-43以外，还包含由序列号1所示氨基酸序列中含有1个或者数个 氨基酸的缺失、取代和/或添加的氨基酸序列组成的人突变型TDP-43、 以及与序列号1所示氨基酸序列具有85％以上，优选90％以上，更优 选95％以上同一性的氨基酸序列组成的、且与人野生型TDP-43具有同 等功能的人突变型TDP-43或其他物种的TDP-43同源体。需要说明的 是，本说明书中，“数个”意为2～10的整数，例如意为2～7、2～5、 2～4、2～3的整数。另外，本说明书中的“同一性”意为，在两个氨 基酸序列间，以使氨基酸的一致数为最大的方式，根据需要在一方或 者双方导入间隙(gap)而进行比对时，相对于一方的氨基酸序列(在 此为序列号1所示氨基酸序列)的全部氨基酸数，另一方的氨基酸序 列中与上述一致的氨基酸数的比例(％)。
作为由在上述序列号1所示氨基酸序列中含有1个或者数个氨基 酸的取代、或者缺失的氨基酸序列组成的人突变型TDP-43的具体例， 能够列举例如，在序列号1所示氨基酸序列中以起始蛋氨酸为1位时 (以下，在本说明书中相同)，90位的丙氨酸被缬氨酸(A90V)、 169位的天冬氨酸被甘氨酸(D169G)、267位的天冬酰胺被丝氨酸 (N267S)、287位的甘氨酸被丝氨酸(G287S)、290位的甘氨酸被丙 氨酸(G290A)、292位的丝氨酸被天冬酰胺(S292N)、294位的甘氨 酸被丙氨酸(G294A)、294位的甘氨酸被缬氨酸(G294V)、295位的 甘氨酸被精氨酸(G295R)、295位的甘氨酸被丝氨酸(G295S)、298 位的甘氨酸被丝氨酸(G298S)、311位的蛋氨酸被缬氨酸(M311V)、 315位的丙氨酸被苏氨酸(A315T)、315位的丙氨酸被谷氨酸(A315E)、 331位的谷氨酰胺被赖氨酸(Q331K)、332位的丝氨酸被天冬酰胺 (S332N)、335位的甘氨酸被天冬氨酸(G335D)、337位的蛋氨酸被 缬氨酸(M337V)、343位的谷氨酰胺被精氨酸(Q343R)、345位的天 冬酰胺被赖氨酸(N345K)、348位的甘氨酸被半胱氨酸(G348C)、352 位的天冬酰胺被丝氨酸(N352S)、352位的天冬酰胺被苏氨酸(N352T)、 357位的甘氨酸被丝氨酸(G357S)、361位的精氨酸被丝氨酸(R361S)、 363位的脯氨酸被丙氨酸(P363A)、378位的天冬酰胺被天冬氨酸 (N378D)、379位的丝氨酸被半胱氨酸(S379C)、379位的丝氨酸被 脯氨酸(S379P)、382位的丙氨酸被脯氨酸(A382P)、382位的丙氨 酸被苏氨酸(A382T)、383位的异亮氨酸被缬氨酸(I383V)、384位 的甘氨酸被精氨酸(G384R)、390位的天冬酰胺被天冬氨酸(N390D)、 390位的天冬酰胺被丝氨酸(N390S)、或393位的丝氨酸被亮氨酸 (S393L)分别取代的突变，或者具有374位的酪氨酸以后缺失的突变 的人突变型TDP-43。优选具有D169G、G298S、或者R361S的突变的 人突变型TDP-43。
本说明书中，“TDP-43细胞内存在量关联疾患”意为已知将单位 个数细胞内的TDP-43存在量与健康个体的该量相比，在统计学上有显 著增加或者减少的疾患。TDP-43在健康个体的细胞内，每个细胞中的 存在量受到极为严格的控制(Ayala,Y.M.,et al.,2011,EMBO J.30(2): 277-288.)。因此，当其细胞内存在量脱离正常范围变动时，表示该个 体在身体上出现某种异常。TDP-43细胞内存在量关联疾患只要是 TDP-43的细胞内存在量脱离正常范围的疾患，就不论疾患种类。另外， 也可以是TDP-43在细胞内的存在量的变动和疾患的关联性尚未查明 的疾患。优选已知将单位个数细胞的上述TDP-43的存在量与健康个体 的该量相比较，在统计学上有显著增加的疾患。
本说明书中的“健康个体”意为至少没有罹患TDP-43细胞内存在 量关联疾患的动物个体，优选没有罹患任何疾患的健康的动物个体。 健康个体原则上是与后述的检测对象同种的，优选与检测对象的机体 条件接近的个体，例如，亚种(包含人种、品种)、性別、年龄(包含 月龄、周龄)、体重、体质(过敏等)、既往病史相同或者接近条件的 个体。
本说明书中“在统计学上显著”意为，将来自检测对象的细胞以 及与其同等个数的来自健康个体的细胞中存在的TDP-43的量的差异 通过统计学处理时，在两者间具有显著差异的情况。具体而言，能够 列举例如，危险率(显著性水平)小于5％、1％或者0.1％的情况。统 计学的处理的检验方法可以适当使用能够判断有无显著性的公知的检 验方法，不做特别限定。例如能够使用t检验法(Student's t test)、多 重比较检验法。
作为TDP-43细胞内存在量关联疾患的具体例，已知的TDP-43的 存在量与健康个体的该量相比在统计学上有显著增加的疾患大多是神 经系统疾患。因此，神经系统疾患适合作为本发明的对象疾患。作为 这样的神经疾患，能够列举例如ALS、FTLD、阿尔茨海默病(AD： Alzheimer disease)或者帕金森病(PD：Parkinson disease)。ALS或者 FTLD优选为本发明的对象疾患。
1-3.认定方法
本发明的TDP-43细胞内存在量关联疾患的认定方法包括测定工 序以及认定工序。以下，对于各工序进行具体说明。
(1)测定工序
本方式中，“测定工序”是测定来自检测对象的细胞内的测定物质 的细胞内存在量或者与TDP-43的结合量的工序。
本说明书中，“检测对象”意为供检查的个体，即指后述的提供细 胞的动物个体。此处所说动物意为脊椎动物，优选哺乳动物，更优选 人类。
本说明书中，“来自检测对象的细胞”意为从检测对象采集的细胞。 不限定是来自何种器官或者组织的细胞。本发明中能够适当使用脑神 经系统细胞、脑脊液细胞或者血液细胞等。或者，本发明中也能够适 当使用从基于由检测对象采集的皮肤等的细胞制作的诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cell；iPS细胞)诱导分化的神经细胞(运动 神经元)等。这些细胞通过公知的采集方法采集即可。或者也可以是 将来自检测对象的细胞通过培养而增殖的细胞。例如，在采集血液细 胞的情况下，能够通过向末梢部的静脈等进行注射而采集末梢血获得。 另外，如果是脑脊液细胞，则能够通过公知的腰椎穿刺采集脑脊液获 得。上述细胞可以在从检测对象采集后立即使用，也可以经冷冻或者 冷藏保存一定时间后，根据需要进行解冻等处理后使用。本工序中所 使用的细胞的量若为至少2×106个，优选至少1×106个，更优选至少 5×105个，则能够将后述的测定物质充分检测。
本方式中，“测定物质”意为在本工序中需要测定的物质，具体而 言，有下述物质：
(i)4种mt-tRNA，即mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及 mt-tRNAPro，
(ii)谷氨酸(Glu)以及天冬氨酸(Asp)，
(iii)ATP或者活性氧，或者
(iv)Aralar 1、Aralar 2、GDH以及Musashi 2。
本测定工序中，需要测定的值为：
(a)选自上述(i)所示mt-tRNA组中的至少一种mt-tRNA在细 胞内的存在量，
(b)上述(ii)所示任意一方或者双方的氨基酸在细胞内的存在 量，优选氨基酸浓度，
(c)上述(iii)所示ATP或者活性氧的细胞内存在量，优选ATP 浓度或者活性氧浓度，
(d)选自上述(iv)所示的多肽中的至少一种多肽与TDP-43的 结合量，或者
(e)选自上述(i)所示的mt-tRNA组中的至少一种mt-tRNA与 TDP-43的结合量。
本说明书中，“(细胞内)存在量”意为在细胞中所含的测定物质 的分量。存在量可以是浓度、荧光强度、离子强度或者放射线强度等 相对量，也可以是容量等规定单位细胞个数的测定物质的绝对量。
本说明书中，“TDP-43的结合量”意为与规定量的TDP-43直接或 者间接结合的测定物质的相对量或者绝对量。所以，“测定所测定物质 的细胞内存在量或者与TDP-43的结合量”意为，将测定物质的细胞内 存在量或者与TDP-43的结合量定量。
上述(d)所示的测定物质的结合量中，关于Aralar 1以及Aralar 2， 更具体而言，是与TDP-43中的GR结构域和/或315结构域的结合量。 另外，上述(e)所示的测定物质的结合量，更具体而言，是从上述(i) 所示mt-tRNA组中选取的至少一种mt-tRNA与TDP-43中的RRM1 (RNA Recognition Motif-1)结构域的结合量。上述(a)～(e)测定 其中任意一个量即足够，但也可以测定两个以上的量。通过测定二个 以上，能够消除测定误差等导致的误认定，确保较高的认定精度。
需要说明的是，健康个体中，一个细胞中的上述(a)～(e)所示 测定物质的存在量或者结合量被极为严格地控制在不超过规定量的 10％的范围。本发明的发明人明确了上述(a)～(e)所示的测定物质 的存在量或者结合量的变动与TDP-43细胞内存在量关联疾患具有密 切的关联性。所以，通过测定(a)～(e)所示的存在量或者结合量， 能够认定是否罹患TDP-43细胞内存在量关联疾患。
本工序中的具体的的测定方法因测定上述(a)～(e)所示的何 种测定物质而异。
测定(a)所示的mt-tRNA在细胞内的存在量的方法只要是测定 RNA领域所公知的方法，便不做特别限制。例如能够利用使用具有与 目标mt-tRNA的全部或者一部分的碱基序列互补的碱基序列且能够特 异性检测目标mt-tRNA的核酸探针的检测方法、或者定量RT-PCR法 等。使用核酸探针的检测方法中，能够列举例如RNA印迹法、表面等 离子体共振(SPR：Surface Plasmon Resonance)法或者石英晶体微天 平(QCM：Quarts Crystal Microbalance)法。上述方法都是该领域公知 技术，在本发明中也遵循公知的方法进行即可。具体而言，例如，参 照Sambrook,J.et.al.,(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual Third Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York或，森泉丰荣、中本高道，(1997)《传感器工学》，昭晃堂；稻田 利文、盐见春彦，2008，羊土社，《RNA实验笔记》所述的方法即可。 为了获得较准确的测定结果，可以将上述二种以上的方法组合使用。
另外，测定(b)所示的氨基酸的存在量，以及(c)所示的ATP 或者活性氧的存在量的方法，能够利用例如质谱法、NMR法或者荧光 素酶显色法。质谱法包含高效液相色谱-质谱法(Liquid Chromatography- Mass Spectrometry法；以下简称“LC-MS”)、高效液相色谱-串联质谱 法(以下简称LC-MS/MS)、气相色谱-质谱法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry)、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)、毛细管电泳-质 谱法(CE-MS)以及ICP质谱法(ICP-MS)。上述方法都是该领域公 知技术，遵循这些方法进行即可。例如，参照Iijima et al.,The Plant Journal(2008)54,949-962,Hirai et al.Proc Natl Acad Sci USA(2004) 101(27)10205-10210，Sato et al.,The Plant Journal(2004)40(1) 151-163，或者Shimizu et al.,Proteomics(2005)5,3919-3931即可。 优选测定方法为LC-MS或者LC-MS/MS。
进而，测定(d)所示的多肽与TDP-43的结合量的方法只要是检 测蛋白质间相互作用的该领域公知的方法，便不做特别限制。能够列 举例如特异性识别各个多肽的抗体，即，抗Aralar 1抗体、抗Aralar 2 抗体、抗GDH抗体或者抗Musashi 2抗体，以及使用抗TDP-43抗体 的免疫学测定法。本说明书中的特异性识别各个多肽的抗体可以是多 克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体中的任意一种。重组抗体包含嵌和 抗体以及合成抗体。另外，此处的“合成抗体”意为使用化学方法或 者DNA重组法合成的抗体。能够列举例如单链Fv(scFv：single chain Fragment of variable region)、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody) 或者四链抗体(tetrabody)等。免疫学的测定法包含例如免疫共沉淀法、 Far-western blotting法、ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 法、酶抗体法、放射免疫测定法。这些方法都是该领域公知的方法， 在本发明中，原则上遵循公知的方法进行即可。具体而言，例如参照 Sambrook,J.et.al.,(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual Third Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York所述方法即可。
而后，测定(e)所示的mt-tRNA与TDP-43的结合量的方法只要 是检测RNA与蛋白质间的相互作用的该领域公知的方法，便不做特别 限制。能够列举例如使用具有与各目标mt-tRNA的全部或者一部分的 碱基序列互补的碱基序列且能够特异性检测各目标mt-tRNA的核酸探 针以及抗TDP-43抗体的免疫学核酸测定法。具体而言，例如包含免疫 共沉淀法、Far-western blotting法、RNA印迹法、ELISA法、RT-PCR 法。
(2)认定工序
本方式中，“认定工序”意为将由上述测定工序获得的测定值与来 自健康个体的细胞内的对应的测定值相比较，若两者的值在统计学上 具有显著差异，则认定该检测对象罹患上述疾患的认定工序。
“来自健康个体的细胞内的对应的测定值”意为，与上述测定工 序获得的来自检测对象的细胞内的上述(a)～(e)的测定值相对应 的来自健康个体的细胞内的上述(a)～(e)的测定值。例如，在上 述测定工序中测定来自检测对象的细胞内的规定的mt-tRNA的存在量 的情况下，来自健康个体的细胞内的该规定的mt-tRNA的存在量的测 定值为来自健康个体的细胞内的对应的测定值。
上述来自健康个体的细胞内的对应的测定值是与来自检测对象的 细胞内的测定物质的测定在相同方法以及相同条件下测定的值。所以， 上述测定工序中，也可以与测定来自检测对象的细胞内的测定物质一 起，在相同方法以及相同条件下测定来自健康个体的细胞内的对应的 测定物质。另外，也能够预先测定各种生理条件下的健康个体的(a)～ (e)的测定值并建立数据库，在测定来自检测对象的细胞内的测定物 质时，调出该数据库中与检测对象的生理条件最接近的健康个体的数 据，以该数据上的测定物质的测定方法以及测定条件对来自检测对象 的细胞内的测定物质进行测定。这种情况下，即使在没有作为比较对 象的来自健康个体的样品的情况下，也能够认定是否罹患TDP-43细胞 内存在量关联疾患，因此是便利的。
上述统计学上的显著差异既可以是细胞内的来自检测对象的测定 物质的存在量或者结合量多于来自健康个体的对应的该量，也可以是 少于来自健康个体的对应的该量。由于上述测定物质通常被调控在规 定的范围内，因此超出该范围时，不论多少，都可能和TDP-43细胞内 存在量关联疾患有关。
所以，例如，对于(a)所示的mt-tRNA的存在量而言，在来自检 测对象的细胞中的量明显多于或者少于来自健康个体的细胞的情况 下，认定该检测对象罹患TDP-43细胞内存在量关联疾患的可能性高。 同样，对于(b)所示的氨基酸的存在量或者(c)所示的ATP或活性 氧的存在量而言，在来自检测对象的细胞中的量明显地多于或者少于 来自健康个体的细胞的量的情况下，认定该检测对象有罹患TDP-43细 胞内存在量关联疾患的可能性。而且，对于(d)所示的多肽与TDP-43 的结合量或者(e)所示的mt-tRNA与TDP-43的结合量而言，在来自 检测对象的细胞中的量明显地多于或者少于来自健康个体的细胞的量 的情况下，认定该检测对象罹患TDP-43细胞内存在量关联疾患的可能 性高。更具体而言，例如，在来自有与ALS类似的症状或者征兆的检 测对象的细胞中，(a)所示的mt-tRNA的存在量明显地多于来自健康 个体的细胞的情况、(b)所示的氨基酸的存在量或者(c)所示的ATP 或活性氧的存在量明显地多于来自健康个体的细胞的情况、或者(d) 所示的多肽与TDP-43的结合量或者(e)所示的mt-tRNA与TDP-43 的结合量明显地多于来自健康个体的细胞的情况下，认定该检测对象 罹患有ALS的可能性高。通过将检测对象与健康个体中的两种以上的 测定物质的测定值进行比较，相对于测定单一的测定物质时的假阳性 比例以及伪阴性比例低，能够以较高精度进行认定。
在比较检测对象与健康个体的分别对应的测定值的情况下，为了 将供测定的两者的细胞量进行比较补正，可以将被认为在细胞内没有 量的差异的公知的蛋白质或核酸作为内部对照使用。作为这样的内部 对照用的蛋白质，能够列举例如甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH： glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)、β-肌动蛋白、白蛋白，另外， 作为内部对照用的核酸能够列举例如5S rRNA、5.8S rRNA、U1snRNA 等。由于通过使用这样的内部对照能够对检测对象和健康个体的定量 结果进行补正，因此能够获得准确的测定值。
1-4.效果
根据本发明的认定TDP-43细胞内存在量关联疾患的认定方法，能 够将目前困难的以ALS为代表的TDP-43细胞内存在量关联疾患在发 病前或者发病早期准确地认定。
另外，通过经时地对于同一患有TDP-43细胞内存在量关联疾患的 患者进行本发明的TDP-43细胞内存在量关联疾患的认定方法，能够对 该患者的该疾患的改善或恶化的变化进行监控。
2.药剂制造方法
2-1.概要
本发明的第2方式是降低细胞内的测定物质的存在量的药剂的制 造方法。通过本制造方法，能够获得可能成为TDP-43细胞内存在量关 联疾患的治疗剂中的有效成分的药剂。
2-2.制造方法
本方式的制造方法包括导入工序、测定工序、选择工序。以下， 对于各工序进行具体说明。
(1)导入工序
本方式中的“导入工序”意为将药剂候补物质导入细胞内工序。
本方式中的“药剂候补物质”意为，在本发明的制造方法中可能 成为降低细胞内的后述的测定物质的存在量的药剂的候补物质。该物 质的种类只要是可能成为具有上述降低效果的药剂的候补的物质，则 不做特别限制。能够列举例如肽、寡核苷酸或者低分子化合物等作为 药剂候补物质。作为肽的具体例，能够列举RNA酶、ATP酶、超氧化 物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、GDH等酶。
本方式中的“测定物质”是上述第1方式中测定物质的一部分， 即，
(i)两种氨基酸，即，谷氨酸(Glu)以及天冬氨酸(Asp)，
(ii)ATP或者活性氧
或者，
(iii)4种mt-tRNA，即，mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro。
本方式中使用的“细胞”是来自动物的细胞，优选来自脊椎动物， 更优选来自哺乳动物，进一步优选来自人的细胞，特别是来自作为治 疗对象的罹患TDP-43细胞内存在量关联疾患的患者的细胞。不论细胞 来自何种器官或者组织。由于本发明的制造方法所制造的药剂可能成 为上述的TDP-43细胞内存在量关联疾患的治疗剂的有效成分，所以本 方式所使用的细胞优选来自作为目标的TDP-43细胞内存在量关联疾 患的发病部位的器官或者组织的细胞(包含iPS细胞)，或者使TDP-43 过量表达的培养细胞。细胞宜是培养细胞。可以是原代培养细胞、继 代培养细胞、或者株化细胞中的任意种类。
导入细胞的药剂候补物质的分量可以按所使用的药剂候补物质的 种类适当决定。需要说明的是，本方式中药剂候补物质的效果只要能 使测定物质在细胞内的存在量降低便足够，没有完全去除的必要。这 是因为，如后所述，由于本方式的任意一种测定物质都是个体生存所 必须的物质，所以从细胞内将其完全去除则有可能对于细胞乃至对于 个体产生严重的副作用。
将药剂候补物质导入细胞内的方法可以使用该领域公知的方法。 在将核酸分子或肽导入细胞内时，能够使用例如电穿孔法、磷酸钙法、 脂质体法、DEAE右旋糖酐法、显微注射、病毒感染法、脂质体转染 法、使用细胞膜透过性肽的方法等周知的方法。另外，也可以使用 Lipofectamin2000(Invitrogen社)等市场销售的核酸导入剂。在将低分 子化合物导入细胞内时，则通常向培养基中添加即可。
(2)测定工序
本方式中的“测定工序”与上述第1方式中的测定工序不同，是 指测定含有以及不含上述药剂候补物质的细胞内的各种测定物质的存 在量的工序。测定方法可以与上述第1方式所述的方法同样地进行。
“含有以及不含药剂候补物质的细胞”希望是除了药剂候补物质 的含有与否这一条件以外，其他条件都相同，即，所来自的个体、所 来自的组织、培养条件(包含培养基的组成(除了有无药剂候补物质)、 培养时间、培养温度等)相同。
(3)选择工序
本方式中的“选择工序”意为，比较含有以及不含药剂候补物质 的细胞的经上述测定工序获得的测定值，即，测定物质的存在量，在 含有上述药剂候补物质的细胞的测定值在统计学上显著低于不含药剂 候补物质的细胞的测定值的情况下，将该药剂候补物质作为目的药剂 选择的工序。测定值的差只要具有差异性即可，不论其大小。这是因 为获得的药剂的药效的差异通过制药时适当增减毎一份制剂所含有的 该药剂的量即可。
2-3.效果
根据本发明的降低细胞内的测定物质的存在量的药剂的制造方 法，能够获得至今为止未知的可能成为TDP-43细胞内存在量关联疾患 的治疗剂中的有效成分的药剂。
3.TAR DNA结合蛋白质-43结合抑制剂的制造方法
3-1.概要
本发明的第3方式是提供TDP-43结合抑制剂的制造方法。本方式 的制造方法的特征在于，通过添加药剂候补物质，制造能够显著降低 测定物质与TDP-43的结合的药剂。
3-2.制造方法
本方式的制造方法包括混合工序、检测工序、选择工序。以下， 对于各工序进行具体说明。
(1)混合工序
本方式中的“混合工序”意为将测定物质和TDP-43与药剂候补物 质共同混合的工序。
本方式中的“测定物质”与上述第1方式中的测定物质不同，是 以下的至少一种物质。
(i)4种mt-tRNA，即mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及 mt-tRNAPro
(ii)4种蛋白质，即Aralar1、Aralar2、GDH、以及Musashi 2 (A)药剂候补物质
本方式的“药剂候补物质”意为能够显著降低上述测定物质与 TDP-43的结合的药剂，即，TDP-43结合抑制剂的候补物质。
作为上述药剂候补物质的例子，能够列举核酸分子、肽或者低分 子化合物。
(A-1)核酸分子
作为药剂候补物质的核酸分子，为突变型mt-tRNA、结合区域核 酸片段、RNAi功能核酸、核酸适体(aptamer)、核酶、反义核酸、U1 适配蛋白(U1adaptor)。
本方式中的“突变型mt-tRNA”意为选自mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、 mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro中的野生型mt-tRNA的突变型，保持了与 TDP-43的结合活性但由于突变丧失了本来的功能的mt-tRNA(loss of function mt-tRNA)。上述突变包含从上述野生型mt-tRNA中缺失、取 代和/或添加一个或者数个核苷酸。
本方式中的“结合区域核酸片段”意为上述测定物质的mt-tRNA 中碱基序列的一部分，且包含与TDP-43直接结合的活性区域的 mt-tRNA的部分片段。也包含上述突变型mt-tRNA的部分片段。作为 与上述TDP-43直接结合的mt-tRNA的部分片段，能够列举例如与 TDP-43的RRM1结合的4种mt-tRNA(mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、 mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro)的共通区域。具体而言，是D茎&环内 的GUU以及T茎&环内的UGG的共有序列。所以，由于含有GTT 或GUU以及/或者TGG或UGG组成的碱基序列的mt-tRNA的部分 片段或者该DNA片段可以在TDP-43与RRM1的结合中与上述4种 mt-tRNA发生竞争，所以可能成为药剂候补物质。这样的mt-tRNA的 部分片段的碱基长度为5～50个碱基、优选为5～30个碱基即可。
本方式中的“RNAi功能核酸”意为能够在生体内诱导RNA干扰 (RNAi：RNA inteference)，通过分解目标基因的转录产物从而抑制基 因的表达(沉默)的物质。能够列举例如siRNA(small interfering RNA)、 shRNA(short hairpin RNA)或者miRNA(micro RNA)。需要说明的 是，关于RNAi，希望参照例如Bass B.L.,2000,Cell,101,235-238；Sharp P.A.,2001,Genes Dev.,15,485-490；Zamore P.D.,2002,Science,296, 1265-1269；Dernburg,A.F.&Karpen G.H.,2002,Cell,111,159-162)。本方 式中，作为编码可能成为RNAi功能核酸的目标转录产物的基因，能 够列举例如mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu、mt-tRNAPro、Aralar1、 Aralar2、GDH以及Musashi 2的各个基因。对于这些目标RNAi功能 核酸的设计使用该领域公知的技术进行即可。列举一个具体例子，若 在设计siRNA的情况下，例如，首先，从Aralar1基因的碱基序列中选 择与该Aralar1基因具有特异性的、碱基个数为15个碱基以上35个碱 基以下、优选15个碱基以上30个个碱基以下、更优选18个碱基以上 25个碱基以下的连续的碱基序列区域作为siRNA的正义链的碱基序 列。接下来，反义链的碱基序列是与所选择的上述RNA正义链的碱基 序列互补的碱基序列。另外，制备siRNA时，将正义链、反义链的选 择区域内的T(胸腺嘧啶)碱基都变换成U(尿嘧啶)碱基。而且，选 择的RNA正义链区域内的GC(鸟嘌呤‐胞嘧啶)的含量优选20～80％， 更优选30～70％，进一步优选40～60％。需要说明的是，优选在选择 的区域的RNA正义链以及RNA反义链的3’末端侧附加TT(胸腺嘧 啶‐胸腺嘧啶)或者UU(尿嘧啶‐尿嘧啶)，其中优选附加TT。
本方式中的“核酸适体”意为具有能够通过自身的立体结构与目 标物质(在此为测定物质或者TDP-43)进行特异性结合的能力的配位 核酸。核酸适体根据其种类已知有DNA适体、RNA适体以及其混合 适体，本方式中可以是任何的适体。关于适体，希望参照例如Janasena, Clin.Chem.,1999,45:1628-1650。
本方式中的“核酶”意为又称为核糖酶的具有催化活性的RNA分 子。与既是底物又是目标物质(测定物质)的本方式的上述(i)所示 4种mt-tRNA分子中任意分子特异性结合，具有催化将该目标RNA分 子切断或者连结、氧化或还原等化学反应的功能。
本方式中的“反义核酸”意为，在测定物质是蛋白质的情况下， 以该蛋白质基因的转录产物为目标的反义核酸。此处所说核酸不仅是 DNA或者RNA，还含有例如PNA或LNA等核酸类似物。
本方式中的“U1适配蛋白”意为由大约25个碱基组成的二功能 性的寡核苷酸，含有与目标基因的mRNA前体中的3’末端外显子互补 的5’侧的“目标结构域”和具有与U1snRNA的5’区域互补的序列的 3’侧的“U1结构域”(Goraczniak R.,et al.,2009,Nat Biotechnol.,Vol 27, p257-263)。将U1适配蛋白导入后，含有U1snRNA的U1核内低分子 核糖核蛋白(U1snRNP)与目标基因的mRNA前体的多聚腺苷酸信号 (poly(A)signal)周边结合，特异性阻碍该mRNA的聚腺苷酸化。其 结果是使目标基因的mRNA前体不稳定化，之后，通过在核内被分解 而产生基因的沉默。所以，将选自Aralar1、Aralar2、GDH以及Musashi 2中的至少一种以上的该蛋白质的基因作为目标设计U1适配蛋白即 可。
(A-2)肽
在作为药剂候补物质的肽中，有突变型蛋白质、结合区域的肽片 段、抗体、肽适体、酶等。肽可以是寡肽或多肽的任意种肽。肽的大 小只要可能作为TDP-43结合抑制剂发挥功能，则不特别限定。通常是 20个氨基酸以下，优选15个氨基酸以下，更优选10个氨基酸以下。 另外，肽可以被修饰。肽的修饰包括功能上的修饰或者标记上的修饰。 功能上的修饰能够列举例如糖基化、乙酰化、甲酰化、酰胺化、磷酸 化、甲基化、环化或者PEG化。标记上的修饰能够列举使用荧光色素 (荧光素、FITC、罗丹明、德克萨斯红、Cy3、Cy5)、荧光蛋白质(例 如PE、APC、GFP)、酶(例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧 化酶)、放射性同位素(例如3H、14C、35S)或者生物素或(链霉菌) 抗生物素蛋白进行的标记。
本方式中的“突变型蛋白质”意为选自Aralar1、Aralar2、GDH、 Musashi 2以及TDP-43的野生型蛋白质的突变型，对于Aralar1、 Aralar2、GDH或者Musashi 2而言，是指保持了与TDP-43的结合活性， 另外，对于TDP-43而言，是指保持了与选自Aralar1、Aralar2、GDH， Musashi 2中的一种蛋白质、或者与选自mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、 mt-tRNAGlu或mt-tRNAPro中的mt-tRNA的结合活性，但由于突变而丧 失本来的功能的蛋白质(失去功能型蛋白质)，或者由于突变而使本来 的功能亢进或者获得新功能的蛋白质(获得功能型蛋白质)。上述突变 包含上述野生型蛋白质中的一个或者数个的氨基酸的缺失、取代和/ 或添加。
本方式中的“结合区域肽片段”意为TDP-43或者本方式的上述(ii) 所示的测定物质的蛋白质中的氨基酸序列的一部分，含有与TDP-43或 者本方式的上述(ii)所示的测定物质的蛋白质直接结合的活性区域的 该蛋白质的部分片段。上述突变型蛋白质的部分片段也被包含其中。 例如，在结合区域肽片段是TDP-43的结合区域肽片段的情况下，为以 下的(a)～(d)所述的肽。
(a)含有由序列号2、4或5所示的氨基酸序列组成的多肽的100 个氨基酸以下、优选80个氨基酸以下的多肽，
(b)含有在序列号2、4或5所示的氨基酸序列中包含1～3个氨 基酸的添加、缺失或取代的多肽的130个氨基酸以下、优选100个氨 基酸以下、更优选80个氨基酸以下的多肽，
(c)由与序列号2、4或5所示的氨基酸序列具有90％以上的同 一性的、优选95％以上的同一性的、更优选97％以上的同一性的氨基 酸序列，
(d)由序列号2、4或5所示的氨基酸序列组成的多肽的一部分。
这里，序列号2是在序列号1所示的人TDP-43中，相当于位于 105位～169位的位置的RRM1结构域。另外，序列号4是在序列号1 所示的人TDP-43中，相当于位于274位～314位的位置的GR结构域。 而序列号5是在序列号1所示的人TDP-43中，相当于位于315位～414 位的位置的315结构域。此外，序列号3是在序列号1所示的人TDP-43 中，相当于位于193位～257位的位置的RRM2(RNA Recognition Motif-2)结构域。
由本发明的发明人的研究结果已明确，TDP-43的RRM1是与上述 测定物质mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro结合的 区域，GR结构域和315结构域是与Aralar1以及Aralar2结合的区域。 所以，含有TDP-43的RRM1结构域的肽的片段或者与该片段的氨基 酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上的同一性的肽 能够在与上述4种mt-tRNA的结合时与TDP-43发生竞争，因此可能 成为药剂候补物质。这样的肽片段具有5～60个氨基酸，优选具有9～ 20个氨基酸即可。
本方式中的“抗体”是作为中和抗体发挥功能的物质，包含例如 单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗体片段。
抗体是多克隆抗体或者单克隆抗体的情况下，免疫球蛋白分子可 以是任意的类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgA、IgD以及IgY)或者 任意的亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。
“重组抗体”意为嵌和抗体、人源化抗体、合成抗体或者多重特 异性抗体。
“嵌和抗体”意为将来自不同动物的抗体的氨基酸序列组合制作 的抗体，将某抗体的恒定区(C区)用其他的抗体的C区取代的抗体。 例如，将小鼠单克隆抗体的C区使用人抗体的C区域取代的抗体。由 此能够减轻人体内对于该抗体的免疫反应。
“人源化抗体”意为将人以外的哺乳动物，例如，小鼠抗体的V 区的互补决定区(CDR)用人抗体的CDR取代的嵌合基因。
“合成抗体”意为使用化学方法或者DNA重组法合成的抗体。能 够列举例如使用DNA重组法新合成的抗体。具体而言，能够列举例如 单链抗体(scFv：single chain Fragment of variable region)，双链抗体 (diabody)，三链抗体(triabody)或者四链抗体(tetrabody)等。
“多重特异性抗体”意为多价抗体，即在一分子内具有多个抗原 结合部位，各个抗原结合部位与不同的表位结合的抗体。能够列举例 如在IgG这样的具有两个抗原结合部位的抗体中，各个抗原结合部位 与不同的表位结合的二重特异性抗体(Bispecific抗体)。
“抗体片段”意为例如Fab、F(ab’)2、Fv等。
上述抗体都可以使用该领域公知的方法制造。
本方式中的“肽适体”意为与上述核酸适体同样具有通过自身的 立体构造与目标物质(在此为测定物质或者TDP-43)特异性结合的能 力的肽。
本方式中的“酶”是RNA酶以及蛋白酶，RNA酶优选能够分别 特异性识别mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro并将 其分解的RNA酶，蛋白酶优选能够分别特异性识别Aralar1、Aralar2、 GDH以及Musashi 2并将其分解的蛋白酶。
(A-3)低分子化合物
本说明书中的“低分子化合物”意为分子量5000以下、优选2000 以下、更优选1000以下的化合物，为上述核酸以及肽以外的物质。能 够列举例如激素(例如类固醇激素)、神经递质(例如肾上腺素 (adrenaline)、肾上腺素(epinephrine)、去甲肾上腺素、多巴胺)、组 蛋白去乙酰化酶抑制剂以及免疫抑制剂等各种医药化合物。另外，也 包含与特定的低分子化合物具有同等药理活性的低分子化合物的衍生 物或其盐。
(B)药剂候补物质的具体例
药剂候补物质中，例如，能够列举竞争物质或者间接的结合抑制 物质。
(B-1)竞争物质
本方式中的“竞争物质”意为，通过与TDP-43结合时和测定物质 形成竞争，或者通过与测定物质结合时和TDP-43形成竞争，从而阻碍 测定物质与TDP-43结合的物质。本方式中，作为该竞争物质，例如包 含在TDP-43将mt-tRNA等测定物质吸收、凝集化，从而使其在细胞 内的本来应发挥功能的场所相隔离的的场所沉积的情况下等时，可以 将该凝集解离的物质。
作为与测定物质形成竞争的竞争物质，能够优选使用突变型 mt-tRNA、结合区域核酸片段、核酸适体、突变型蛋白质、结合区域肽 片段或者低分子化合物作为药剂候补物质。另外，作为与TDP-43形成 竞争的竞争物质，能够优选使用突变型蛋白质、结合区域肽片段、或 者低分子化合物。另外，如上所述，能够优选利用含有与TDP-43的 RRM1结合的4种mt-tRNA的共通区域，具体而言，含有D茎&环内 的GUU以及T茎&环内的UGG的共有序列或者含有其中一部分的核 酸分子、或者含有与4种mt-tRNA结合的TDP-43上的RRM1的肽、 或者含有与Aralar1以及Aralar2结合的GR结构域和315结构域的肽。
(B-2)间接的结合抑制物质
本方式中的“间接的结合抑制物质”意为，通过降低细胞内的测 定物质的绝对存在量或者活化测定物质的存在量，从而二次抑制测定 物质与TDP-43结合的物质。
作为降低细胞内的测定物质的绝对存在量的间接的结合抑制物 质，能够优选使用RNAi功能核酸、核酶、反义核酸、U1适配蛋白、 酶或者低分子化合物。另外，作为降低细胞内的活化测定物质的存在 量的间接的结合抑制物质，能够优选使用突变型mt-tRNA、结合区域 核酸片段、核酸适体、突变型蛋白质、结合区域肽片段、抗体或者肽 适体。
(C)方法
混合工序可以采用使用培养细胞等体内(in vivo)或者体外(in vitro)的任意方式进行。
在体内进行本工序的情况下，本方式中使用的“细胞”是来自动 物、优选来自脊椎动物、更优选来自哺乳动物、进一步优选来自人的 细胞，特别是来自作为治疗对象的患有TDP-43细胞内存在量关联疾患 的患者的细胞。细胞宜是培养细胞。更优选TDP-43过量表达的培养细 胞(包含iPS细胞)。可以是原代培养细胞，继代培养细胞，或者株化 细胞中任意种类。
导入细胞的药剂候补物质的分量以及将药剂候补物质导入细胞内 的方法按照上述第2方式进行即可。
TDP-43或测定物质可以使用内源性的，也可以将外来的TDP-43 或测定物质同时或者分别地导入细胞内作为药剂候补物质。TDP-43以 及测定物质可以将该物质直接导入细胞，也可以向细胞导入编码该物 质的核酸，使其在转化的细胞内表达。导入后的细胞在适当的时间、 适当的温度以及CO2浓度的条件下培养数日。细胞的培养方法可以使 用该领域公知的方法。
需要说明的是，在体内进行本工序的情况下，需要在检测工序前 将导入了药剂候补物质等的细胞溶解，制备含有上述TDP-43与上述 mt-tRNA和/或蛋白质结合而形成的复合物的细胞提取液。细胞提取 液的制备方法是通过使用溶解缓冲剂等公知的细胞提取液的制备方法 即可。
在体外进行本工序情况下，将TDP-43、测定物质、药剂候补物质 分别基于该领域公知的、能够发生蛋白质-蛋白质相互作用或者蛋白质- 核酸相互作用的方法混合即可。参照例如Sambrook,J.et.al.,(2001) Molecular Cloning:A Laboratory Manual Third Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York所述的方法即可。另外， 也可以将TDP-43、测定物质、药剂候补物质的任意物质固定在固体载 体上。由此，使下面的检测工序中的复合物的检测变得容易，因此是 便利的。作为固体载体，能够使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基 甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚丙烯酸甲酯、乳胶、明 胶、琼脂糖(agarose)、纤维素、琼脂糖(sepharose)、玻璃、金属、 陶瓷或者磁性体等的材质构成的珠、微孔板、试管、棒或者试验片等 形状的不溶性载体。固定化是在固体载体上将TDP-43、测定物质、药 剂候补物质中的任意物质通过物理吸附法、化学结合法或者这些方法 的并用等公知的方法直接结合，或者，也有将抗TDP-43抗体等抗体事 先固定在固体载体上，将作为抗原的TDP-43通过抗原抗体反应间接地 与固体载体结合的方法。
(2)检测工序
本方式中的“检测工序”意为检测上述TDP-43与上述mt-tRNA 和/或蛋白质的结合的工序。本工序中，在检测上述结合的情况下， 宜将该结合量定量。
检测工序基本上能够通过使用与上述第1方式所述的测定工序相 同的技术达到。在检测TDP-43与上述mt-tRNA结合的情况下，使用 检测蛋白质-核酸复合物的该领域公知的方法即可。例如，通过使用抗 TDP-43抗体的免疫沉降法，回收含有复合物的TDP-43后，从复合物 中将TDP-43通过苯酚等变性剂或者蛋白酶去除，对残存核酸分子使用 能够特异性检测目标mt-tRNA的核酸探针，通过RNA印迹法检测， 或者通过定量RT-PCR法检测即可。另外，在检测TDP-43与上述蛋白 质的结合的情况下，使用检测目标蛋白质-蛋白质复合物的该领域公知 的方法即可。例如，通过使用抗TDP-43抗体的免疫共沉淀法，回收含 有复合物的TDP-43后，使用对目标蛋白质特异性的抗体，通过蛋白质 印迹法检测即可。列举具体例说明，例如，制备来自细胞的总RNA、 mt-tRNAAsn或者mt-tRNAGln，将其与使用大肠杆菌等合成并提纯的标 签融合TDP-43在体外(in vitro)混合，将与标签(例如，DAP标签、 FLAG标签、组氨酸标签、HA标签、GFP标签，以下相同)对应的抗 体或者结合物质通过固体载体回收后，将与标签融合TDP-43结合的 mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln通过尿素变性丙烯酰胺凝胶分离，使用 SYBR金等染色来检测、定量。在需要用高灵敏度的测定法的情况下， 使用RNA印迹法检测、定量。另外，在使用提纯的mt-tRNAAsn或者 mt-tRNAGln的情况下，将其以荧光试剂或其他显色试剂、酶或者生物 素等标记，能够通过荧光或者显色强度等定量与固定化标签融合 TDP-43结合的这些分子。相反，将提纯的mt-tRNAAsn或者mt-tRNAGln固定化，能够通过测定荧光或者显色强度定量其与融合了荧光试剂或 其他显色试剂或者酶的TDP-43的结合。这种情况下，作为替代 mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln或者TDP-43的全部长度的分子，可以使用各 分子的含有结合序列的RNA片段或者肽片段。作为更具体的检测相互 作用的一例，能够列举通过大肠杆菌合成trigger factor(TG)-GST融合 TDP-43，使用谷胱甘肽固定化载体进行亲和层析法提纯后，将其与从 细胞提取的总RNA混合，通过RNA印迹法检测的方法。
之后，制备表达标签融合TDP-43的细胞株，将表达的标签融合 TDP-43通过固定有与标签相对的抗体(例如抗FLAG抗体等)或者结 合物质(例如，链霉亲和素、亲和素等)的固体载体回收，将与标签 融合TDP-43结合的mt-tRNAAsn和/或mt-tRNAGln提取后，经尿素变 性丙烯酰胺凝胶分离后的SYBR金染色或者通过RNA印迹法检测，从 而能够定量。通过在回收标签融合TDP-43时，使肽、核酸、化合物共 存，能够检测、定量细胞中的与标签融合TDP-43结合的mt-tRNAAsn和/或mt-tRNAGln的量的变化。
或者，将TDP-43预先固定在固体载体上，使测定物质流过，事先 形成TDP-43与测定物质的复合物，再将含有药剂候补物质的溶液流 过，使测定物质与药剂候补物质之间发生竞争，通过表面等离子体共 振或ELISA法算出解离的复合物的量，由此也能够将结合量定量。
(3)选择工序
本方式中的“选择工序”意为，与第2方式中的“选择工序”不 同，是在检测工序中TDP-43与作为测定物质的mt-tRNA和/或蛋白 质的结合没有被检测的情况下，或者被检测的结合量和没有药剂候补 物质存在下的TAR DNA结合蛋白质-43与mt-tRNA和/或蛋白质的结 合量相比较，两者的值之间在统计学上有显著差异的情况下，将该药 剂候补物质选择作为TAR DNA结合蛋白质-43结合抑制剂的工序。
上述检测工序中的“TDP-43与作为测定物质的mt-tRNA和/或蛋 白质的结合没有被检测的情况”意为，药剂候补物质完全地抑制了 TDP-43与作为测定物质的mt-tRNA和/或蛋白质的结合的情况。该情 况下，该药剂候补物质由于可能成为强力的TDP-43结合抑制剂，所以 选择作为目的的TDP-43结合抑制剂。但是，这样的TDP-43结合抑制 剂由于具有同时也抑制个体的生存所必须的TDP-43与测定物质的相 互作用的可能性，所以具有对于细胞，乃至对于个体发生严重副作用 的可能。因此，在使用时，应是一过性效果的药剂，且有必要将剂量 预先优化至仅享受有效药效的分量。但是，特异地完全抑制功能获得 型突变TDP-43与测定物质结合的药剂候补物质是作为TDP-43结合抑 制剂的最优选物质。
另外，上述检测工序中的“被检测的结合量和没有药剂候补物质 存在下的所对应的mt-tRNA和/或蛋白质与TDP-43的结合量相比较， 在两者的值之间在统计学上有显著差异的情况”意为，使用相同的 TDP-43和测定物质，仅在有无添加药剂候补物质这一条件不同的情况 下，将各自的TDP-43与测定物质的结合量相比较时，若在两者的值之 间具有统计上显著差异，这意味着药剂候补物质部分地抑制了TDP-43 与测定物质的结合。这样的部分地进行抑制的药剂候补物质，由于是 作为TDP-43结合抑制剂的优选物质，所以选择作为目的的TDP-43结 合抑制剂。
需要说明的是，在没有药剂候补物质存在下的mt-tRNA和/或蛋 白质与TDP-43的结合是除了药剂候补物质的有无以外，全部以在有药 剂候补物质的存在下的mt-tRNA和/或蛋白质与TDP-43的结合检测 的相同方法以及相同条件下进行。所以，在上述检测工序中，也可以 和在药剂候补物质存在下的mt-tRNA和/或蛋白质与TDP-43的结合 检测同时进行。另外，也可以将在没有药剂候补物质存在下的mt-tRNA 和/或蛋白质与TDP-43的结合量预先定量后形成数据库，在与其相同 方法以及相同条件下，仅定量新添加了药剂候补物质时的结合量。
通过本方式的制造方法获得的TDP-43结合抑制剂能够成为 TDP-43细胞内存在量关联疾患的治疗剂的有效成分。
需要说明的是，对于上述第2方式的降低测定物质的存在量的药 剂或者本方式的TDP-43结合抑制剂所获得的对于TDP-43的过量表达 产生的细胞毒性的抑制效果而言，确认经这些药剂处理的细胞增殖率 的变化即可。和药剂未处理的细胞相比较，细胞增殖率在统计学上有 显著增加的情况下，能够判断该药剂具有对于细胞毒性的抑制效果。 需要说明的是，细胞增殖率能够使用在显微镜下直接计数细胞数而算 出或测定溴尿核苷量等该领域公知的各种方法。另外，也可以测定ATP 量或者活性氧量替代细胞增殖率。该情况下，以由于TDP-43表达水平 的增加而增加的细胞内的ATP量或者活性氧量作为指标，经药剂处理 的细胞内的ATP量或者活性氧量在统计学上有明显地减少的情况时， 能够判断该药剂具有对于细胞毒性的抑制效果。而且，在通过上述药 剂处理能够减少细胞内的mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln量的增加的情况 下，能够判断该药剂具有细胞毒性的抑制效果。
4.TAR DNA结合蛋白质-43结合抑制剂
4-1.概要
本发明的第4的方式是TDP-43结合抑制剂。本发明的TDP-43结 合抑制剂能够成为TDP-43细胞内存在量关联疾患的治疗剂的有效成 分。
4-2.组成
本方式的TDP-43结合抑制剂含有抑制TDP-43与4种mt-tRNA (mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro)结合的核 酸分子的竞争物质。
本说明书中的“核酸分子”原则上是指以核苷酸作为构成单位， 通过磷酸二酯键连结的生物高分子。所以，通常情况下是例如将含有 腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶以及胸腺嘧啶中的任意碱基的脱氧核糖核苷 酸相连结的DNA和/或将含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧啶中 的任意碱基的核糖核苷酸连结的RNA这样的将自然界存在的天然核苷 酸连结而成的天然型核酸。另外，本发明的核酸分子也能够包含非天 然型核苷酸或者非天然型核酸。
本说明书中的“非天然型核苷酸”意为在自然界不存在的核苷酸。 例如，人工构建或者被化学修饰的、具有与上述天然型核苷酸类似的 性质和/或构造的核苷。
本说明书中的“非天然型核酸”意为具有与天然型核酸类似的构 造和/或性质的人工构建的核酸类似物。能够列举例如肽核酸(PNA： Peptide Nucleic Acid)、具有磷酸酯基的肽核酸(PHONA)、交联化核 酸(BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid)、吗啉基核 酸等。能够列举甲基磷酸酯型DNA/RNA、硫代磷酸型DNA/RNA、氨 基磷酸酯型DNA/RNA、2'-O-甲基型DNA/RNA等化学修饰核酸或核 酸类似物。
抑制TDP-43与4种mt-tRNA(mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro)结合的核酸分子含有与TDP-43的结合区域相当的上 述4种的共有序列的一部分。具体而言，是含有TG或UG以及/或者 GT或GU组成的碱基序列，例如，是TGG或UGG以及/或者GTT 或GUU组成的碱基序列。本发明的核酸分子含有两个以上的这样的碱 基序列。优选含有三个以上，更优选含有五个以上，更加优选六个以 上、七个以上、八个以上、九个以上、十个以上。在一个核酸分子内 可以含有相同的上述碱基序列(例如，仅含有TG、仅含有GT)，也可 以含有上述碱基序列的组合(例如，TG和GT)。各自的碱基序列可以 是不连续的，也可以连续的重复序列。在重复序列的情况下，重复次 数是例如3～20次，优选4～18次，更优选5～15次。核酸分子的碱 基长度是5～50个碱基，优选10～40个碱基，更优选15～30个碱基。 作为上述核酸分子的具体例，能够列举相当于T茎&环所含的共有序 列UUG的一部分的UG的12次重复序列的、序列号43所示DNA寡 核苷酸(TG)12，T茎&环所含的共有序列UGG的8次重复序列组成的、 序列号45所示DNA寡核苷酸(TGG)8以及D茎&环所含的共有序列 TTG的7次重复序列组成的、序列号46所示DNA寡核苷酸 TT(GTT)7G。
实施例
<实施例1：与TDP-43结合的RNA的确认>
(目的)
确认与TDP-43结合的RNA。
(方法)
(1)带有DAP标签的TDP-43表达载体的制备
DAP(doubly affinity-purification)标签是将6×His标签、生物素 化标签以及Flag标签从氨基末端侧按照该顺序串联连结的标签。为了 构建带有DAP标签的TDP-43(DAP-TDP-43)的表达载体，首先，以 pEGFP-TDP-43(Arai et al.,Biochem Biophys Res Commun,2006,351: 602-611)作为模板，使用KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO)，通过 PCR制备了Flag标签融合TDP-43的基因片段。引物使用序列号6以 及7所示碱基序列的寡核苷酸。将PCR产物插入pcDNA5/FRT/TO (lifetechnologies)载体内的KpnI/XhoI部位后进行克隆。编码6×His 和生物素化序列的cDNA是基于Hayano等(Interaction Analysis.J. Proteome Res.,2008,7:4183-4190)的方法，以pcDNA3.1(+)-bio作为 模板通过PCR扩增制备。引物使用序列号8以及9所示碱基序列的寡 核苷酸。获得的载体定为DAP-TDP-43pcDNA5/FRT/TO。
(2)强力霉素诱导型细胞系的构建
为了制备通过强力霉素诱导而使DAP-TDP-43表达的细胞系，使 用了Flp-In-T-REx Expression System(lifetechnologies)。将Flp-In-T-REx 293细胞(293TRex细胞)在24孔板上，使用添加了10％的去补体的 牛血清(Biowest LLC)、0.1mg/mL的链霉素(Wako Pure Chemicals) 以及100U/mL的青霉素G(Wako Pure Chemicals)的DMEM培养基 (Sigma-Aldrich)，在37℃、5％CO2下培养。在大约80％的融合时， 向细胞将0.25μg的pOG44(lifetechnologies)和0.25μg的DAP-TDP-43 pcDNA5/FRT/TO通过2μL的Lipofectamine2000进行转染。48小时后， 将细胞在含有200μg/mL的潮霉素B(lifetechnologies)的培养基中， 选择TDP-43的单克隆被插入到共通的基因组部位的株(DAP-TDP-43 表达株)。
为了诱导DAP-TDP-43的表达，加入100ng/mL的强力霉素，培养 24小时。
(3)细胞提取液的制备
细胞提取液的制备遵循Izumikawa等的(Biochem J.,2008,413(3): 505-516)方法。即，将细胞使用PBS漂洗后，使用含有2mM核糖核 苷-氧钒复合物、1mM PMSF、2μg/mL抑肽酶、2μg/mL抑肽素A以及 2μg/mL亮肽素的细胞团5倍量的溶解用缓冲液(50mM Tris/HCl (pH7.4)，150mM NaCl，0.5％(w/v)IgepalCA-630)在冰中悬浮30 分钟。在20000g下，4℃进行30分钟离心，将上清液作为细胞提取液 回收。细胞提取液中的蛋白质浓度通过Protein Assay(Bio-Rad)测定。
(4)免疫沉降和RNA回收
为了使含有Flag标签的DAP-TDP-43免疫沉降，从2×107个细胞 的细胞提取液中制备了6mg的蛋白质组分，加入15μL的ANTI-Flag-M2 亲和凝胶(Sigma-Aldrich)，在4℃恒温保存2小时。将结合了 DAP-TDP-43的上述亲和凝胶使用1mL的上述溶解缓冲液洗涤5次， 使用150μL的蛋白质-RNA提取缓冲液(7M尿素，350mM NaCl，1％ SDS，10mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，2％2-巯基乙醇)，在4 ℃溶出5分钟。通过将与溶出的蛋白质发生免疫共沉淀的RNA在1000g 下，4℃进行5分钟离心而从凝胶中分离，之后，进行苯酚-氯仿提取， 分离蛋白质和RNA。蛋白质通过向苯酚-氯仿提取后的有机层混合3倍 量的异丙醇，在20000g下，4℃进行10分钟离心使之沉淀，立即使用 75％乙醇洗涤一次，并使之干燥。RNA从水层通过异丙醇沉淀回收。
(5)尿素变性PAGE
从细胞提取液回收的RNA的分离基本上遵循Sambrook,J.等 (Molecular Cloning：A Laboratory Manual Third Ed.,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)的方法进行。将 通过抗Flag抗体固定化珠经拉下法获得的RNA溶解于甲酰胺，在65 ℃进行10分钟热处理使之变性后，在冰上急冷。电泳前调整RNA使 最终浓度为80％的甲酰胺、10mM的EDTA(pH8.0)、1/16量的10× Loading buffer(TaKaRa)后，使用含有8M尿素和0.5×TBE缓冲液的 8％聚丙烯酰胺凝胶将RNA分离。电泳结束后，将凝胶使用SYBR金 (lifetechnologies)染色5分钟，切取与TDP-43特异性结合的条带。
(6)胶内消化
RNA的胶内消化基本上遵循Taoka等(Anal.Chem.,2010,82(18)： 7795-7803)的方法进行。将切取的凝胶片段切断成小片，在真空下干 燥。之后，使用15μL的2μg/μL的RNase T1或者RNaseA，在37℃处 理1小时。将核酸片段溶解于100μL的不含RN酶的水后，经具有聚 偏氟乙烯滤膜的离心过滤管(Ultrafree-MC，Millipore)过滤，从凝胶 中提取后，加入5μL的2M乙酸三乙基铵(pH7.0)。
(7)纳米LC-MS/MS分析
LC-MS/MS分析基本上使用了Natsume等(2002,Anal.Chem.,74, 4725-4733)所公开的含有纳米流泵的LC系统(LC Assist，Japan)。色 谱柱使用熔融石英毛细管柱(150μm i.d.×375μm o.d.)，通过激光牵 引机(Sutter Instruments Co.,CA)制备，将反相浆料(Develosil C30-UG-3，粒径3μm，Nomura Chemical，Japan)充填50mm长。
(A)液相色谱法(LC)条件
·使用机器：RENCON-P(LC Assist)
·洗脱液A：10mM三乙基胺乙酸盐(Glen Research)
·洗脱液B：甲醇(和光纯药)
·色谱柱：Develosil C30-UG-3，150μm×50mmL，粒径3μm(野 村化学)
·捕集柱Monocap for Trap，200μm×45μm(GL Sciences)
·色谱柱温度：25℃
·流速：100nL/min
·时序浓度梯度(Time schedule gradient)0分钟：10％B～40分钟： 40％B
(B)MS条件
·使用机器：LTQ Orbitap XL(Thermo Scientific)
·Mass range：500-1950Da
·扫描模式：FT normal
·离子化方法：ESI-negative
·扫描速度：normal
·解析软件：Excalibur Qual Browser
(C)MSMS条件
·使用机器：同上
·Mass range：normal
·扫描模式：normal
·扫描速度：Enhanced
·解析软件：Excalibur Qual Browser
将从胶内消化得到的RNA获得的谱图作为查询内容，在包含线粒 体基因组的人基因组数据库内，使用搜索引擎Ariadne进行解析(Taoka, et al.,2010,Anal.Chem.82(18):7795-7803；Nakayama,et al.,2009, Nucleic Acids Res.37:e47)。
(结果)
如图1以及2所示。图1是PAGE的结果。黑框内的大约70个核 苷酸的3个带(箭头所示的带1～3)是对于DAP-TDP-43有特异性的 RNA。图2是带1的纳米LC-MS/MS色谱图。在collision-induced dissociation-MS/MS analysis中显示了从胶内酶解的RNA片段生成的一 连串的产物离子。产物离子含有大量的c/y和a/w的离子和微量的派生 物(hydrated or dehydrated ions以及这些核苷酸失去碱基的离子)。
根据Ariadne解析的结果，将各个带鉴别为以下的结果。
带1：与mt-tRNAAsn基因、mt-tRNAGln基因以及mt-tRNAAsn基因 完全相同的染色体1上的序列。
带2：mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro基因。
带3：mt-tRNAPro基因。
所以，可以确认对于TDP-43，有4种mt-tRNA(mt-tRNAAsn、 mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro)结合。
<实施例2：通过RNA印迹法确认与TDP-43结合的mt-tRNA>
(目的)
将实施例1的结果通过RNA印迹法进行确认。
(方法)
将在实施例1的“(4)免疫沉降和回收”中获得的RNA通过含有 8M尿素和0.5×TBE缓冲液的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，使用 Trans-blot SD Cell(Bio-Rad)，在5V、60分钟的条件下转录至尼龙膜 (Hybond-N+：Bio-Rad)。将RNA与膜通过UV交联后，使用生物素 化探针在预杂交液(0.6M NaCl，120mM Tris-HCl(pH8.0)，4.8mM EDTA，0.1％SDS，1×Denhardt’s Solution)中在42℃下杂交一晩。将 膜使用洗涤溶液(90mM Tris-HCl(pH8.0)，0.45M NaCl，3.6mM EDTA，0.1％SDS)在25℃进行三次30分钟的洗涤，使用 Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module kit(Thermo Fisher Scientific)并遵循附带的说明书检测RNA。用于检测的各个寡核苷酸 探针具有对各mt-tRNA等的特异性的碱基序列互补的以下序列。即、 mt-tRNAAsn探针具有与mt-tRNAAsn基因的碱基序列的7～34位互补的 序列(序列号10)、mt-tRNAGln探针具有与mt-tRNAGln基因的碱基序列 36～65位的序列(序列号11)、mt-tRNAPro探针具有mt-tRNAPro基因 的碱基序列28～57位的序列(序列号12)、mt-tRNAGlu探针具有 mt-tRNAGlu基因的碱基序列33～62位的序列(序列号13)，以下，作 为对照的mt-tRNALeu(UUR)探针具有mt-tRNALeu(UUR)基因的碱基序列 1～30位的序列(序列号14)、tRNAMet探针具有与tRNAMet基因的碱 基序列46～72位的序列(序列号15)。各探针在其3’末端使用Biotin 3’End DNA Labeling kit(Thermo Fisher Scientific)进行了标记。各 RNA带的信号强度使用LAS4000图像分析仪和MultiGauge software (Fujifilm)进行定量。各值是至少三次的独立的实验的平均值(±1SD)。 (结果)
结果示于图3。mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln能够从实施例1的“(4) 免疫沉降和回收”获得的与DAP-TDP-43发生免疫共沉淀的RNA中， 以单一带检测出(A，B)。与此相对，作为对照的其他的mt-tRNA， 即mt-tRNALeu(UUR)或细胞质-tRNA的tRNAMet不能被检测出(A)。另 外，对于mt-tRNAPro以及mt-tRNAGlu，也能够从与DAP-TDP-43发生 免疫共沉淀的RNA中检测出(B)。由以上结果能够证明mt-tRNAAsn、 mt-tRNAGln、mt-tRNAPro以及mt-tRNAGlu与TDP-43结合。
<实施例3：TDP-43与mt-tRNA的结合的生理学功能>
(目的)
明确TDP-43与mt-tRNA的结合的生理学功能。
(a)通过TDP-43siRNA抑制TDP-43的细胞存在量
(方法)
验证了对于TDP-43使用small interference RNA(TDP-43siRNA) 来抑制TDP-43的表达时的上述mt-tRNA的存在量。
作为TDP-43siRNA，构建了由序列号16和序列号17所示寡核苷 酸组成的siRNA。另外，作为TDP-43siRNA的阴性对照，构建了由序 列号18和序列号19所示寡核苷酸组成的siRNA(以下，在本实施例 中简称为“Cont”)(stealth RNA：lifetechnologies)。接下来将HeLa细 胞在35mm培养皿中培养，在大约70％的融合时，将以TDP-43为目标 的50pmol的siRNA使用2.5μL的Lipofectamine 2000，遵循附带的说 明书对细胞进行转染。
转染后回收0、24、48、72以及96小时后的培养液的一部分，进 行细胞增殖测定。细胞增殖测定使用Burker-Turk chamber (Hirschmann；Laborgerate Hilgenberg)，通过视觉上对细胞数进行计 数而算出。
另外，在上述24、48、72以及96小时后，通过与上述实施例1 的“(3)细胞提取液的制备”所述的方法同样的方法制备了细胞提取 液。为了确认由siRNA对目标基因的表达抑制，通过蛋白质印迹法检 测了在上述细胞提取液中的TDP-43的蛋白质量。作为内部对照使用了 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase：以 下简称“GAPDH”)。为了确认TDP-43的表达抑制，使用了抗-TDP-43 抗体，另外，检测GAPDH使用了抗-GAPDH抗体(ambion)。
而且，作为获得TDP-43表达抑制时的细胞中的总RNA的方法， 将经PBS洗涤的细胞使用RNAgent Denaturing Solution(Promega)溶 解，通过酸性苯酚氯仿提取法将含有RNA的水层分离，通过异丙醇沉 淀回收RNA，然后使用75％乙醇进行了洗涤。将此作为细胞的总RNA， 通过与上述实施例1的“(5)尿素变性PAGE”所述方法同样的方法进 行免疫共沉淀-RNA印迹法解析。
用于检测的各寡核苷酸探针，除了上述实施例2所述的探针外， 还使用了U1snRNA探针(U1snRNA基因的碱基序列1～24位的序列 (序列号20))以及5.8S rRNA探针(5.8S rRNA基因的碱基序列123～ 146位的序列(序列号21))。
(结果)
结果示于图4以及图5。图4A是TDP-43-siRNA或者Cont转染的 HeLa细胞中的TDP-43的蛋白质量的检测结果。将TDP-43-siRNA转 染的情况下，与Cont比较，在转染24小时后之后，TDP-43蛋白质 的表达水平减少了90％左右。从该结果能够确认TDP-43-siRNA对于 TDP-43的表达抑制的效果。另外，图4B是将TDP-43-siRNA或者Cont 转染的HeLa细胞的细胞增殖率。该图中所示数字为以转染时的细胞数 量作为1时的相对值。根据该图，经TDP-43-siRNA处理的HeLa细胞 中，与Cont相比增殖明显被抑制。从该结果能够证明，TDP-43-siRNA 表达的抑制能够抑制细胞增殖。
图5是显示经TDP-43-siRNA处理后的各种RNA在HeLa细胞内 的存在量的变动的图。图中，5.8S、U1、Asn、Gln、Leu分别表示5.8S rRNA、U1snRNA、mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNALeu(UUR)。将 TDP-43-siRNA转染的HeLa细胞与将Cont转染的HeLa细胞相比较， mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln的存在量明显(分别为p<0.01，p<0.05)地减 少。另一方面，对于5.8S RNA、U1snRNA以及mt-tRNALeu没能检测 出同样的减少效果。
(b)强力霉素诱导的DAP-TDP-43的过量表达
(方法)
向实施例1的“(2)强力霉素诱导型细胞系的构建”中制备的 DAP-TDP-43表达株中添加100ng/mL的强力霉素，使DAP-TDP-43在 细胞内过量表达。回收添加强力霉素后0、8、24、48小时后的培养液 的一部分，通过与上述实施例1的“(3)细胞提取液的制备”所述的 方法同样的方法制备了细胞提取液后，进行蛋白质印迹法解析。另外， 通过与上述实施例1的“(4)免疫沉降和RNA回收”以及“(5)尿素 变性PAGE”所述方法同样的方法提取总RNA，进行RNA印迹法解析。 用于检测的寡核苷酸探针利用了上述探针。作为内部对照，在蛋白质 印迹法解析中使用GADPH，另外，在RNA印迹法解析中使用5.8S rRNA。
(结果)
结果示于图6。A所示是对于将DAP-TDP-43过量表达时的 DAP-TDP-43和内源性TDP-43进行蛋白质印迹法解析的结果。另外， B所示是对于已经明确与TDP-43结合的mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln的mRNA进行RNA印迹法解析的结果。
将DAP-TDP-43过量表达的情况下，与该表达水平成比例， mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln在细胞内的存在量增加。
从上述(a)以及(b)的结果能够证明TDP-43至少与mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln的生物合成或者代谢有关。
<实施例4：TDP-43对mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln的细胞内存在量的 控制>
(目的)
确认mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln的细胞内存在量受TDP-43控制。
(方法)
(A)使用DAP-TDP-43表达株测定DAP-TDP-43过量表达时的 mt-tRNAAsn或者mt-tRNAGln的经时分解。将强力霉素添加至 DAP-TDP-43表达株的培养液后培养24小时，在DAP-TDP-43过量表 达后，添加溴化乙啶(EtBr)抑制mt-tRNA的合成，以EtBr添加时为 0时，在6、12、24小时后回收培养液的一部分，通过与上述实施例3 所述方法同样的方法制备细胞总RNA后，通过与上述实施例2所述的 RNA印迹法同样的方法检测mt-tRNA。作为内部对照，使用经SYBR 金染色的5S rRNA。
(B)观察了伴随TDP-43的表达量的增加，mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln的结合量的变化。研究了DAP-TDP-43过量表达后，EtBr未添加时的 DAP-TDP-43与mt-tRNAAsn或者mt-tRNAGln的经时的结合量。将强力 霉素添加至DAP-TDP-43表达株的培养液，在4、8、24小时后回收培 养液的一部分，通过与上述实施例1的“(4)免疫沉降和RNA回收” 以及“(5)尿素变性PAGE”所述方法同样的方法，通过免疫共沉淀-RNA 印迹法解析进行确认。
(结果)
结果示于图7。A是mt-tRNAAsn或者mt-tRNAGln的经时分解的结 果，另外，B是与DAP-TDP-43的免疫共沉淀的结果。
(A)可以明确，通过强力霉素诱导TDP-43的株(+dox)与未诱 导的株(-dox)比较，mt-tRNAGln的分解速度缓慢减少，另外mt-tRNAAsn的分解速度被显著地延缓了。该结果显示，TDP-43与mt-tRNAAsn以及 mt-tRNAGln的细胞内稳定性有关。
(B)判明了与过量表达的TDP-43结合的mt-tRNAAsn以及 mt-tRNAGln增加，与之相关地，这些mt-tRNA在细胞内的存在量也增 加。有报告称在ALS中的突变型TDP-43与野生型TDP-43相比较，其 在细胞内的稳定性增加(Ling,et al.,2010,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2107:13318-13323)。因此，TDP-43在细胞内的存在量的增加暗示着 mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln在细胞内的存在量的增加。
从上述(A)、(B)的结果能够证明，TDP-43作为支架蛋白质，通 过与mt-tRNAAsn或者mt-tRNAGln结合而控制其在细胞内的稳定化。
<实施例5：TDP-43中的mt-tRNA结合部位的鉴定>
(目的)
鉴定mt-tRNA与TDP-43的哪个结构域结合。
(方法)
(1)带有DAP标签的结构域缺失型TDP-43表达载体的制备
制备了缺失了RRM1结构域、RRM2结构域、GR结构域或者315 结构域的结构域缺失型TDP-43(分别称为dRRM1、dRRM2、dGR以 及d315。参照图8A)的表达载体。
各结构域缺失突变的TDP-43片段从实施例1构建的DAP-TDP-43 pcDNA5/FRT/TO，使用KOD plus DNA聚合酶，通过PCR扩增而制备。 关于所使用的引物对，用于dRRM1的是具有序列号22和23所示碱基 序列的DNA，用于dRRM2的是具有序列号24和25所示碱基序列的 DNA，用于dGR的是具有序列号26和27所示碱基序列的DNA，用 于d315的是具有序列号28和29所示碱基序列的DNA。dRRM1、 dRRM2以及dGR是将扩增的DNA片段使用ClaI切断后自身连接，经 碱基测序确认发生突变后，使用HindIII/XhoI切断，插入 pcDNA5/FRT/TO的HindIII/XhoI部位。d315是将扩增的DNA片段使 用BamHI/XhoI切断，插入从DAP-TDP-43pcDNA5/FRT/TO在 BamHI/XhoI部位去除了TDP-43部位而制成的载体部位。由此获得 DAP-dRRM1、DAP-dRRM2、DAP-dGR以及DAP-d315的各表达载体。 (2)为了检测与TDP-43结合的mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln，遵循实施 例1所述的“(2)强力霉素诱导型细胞系的构建”构建细胞系后，使 用强力霉素诱导表达后，回收24小时后的细胞，依照“(3)细胞提取 液的制备”、“(4)免疫沉降和RNA回收”以及“(5)尿素变性PAGE” 所述方法检测的mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln。
(结果)
结果示于图8。A所示是野生型TDP-43(WT)以及各结构域缺失 型TDP-43的构造的示意图。B所示是野生型TDP-43以及各结构域缺 失型TDP-43表达株中的通过强力霉素诱导而表达的细胞内的各蛋白 质的蛋白质印迹法的结果。另外，C所示是与野生型TDP-43以及各结 构域缺失型TDP-43结合的mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln的RNA印迹法 的结果。
由C可知，在dRRM2、dGR以及d315中，mt-tRNAAsn以及 mt-tRNAGln的结合能够被维持，但dRRM1中，没有能够确认mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln的结合。该结果能够证明，这些mt-tRNA是与TDP-43 的RRM1结构域结合。
<实施例6：细胞毒性>
(目的)
验证通过结构域缺失型TDP-43诱导的细胞毒性。
(方法)
使用野生型以及上述实施例5制备的结构域缺失型TDP-43的过量 表达系，研究对于人细胞的细胞毒性能。向DAP-TDP43(WT)、 DAP-dRRM1、DAP-dRRM2、DAP-dGR以及DAP-d315的各细胞培养 液中添加强力霉素，对48小时后的细胞数使用Burker-Turk chamber (Hirschmann；Laborgerate Hilgenberg)通过视觉上对细胞数进行计数 而算出。
(结果)
结果示于图9。该图中，除了未添加强力霉素以外，将细胞增殖率 以同样条件下培养的细胞数为1时的相对值表示。图中，*表示P<0.05， 另外，**表示P<0.01。
DAP-dGR以及DAP-d315通过过量表达(+dox)，观察到与野生型 的DAP-TDP43同程度的细胞毒性。另外，DAP-dRRM2能够观察到大 于野生型的DAP-TDP43的细胞毒性。另一方面，在缺失了mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln的结合结构域的RRM1的DAP-dRRM1的情况，过量 表达后也几乎不显示细胞毒性。该结果暗示，mt-tRNAAsn以及 mt-tRNAGln与RRM1的结合与TDP-43的细胞毒性有关。也就是说，通 过抑制TDP-43与mt-tRNA的结合，能够抑制细胞毒性。
<实施例7：突变型TDP-43的细胞毒性与mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln的 结合的相关性>
(目的)
验证ALS中的TDP-43与mt-tRNA的相关性。
(方法)
制作了将ALS中确认的突变导入的突变型TDP-43(D169G、 G298S、R361S；参照图10A)的诱导表达型细胞系(DAP-D169G、 DAP-G298S、DAP-R361S)。D169G、G298S以及R361S的构建基本上 依照实施例5所述的方法。所使用的引物对，用于D169G的是具有序 列号30和31所示碱基序列的DNA，用于G298S的是具有序列号32 和33所示碱基序列的DNA，用于R361S的是具有序列号34和35所 示碱基序列的DNA。需要说明的是，将为了去除模板DNA而扩增得 到的DNA片段使用DpnI切断后，转染大肠杆菌，由此获得含有目的 序列的载体。通过碱基测序确认突变后，使用HindIII/XhoI切断，插入 pcDNA5/FRT/TO的HindIII/XhoI部位。测定经强力霉素诱导48小时后 的突变株的生存率。
另外，对于这些突变型TDP-43表达株的突变型TDP-43与 mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln的结合能进行了确认。检测方法依照实施例2 所述方法。
(结果)
结果示于图10以及图11。
图10A显示是用于实验的野生型TDP-43以及各突变型TDP-43的 示意图。图10B显示是野生型以及各突变型TDP-43表达株的生存率 的图。+dox以及-dox分别表示向培养基添加了强力霉素的细胞以及未 添加强力霉素的细胞。从图10B可以明确，表达具有ALS样突变的突 变型TDP-43的细胞和表达野生型TDP-43的细胞相比较，任何细胞的 生存率都较低，具有强的细胞毒性。
图11显示是过量表达野生型以及各突变型TDP-43时的细胞内的 各mt-tRNA的存在量的图。该图中，以将未添加强力霉素的情况设定 为1时的添加时的检测带的相对强度表示。从该图可知，突变型TDP-43 与野生型TDP-43同样，通过过量表达使得mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln 在细胞内的存在量增加。从在ALS中观察到的突变型TDP-43是通过 稳定化使得细胞内的表达水平增加的报告可知，以上的结果显示由于 ALS样突变型TDP-43在细胞内的存在量增加，因而使mt-tRNAAsn以 及mt-tRNAGln也稳定化，使它们在细胞内的存在量增加。作为其结果， 也诱导发生如后述实施例10、11所示的效果，从而导致该细胞的细胞 毒性增加，诱发细胞死亡。
<实施例8：新型TDP-43结合蛋白质>
(目的)
作为TDP-43结合蛋白质，现行报告有FUS/TLS以及ataxin2 (Kwiatkowski,et al.,2009,Science,323:1205-1208；Vance,et al.,2009, Science 323,1208-1211；Elden,et al.,2010,Nature.466:1069-1075)。在 此，对于与TDP-43结合的其他的蛋白质进行解析。
(1)TDP-43结合蛋白质的分离以及鉴定
(方法)
使用具有二种不同的标签的DAP-TDP-43，通过使用该不同的标签 进行两次拉下法的二阶段提纯法，回收上述与DAP-TDP-43结合的蛋 白质，通过SDS-PAGE分离后，经蛋白酶进行胶内消化。这些方法依 照Fujiyama-Nakamura等(Mol Cell Proteomics,2009,8,1552-1565)、 Hayano等(J.Proteome Res.7:4183-4190)所述的方法进行。之后，进 行LC-MS/MS分析和Mascot search engine进行鸟枪法解析。需要说明 的是，LC-MS/MS在以下的条件进行。
(A)液相色谱法(LC)条件
·使用机器：RENCON(LC Assist)
·洗脱液A：0.1％甲酸的水溶液(MilliQ水)
·洗脱液B：0.1％甲酸的乙腈溶液(和光纯药)
·色谱柱：：45mm×0.150mm i.d.粒径3μm(Kanto Chemical)
·色谱柱温度：25℃
·流速：100nL/min
·时序浓度梯度(Time schedule gradient)0％B0分钟：0％～60分 钟：35％B
·捕集柱Monocap for Trap 200μm×45μm(GL SCIENCES)
(B)MS条件
·使用机器：LTQ-Orbitrap XL(Thermo Fisher Scientific)
·Mass range：450-1500Da
·扫描模式：FT normal
·离子化方法：ESI-Positive
·扫描速度：normal
·解析软件：Excalibur Qual Browser
(C)MSMS条件
·使用机器：同上
·Mass range：normal
·扫描模式：Ion-trap normal
·扫描速度：normal
·解析软件：Excalibur Qual Broswer
(结果)
作为TDP-43结合蛋白质的候补，分离了与已有报告的(Ling et al., 2010,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2107:13318-13323)hnRNP、白细胞 介素、增强子结合因子、胰岛素样成长因子2mRNA结合蛋白质、 Matrin-3以及DHX9一起，还有，作为新型TDP-43结合蛋白质的aralar 1(SLC25A12)、aralar 2(SLC25A13；citrin)、Musashi 2以及GDH(未 显示数据)。aralar 1以及aralar 2是线粒体的天冬氨酸-谷氨酸输送体蛋 白质，经由线粒体内膜参与天冬氨酸和谷氨酸的交换(Gellerich FN,et al.,2009,PLoS One.9；4(12):e8181)。Musashi 2具有RNA结合结构 域，被认为是与骨髓性白血病细胞的增殖(Jaenisch&Daley,Nat Med. 201016(8):903-908.)、神经系统的干细胞的维持和增殖所必要的蛋白 质(Seigel GM,et al.,Mol Vis.2007Jun 8；13:823-832.)。GDH是将谷氨 酸转化成三羧酸循环的中间产物α酮戊二酸(氧代戊二酸)的酶，已 知是与能量代谢和氨的解毒有关(http://www.uniprot.org/uniprot/ P00367)。
(2)通过TDP-43的过量表达的新型TDP-43结合蛋白质的结合效果 (方法)
向DAP-TDP-43细胞株的培养基添加强力霉素诱导DAP-TDP-43 表达后，在4、8以及24小时回收细胞，使用DAP-TDP-43进行免疫 沉降。所使用方法依照上述实施例1以及2。aralar 1、aralar 2、Musashi 2以及GDH的检测分别使用了抗aralar 1抗体(Santacruz)、抗aralar 2 抗体(abcam)、抗Musashi 2抗体(abcam)以及抗GDH抗体(abcam)。 另外，作为内部对照使用β-肌动蛋白。对于β-肌动蛋白，使用抗β-肌 动蛋白抗体(Santacruz)。
(结果)
结果示于图12。DAP-TDP-43在细胞内的存在量伴随诱导表达后 的时间增加而增加。与此相伴的，与DAP-TDP-43发生免疫共沉淀的 aralar 1、aralar 2、Musashi 2以及GDH的量也增加。所以能够显示 TDP-43不仅与mt-tRNAAsn等mt-tRNA发生结合，还与aralar 1、aralar 2、Musashi 2以及GDH的蛋白质发生结合。
(3)aralar 1、2以及mt-tRNA的结合性
(方法)
为了确认aralar 1以及aralar 2的结合，互换免疫沉降蛋白质后再 次进行了免疫共沉淀。另外，为了确认aralar 1或者aralar 2与mt-tRNA 之间发生结合，在通过上述抗体进行拉下后，使用mt-tRNAAsn探针进 行了检测。免疫共沉淀的方法基本上遵循Sambrook,J.等(Molecular Cloning:A Laboratory Manual Third Ed.,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)的方法，以及上述实施 例1以及2所述的方法。
(结果)
结果示于图13。图13A所示是aralar 1以及aralar 2的互换免疫沉 降的结果。另外，图13B所示是与aralar 1或者aralar 2发生免疫共沉 淀的mt-tRNAAsn的结果。从图13B中能够证明，aralar 1和aralar 2不 仅与TDP-43结合，在体内还可以相互结合。另一方面，因为mt-tRNAAsn与aralar 1和aralar 2都不发生免疫共沉淀，所以能够证明它虽然与 TDP-43结合，但与aralar 1和aralar 2不结合。这些结果显示，含有 mt-tRNA的TDP-43复合物与含有aralar 1以及aralar 2的TDP-43复合 物是不同的复合物。
(4)Musashi2以及mt-tRNA的结合性
(方法)
为了确认Musashi2与mt-tRNA间的结合，构建了DAP-Musashi2 (图14中以DAP-Msi2表述)诱导表达细胞系。基本上依照实施例5 所述的方法进行。使用DAP-Musashi2拉下后，对于与DAP-Musashi2 结合的mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln，使用各探针进行检测。免疫共沉 淀基本上遵循Sambrook,J.等(Molecular Cloning:A Laboratory Manual Third Ed.,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York)的方法，以及上述实施例1以及2所述的方法。
(结果)
结果示于图14。使用DAP-Musashi-2(DAP-Msi2)拉下，能够确 认mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln发生了免疫共沉淀。
<实施例9：TDP-43结合蛋白质的TDP-43结合部位的鉴定>
(目的)
验证在实施例8中鉴定的与TDP-43结合的蛋白质aralar 1以及 aralar 2与TDP-43的何种结构域相结合。
(方法)
使用在实施例5中制作的DAP-dRRM1、DAP-dRRM2、DAP-dGR 以及DAP-d315的各表达株，免疫共沉淀的方法基本上遵循Sambrook, J.等(Molecular Cloning:A Laboratory Manual Third Ed.,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)的方法， 以及上述实施例1以及2所述的方法。野生型以及各结构域缺失型 TDP-43的蛋白质使用量通过使用Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module kit(Thermo Fisher Scientific)检测生物素进行了确 认。
(结果)
结果示于图15。如该图所示，aralar 1以及aralar 2在RRM 1以及 RRM 2结构域缺失体中均被检测，但在GR结构域缺失体以及315结 构域缺失体中，检测量低或者未被检测。该结果能够证明，aralar 1以 及aralar 2与TDP-43的C末端侧的GR以及315结构域结合。
<实施例10：TDP-43与ATP的关系>
(目的)
验证TDP-43与ATP的关联性。
(方法)
对于使用在实施例3中制备的TDP-43siRNA抑制了TDP-43表达 的情况，以及使用DAP-TDP-43细胞，使DAP-TDP-43过量表达的情 况，分别进行ATP测定，测定细胞内的ATP量。ATP量的测定是使用 Celltiter-glo(Promega)，依照附带的说明书进行了测定。作为细胞量 的对照，依照上述实施例6所述的方法对细胞数进行了计数。
DAP-TDP-43的过量表达细胞中的ATP量的测定是在通过添加强力霉 素诱导表达(0时)后，对于8、24、48小时的细胞进行的。
(结果)
结果示于图16。在抑制了TDP-43的情况下，TDP-43细胞中的ATP 存在量与Cont细胞相比较，减少至82％(图16A)。在将DAP-TDP-43 过量表达的情况下，单位细胞量中的ATP存在量在强力霉素诱导后， 48小时增加至1.8倍(图16B)。这些结果显示，TDP-43与氧化磷酸 化反应的控制有关。
<实施例11：结构域缺失型TDP-43中的mt-tRNA以及ATP的细胞存 在量>
(目的)
验证结构域缺失型TDP-43中的mt-tRNA(mt-tRNAAsn以及 mt-tRNAGln)或者ATP的细胞存在量。
(方法)
各结构域缺失型TDP-43表达株使用在实施例5中制备的 DAP-dRRM1、DAP-dRRM2、DAP-dGR以及DAP-d315的各诱导表达 细胞株。诱导表达是通过向培养基添加强力霉素(+dox)进行，从添 加后48小时的细胞中提取总RNA，使用各自的RNA的上述探针，检 测、定量细胞内存在量。作为诱导表达的对照是在未添加强力霉素 (-dox)的培养基中，其他条件相同的情况下培养的同系的细胞株。另 外，通过与上述实施例10同样的方法，将各结构域缺失型TDP-43诱 导后，测定了细胞内的ATP量。
(结果)
结果示于图17-1以及图17-2。图17-1是将各结构域缺失型TDP-43 中的mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln以及mt-tRNALeu(UUR)的细胞内存在量以 检测出的带的相对强度(规定未添加强力霉素(-dox)为1时的诱导表 达(+dox)的相对值)表示的图。从图17-1中可知，DAP-dRRM 2的 过量表达使mt-tRNAAsn以及mt-tRNAGln的量显著增加。
图17-2是各结构域缺失型TDP-43中的ATP的测定结果。与图17-1 的结果同样，DAP-dRRM 2的过量表达使细胞内的ATP量显著增加。 另一方面，在dRRM1的过量表达的情况下，细胞内的ATP量未见增 加。
以上的结果显示，结构域缺失型TDP-43与mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln以及ATP在细胞内的存在量的增加能力成比例，增加细胞毒性。
<实施例12：突变型TDP-43与ATP在细胞内的存在量的相关性>
(目的)
验证ALS中TDP-43与ATP细胞内存在量的相关性。
(方法)
使用上述实施例7中制作的导入了在ALS中确认的突变的突变型 TDP-43(D169G，G298S，R361S；参照图10A)的诱导表达型细胞系 (DAP-D169G，DAP-G298S，DAP-R361S)，通过强力霉素诱导后， 测定了经过48小时的ATP细胞内存在量。测定方法依照实施例2所述 的方法。
(结果)
结果示于图18。任意种结构域缺失型TDP-43都由于过量表达而 使细胞内的ATP存在量增大。这表示，在ALS中的突变型TDP-43与 mt-tRNAAsn和mt-tRNAGln(实施例7)同时具有使ATP细胞内存在量 增加的能力，该增加能力与细胞毒性一致。
ALS中的TDP-43突变导致的病情的发病机理尚未被充分地解明。 然而，从上述实施例1～12的结果，能够导出以下的一种假说。
即，由于突变使细胞内的TDP-43稳定化，亦或与mt-tRNAAsn、 mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu和/或mt-tRNAPro、Aralar 1或Aralar 2、GDH、 或者Musashi 2的结合能发生变化，从而成为ALS发病的诱因。由于 突变使TDP-43稳定化，使突变型TDP-43与上述mt-tRNA结合的 TDP-43-mt-tRNA复合物、和/或与上述蛋白质结合的TDP-43-蛋白质 复合物增加。由于突变型TDP-43形成与上述mt-tRNA结合的 TDP-43-mt-tRNA复合物，mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln的存在量增加，促 进线粒体中蛋白质的合成，作为其结果，线粒体被激活。与此同时， 由于形成与上述蛋白质结合的TDP-43-蛋白质复合物，促进Glu向α- 酮戊二酸转化，引发三羧酸循环的亢进。由于这些效果，会使线粒体 的氧化磷酸化异常亢进，引起ATP的合成量增加。可以推测该异常的 氧化磷酸化的亢进引起活性氧的增加和伴随Glu代谢的氨的增加，从 而引发的尿素代谢异常，进而使细胞受损，导致细胞凋亡。另一方面， 细胞启动反馈该现象的防御系统。细胞将由于TDP-43的突变而增加的 TDP-43-mt-tRNA复合物和/或TDP-43-蛋白质复合物作为凝集物，被 捕获在细胞质的特定位置，并从TDP-43本应发挥原本的功能的细胞内 的场所将TDP-43隔离，此时，能够预测TDP-43-mt-tRNA复合物中所 含的mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln和TDP-43-蛋白质复合物也同时作为凝集 物被沉积。由于TDP-43的突变而与Aralar 1或Aralar 2、GDH或者 Musashi 2的结合能发生变化的情况下，也可以认为会发生与TDP-43 稳定化的情况下同样的现象。因此，mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln是在没有 Asp和Glu补充的状态被捕获在凝集物内，同时，与将Glu转化成α 酮戊二酸相关的Aralar1，Aralar 2，GDH和/或与mt-tRNAAsn、 mt-tRNAGln结合的Musashi 2也被捕获。作为其结果，向mt-tRNAAsn和mt-tRNAGln的补充和向α酮戊二酸的转化不再发生，使细胞内产生 Asp和/或Glu的蓄积。特别是在星形细胞中，由于Asp被转化为Glu， 引起Glu的更加过量的蓄积(Pardo et al.,2011,J.Cereb.Blood Flow Metab.31(1):90-101；Hertz L.,2011,J.Cereb.Blood Flow Metab.31(1): 384-387)。能够推测由于过量蓄积的Glu毒性，诱导感受性特别高的运 动神经元发生细胞死亡。虽然这只是假说，但通过以上的发病机理， 能够解释TDP-43在ALS中被观察到的突变与ALS的病情，特别是 Glu浓度的上升是如何发生的。所以，对于与该发病机理相关的全部蛋 白质和/或RNA产生影响、降低Asp和/或Glu在细胞内浓度的物质 被认为可能成为ALS治疗剂中的有效成分。
<实施例13：TDP-43结合抑制剂的制造>
使用本发明的TDP-43结合抑制剂制造方法制造，制造通过竞争抑 制TDP-43和与其结合的mt-tRNA(mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro)结合的TDP-43结合抑制剂。
(1)4种mt-tRNA中的TDP-43结合区域候补的探索
(目的)
推测上述4种mt-tRNA的共通区域与TDP-43发生结合，所以对 上述4种mt-tRNA中的TDP-43的结合区域进行探索。
(方法)
首先，对于各个mt-tRNA的序列通过lustalW进行多序列比对，用 WebLogo将共有序列用MEME将图形分别提取，将共有序列在三维结 构上重叠进行分析。
(结果)
图19表示4种mt-tRNA的碱基序列的比对结果，图20表示 mt-tRNAAsn的二级结构，以及4种mt-tRNA的共有序列的位置。
从比对的结果以及二级结构明确了在D茎&环内的GUU(仅 mt-tRNAGln是GAU)、反密码子环内的UXU、T茎&环内的UGG以及 接受臂(氨基酰化臂)的CCA的4区域存在共有序列。其中反密码子 环内的共有序列UXU是其他多种mt-tRNA中共通的序列，另外接受 臂的共有序列CCA是全部mt-tRNA中共通的序列，不是上述4种 mt-tRNA特异性的序列。所以，将此2个共有序列从与TDP-43结合区 域候补中排除。另一方面，在D茎&环内和T茎&环内含有GUU和 UGG双方的共有序列分别的mt-tRNA在22种mt-tRNA中仅有 mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAGlu以及mt-tRNAPro的4种，因此明 确是这4种mt-tRNA特异性的序列。所以，将此两个共有序列作为 TDP-43结合区域候补，进行了进一步的验证。
(2)由TDP-43结合抑制剂候补寡核苷酸带来的mt-tRNA与TDP-43 结合的结合抑制
(目的)
由上述(1)的结果明确了与TDP-43结合的4种mt-tRNA中的四 个共有区域。因为推测含有这些共有序列的寡核苷酸是与TDP-43的结 合相关联的区域，因此可能成为抑制4种mt-tRNA与TDP-43结合的 TDP-43结合抑制剂候补物质。在此，使用这些寡核苷酸进行了与内源 性mt-tRNA之间对于TDP-43的竞争性测定。
(方法)
合成了以下寡核苷酸，即，将mt-tRNAAsn的5’末端的碱基作为1 位时，包含D茎&环的相当于1～25位的DNA寡核苷酸(D-loop； 5’-TAGATTGAAGCCAGTTGATTAGGGT-3’：序列号40)、包含反密码 子环的相当于26～48位(Anticodon；5’GCTTAGCTGTTAACTAAGTG TTT-3’：序列号41)、包含T茎&环的49～73位的DNA寡核苷酸 (T-loop；5’-GTGGGTTTAAGTCCCATTGGTCTAG-3’：序列号42)、 相当于包含在T茎&环的共有序列UUG的一部分的UG的12次重复 序列的DNA寡核苷酸(TG)12(5’-TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG TG-3’：序列号43)、作为(TG)12的对照用DNA寡核苷酸的(TG)12(5’-TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-3’：序列号44)、包含在T茎 &环的共有序列UGG的8次重复序列组成的DNA寡核苷酸(TGG)8(5’-TGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3’：序列号45)、以及包含 在D茎&环的共有序列UGG的7次重复序列组成的DNA寡核苷酸 TT(GTT)7G(5’-TTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTG-3’：序列号46) (附图中，为了方便而以(TTG)8表示)。
竞争性测定依照实施例1的方法进行。首先，遵循实施例1的“(3) 细胞提取液的制备”所述的方法制备细胞提取液后，添加作为TDP-43 结合抑制剂候补物质的各种DNA寡核苷酸，使其浓度为200nM。将未 添加寡核苷酸的样品作为阴性对照使用(-)。接着，遵循实施例1的“(4) 免疫沉降和RNA回收”以及“(5)尿素变性PAGE”所述的方法处理， 通过电泳展开含有Flag标签的与DAP-TDP-43结合的核酸。另外，依 照实施例2的RNA印迹法的方法，检测、定量与DAP-TD-43结合的 mt-tRNAAsn。作为用于检测的寡核苷酸探针，利用了序列号10的寡核 苷酸。mt-tRNAAsn的RNA带的信号强度通过LAS4000图像分析仪和 MultiGauge software(Fujifilm)进行了定量。
(结果)
结果示于图21以及22。
从图21A的结果，添加了(TG)12时与DAP-TD-43结合的4种 mt-tRNA的带颜色(图1参照)最淡，显示其对于与DAP-TD-43的结 合发生了抑制。加入D-loop和T-loop时，与阴性对照(-)相比较略微 产生了抑制，但加入Anticodon时几乎没有抑制效果。从图21B的结 果，同样的结果由通过RNA印迹法进行的mt-tRNAAsn的检测也得以确 认。
从图22A的结果，添加了(TG)12、(TTG)8以及TT(GTT)7G时，与 DAP-TD-43结合的4种mt-tRNA的带的颜色(图1参照)与阴性对照 (-)相比较明显变淡，显示其对与DAP-TD-43的结合发生了抑制。另 一方面，作为(TG)12的对照用，加入不含共有序列的(TG)12时， DAP-TD-43与mt-tRNA的结合未被抑制。同样的结果由通过图22B所 示的RNA印迹法进行的mt-tRNAAsn的检测也得以确认。(TG)12的结合 抑制效果最强，(TTG)8以及TT(GTT)87G次之。所以能够证明，含有 上述共有序列或者其一部分的(TG)12、(TTG)8以及TT(TT)87G可能成为 竞争性抑制TDP-43与4种mt-tRNA结合的TDP-43结合抑制剂。
(3)TDP-43结合抑制剂(TG)12的结合抑制效果的验证
(目的)
验证上述(2)所获得的TDP-43结合抑制剂的浓度和TDP-43与4 种mt-tRNA的结合抑制的效果。
(方法)
作为TDP-43结合抑制剂使用上述(2)所获得的(TG)12。基本方法 遵循上述(3)。但是添加的(TG)12的浓度为0、2、20、200nM。
(结果)
结果示于图23A～C。可以明确，与TDP-43结合抑制剂(TG)12的 浓度成比例地，TDP-43与4种mt-tRNA结合的抑制效果得到提高。
本说明书所引用的全部刊物、专利以及专利申请直接作为参考收 入本说明书中。
<实施例14：TDP-43与活性氧量的关系>
(目的)
实施例10中证明了TDP-43与ATP量的关联性。另一方面，ATP 增加的情况下，同时产生活性氧。活性氧已知作为一种细胞毒性，所 以被认为是造成细胞伤害的直接的原因物质。因此，对于TDP-43与活 性氧量的相关性也进行了验证。
(方法)
使用实施例1中制备的DAP-TDP-43细胞。DAP-TDP-43诱导表达 是通过向培养基添加强力霉素(+dox)进行，对于添加后8、24、48 小时后的细胞测定细胞内活性氧活性。诱导表达的对照是，在未添加 强力霉素(-dox)的培养基中，其他条件相同情况下培养的同系的细胞 株(293TRex)。
细胞内的羟基，过氧化基或者其他的活性氧活性的测定是利用细 胞浸透性荧光探针2’,7’-Dichlorodihydrofluorescin diacetate(DCFH- DA)。DCFH-DA在细胞内分散后，被细胞内的酯酶脱乙酰化，变化为 非荧光型2’,7’-Dichlorodihydrofluorescin(DCFH)。之后，立即被ROS 氧化，变化为强荧光性的2’,7’-Dichlorodihydrofluorescein(DCF)。荧 光强度与细胞溶质中的ROS水平成比例。具体而言，25μM的 DCFH-DA经细胞处理，在37℃保温30分钟后回收。回收的细胞中的 DCF的荧光强度通过流式细胞仪检测。(Miura D et al.(2004)Clinical &Experimental Metastasis 21:445-451)
(结果)
结果示于图24。能够明确，在诱导TDP-43表达的细胞中，随着 诱导时间的增加，即，伴随TDP-43的表达水平的增加，在细胞内的活 性氧活性显著增加。另一方面，未能确认未诱导TDP-43表达的细胞 (293TRex)中的细胞内活性氧活性有明显变化。以上的结果显示，与 TDP-43的表达量的增加成比例地，细胞内的活性氧量增加，这也显示 了由于TDP-43的表达水平的增加而使细胞毒性增加。
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