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本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明提供一种抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体，包括抗体轻链和抗体重链，其抗体轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或其保守型变异序列，其抗体重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或其保守型变异序列，重链和轻链通过二硫键连接。本发明提供的抗血管抑素受体的单克隆抗体为嵌合抗体，在保持其抗血管抑素受体活性的同时，使之更适合体内应用。该单抗具有与肿瘤细胞膜表面天然抗原结合活性，并可明显抑制肿瘤细胞膜表面ATP合成，对抗肿瘤治疗有重要的意义。

1.  一种抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体，包括抗体轻链和抗体重链，其抗体轻链的氨基 酸序列为SEQ ID NO:1或其保守型变异序列，其抗体重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:2 或其保守型变异序列，重链和轻链通过二硫键连接。

2.  一种分离的DNA分子，编码权利要求1所述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体的重链 和/或轻链的可变区或全长氨基酸。

3.  一种构建体，含有如权利要求2所述的分离的DNA分子。

4.  如权利要求3所述的一种构建体，其特征在于，由权利要求2所述的分离的DNA分子插 入到表达载体的多克隆位点构建而成。

5.  一种单克隆抗体的表达系统，由权利要求3-4任一权利要求所述的构建体转染到宿主细胞 构建而成。

6.  如权利要求1所述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：在适 合表达所述抗体的条件下，培养权利要求5所述的单克隆抗体的表达系统，从而表达出所 述的单克隆抗体，纯化分离出所述的单克隆抗体。

7.  如权利要求1所述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体在制备肿瘤治疗或肿瘤诊断类药 物上的用途。

8.  一种药物组合物，包括治疗有效量的所述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体。

一种人鼠嵌合单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体及其制 备方法和应用。
背景技术
血管抑素受体（Angiostatin Receptor F1F0-ATP合成酶）对肿瘤细胞中ATP合成起重要作 用。在正常人体组织中，血管抑素受体主要在线粒体内膜上定位，但也有少量存在于内皮细 胞的细胞膜上。相对而言，很多肿瘤细胞超量表达血管抑素受体，并大量定位于细胞膜上。 因而肿瘤细胞膜上的血管抑素受体是一个潜在的抗肿瘤药物靶标。近年发现,ATP合成酶不仅 存在于线粒体内膜，在内皮细胞和肿瘤细胞质膜表面也有表达。
Moser和Pizzo（1995）对血管抑素（环饼域1-3）在内皮细胞表面的结合位点进行了鉴定， 通过对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）膜组分进行配体杂交，成功分离了与血管抑素结合的蛋 白分子，大小约55kD，通过对获得的蛋白进行氨基末端测序、肽指纹图谱及免疫学分析表明， 抗肿瘤血管新生药血管抑素在该细胞表面的受体为人F1F0-ATP合成酶的α/β亚基（基因名分 别为ATP5A1和ATP5B），通过流式细胞术和免疫荧光分析的方法证实，这一受体在细胞表 面的有所表达。另外，血管抑素能与重组ATP5A1结合，抗ATP5A1的抗体能将血管抑素的 抗细胞增殖效果抑制掉90%。综上所述，细胞表面的ATP5A1/ATP5B是血管抑素在内皮细胞 表面的受体，血管抑素可能通过与ATP5A1/ATP5B亚基的结合，抑制内皮细胞的增殖和迁移， 从而抑制血管新生。肿瘤的生长和转移需要异常的血管新生作为条件，通过抑制新生血管生 成而阻止肿瘤的发展和转移是肿瘤临床治疗中的一个有效的新方向。
传统认为，人F1F0-ATP合成酶仅存在于细胞线粒体内膜，但Moser的发现表明其在内皮 细胞表面也有定位。在Moser的研究公开前，关于F1F0-ATP合成酶在细胞膜表面定位的报道 仅有一例，是定位于肿瘤细胞系A549的表面。在Moser的研究公开后，血管抑素与细胞表面 ATP合成酶的结合，又被其它的研究团体在不同的肿瘤细胞类型证实。在除内皮细胞外的许 多其它类型细胞，包括肿瘤细胞都发现了定位于细胞膜表面的F1F0-ATP合成酶，这些类型的 细胞都具有较强的增殖力，而在红细胞中未发现，这提示F1F0-ATP合成酶也许能作为肿瘤标 志物来检测，对肿瘤的早期诊断和预后具有重大的意义。
在Mozer提出哺乳动物细胞存在某些线粒体蛋白定位于胞膜表面的现象后，涌现出大量有 关线粒体基质蛋白定位于胞膜的报道，而这些蛋白在其异常定位上往往也是有某种功能的， 如蛋白P32，又名gC1q，是补体蛋白C1q的受体，提示定位于胞膜表面的F1F0-ATP合成酶也在 行使某种特殊的功能。在Mozer的研究中，膜表面的F1F0-ATP合成酶作为血管抑素抑制增殖 的靶点而被发现，随后发现的具有膜表达人F1F0-ATP合成酶的细胞都属于增殖力较强的类 型，提示膜表达的人F1F0-ATP合成酶可能具有促增殖作用，不仅是肿瘤的标志，还可能是癌 变的促因。如果能成功验证膜表达的人F1F0-ATP合成酶对肿瘤的促进作用，将使其肿瘤靶标 的地位进一步巩固，并可针对其促增殖功能设计相应的药物进行抑制，以期特异高效地治疗 肿瘤。
近年来研究发现肿瘤细胞膜表面的F1F0-ATP合成酶还具有调节细胞内pH的作用，对肿瘤 细胞在酸性微环境下的存活具有重要意义。血管抑素对肿瘤细胞的杀伤作用也被证明具有pH 依赖性，低pH下血管抑素对细胞的毒性更强。Moser等还发现内皮细胞即使在类似肿瘤微 环境的pH6.5-6.7条件下，依然能维持正常的细胞内pH，而且检测到此时细胞膜表面 F1F0-ATP合成酶的活性更强。在低pH环境下对内皮细胞给予血管抑素会使细胞内pH迅速降 低，导致多种代谢酶失活而最终致使内皮细胞死亡。值得一提的是，正常pH下血管抑素并不 能导致内皮细胞死亡，这证明pH压力是血管抑素诱导内皮细胞死亡的首要因素。因此，血管 抑素阻断的F1F0-ATP合成酶质子转运在提高pH压力的内皮细胞敏感性上起重要作用。这些结 果证实了类似肿瘤偏酸性微环境条件下，细胞膜表面F1F0-ATP合成酶对肿瘤细胞以及内皮细 胞存活的决定性作用，进一步论证了细胞膜表达F1F0-ATP合成酶作为肿瘤治疗靶标的可行 性。
Chi等采用纯化的E.coli F1-ATP合成酶免疫小鼠，得到21株单克隆抗体（mAb），其中只 有一株mAb是针对催化亚基ATP5B的，其余20株均是针对非催化亚基ATP5A1的，而只有针对 β亚基的那株mAb具有抑制F1-ATP合成酶活性的作用。而Mozer之前的研究报道，血管抑素在 HUVEC表面的受体由ATP5A1和ATP5B共同构成，本研究着重研究制备针对ATP5B亚基制备 的单克隆抗体并进行人源化，以期开发相应的抗体药物。
19世纪末，人们用癌细胞免疫动物产生抗血清来治疗癌症。然而，由于抗血清是多克隆 抗体，其中含有众多分别针对不同抗原的抗体，缺乏特异性，故用其治疗癌症不可能取得确 切的疗效。
20世纪后期，Georges Kohler和Cesar Milstein用细胞杂交技术使经绵羊红细胞（SRBC） 免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，建立了世界上首株B细胞杂交瘤细胞株，该细胞 株能长期、稳定地分泌特异、均质的分泌抗SRBC的单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）。 这一技术获得1984年的诺贝尔生理医学奖。mAb对抗原的高特异性使定向攻击肿瘤细胞成 为可能。之后的数十年里，mAb在疾病诊断领域成为常规试剂，而在治疗领域对其的研究也 迅速升温。
在20世纪末期，由于目前技术的局限，制备的多为鼠杂交瘤，产生的mAb就多为鼠源 性，在人体中极易产生人抗鼠抗体（HAMA）反应，使mAb用于治疗的研究受到限制，进入 了低谷阶段。随着基因工程的发展，研究者把基因工程技术引入单抗研究，通过基因操作的 手段将鼠源mAb嵌合或人源化改造。最早报道的基因工程抗体是莫里森（Morrison）等研制 的人-鼠嵌合抗体，该技术对抗体的临床应用影响深刻，嵌合抗体是通过基因工程将鼠源单抗 可变区和人抗体恒定区拼接的抗体，相对于其它人源化抗体的优点在于其技术路线简单；抗 体完整性好，体内滞留期长，免疫原性大大降低。利妥昔单抗（rituximab）于1997年获得 FDA批准，是全球第一个上市的抗肿瘤mAb药物，用于治疗CD20阳性的B淋巴细胞性非 霍奇金淋巴瘤，该抗体就是一个人鼠嵌合抗体，第一个用于临床的嵌合抗体是阿来组单抗 (alemtuzumab)，用于治疗非何杰金氏淋巴瘤和类风湿性关节炎。曲妥珠单抗（trastuzumab） 于1998年获批，是一种可以抑制HER-2/neu阳性乳腺癌的mAb药物，该抗体是一个全人源 化抗体。吉妥单抗（gemtuzumab ozogamicin）于2000年获批，用于治疗CD33阳性的急性复 发性髓性白血病，该抗体也是一个人源化抗体。近年来，先后获批用于治疗肿瘤的抗体药物 还有90Y-ibritumomab、131I-tositumomab、cetuximab和bevacizumab等，其中嵌合或人源化 的抗体所占的比例逐年提升，全人抗体已成为治疗类抗体在抗体类型上必然趋势。目前已有 超过20种嵌合抗体已进入临床试验阶段，还有为数众多的嵌合或人源化抗体处于临床前研究 阶段。
嵌合抗体可变区基因的克隆，通常是参考Kabat数据库中的抗体序列，针对抗体可变区的 保守区域设计若干套通用引物，采用RT-PCR法从杂交瘤细胞株或者病人的淋巴B细胞的cDNA 文库中扩增可变区基因，该方法简单实用，通常5’端通用引物设计在第一骨架区或前导肽区； 3’端通用引物设计在恒定区或J链区。
嵌合抗体恒定区由抗体亚型决定，不同的亚型具有不同的免疫效应，故可根据需要的免 疫效应选择不同的亚型恒定区进行扩增。IgG1适于介导抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）和 补体依赖的细胞毒作用（CDC），而IgG2和IgG4则适于激活或阻断某一受体。抗体的恒定区 不仅能提供效应功能，还能通过于组织细胞表面的IgGFc受体FcγRn结合，免受蛋白酶类降解， 在体内保持较长半衰期（20多天）。
嵌合抗体的重轻链表达单位可串联于一个表达载体上，也可分别构建于两个载体上共转 染，有文献报道，串联表达载体的转化子中产生抗体的克隆的比例显著高于共转染表达载体。 目前用于增加目的基因扩增的筛选标记主要有二氢叶酸还原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶 （GS）两种。而用于临床治疗用抗体表达的系统主要是CHO细胞系统，该系统能为嵌合抗体 的恒定区提供有效的糖基化和抗体的加工修饰。文献报道，通过选择有效的表达载体和筛选 系统，抗体表达量可提高到1000-2000mg/L。
嵌合抗体技术与其它人源化技术比，具有构建周期短，不易引起亲和力降低等优势，因 而本研究在进行人源化改造时优先考虑嵌合抗体的技术路线。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗血管抑素受体人鼠嵌合单 克隆抗体，并进一步提供了编码该单克隆抗体的DNA序列、构建了含该DNA序列的真核细 胞表达载体、稳定高表达该单克隆抗体的宿主细胞株以及建立纯化该抗体的工艺方法。并通 过公开了上述抗体与同类产品的比较的检测结果，验证了所述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克 隆抗体的抗肿瘤效果。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种抗血管抑素受体人鼠嵌合单 克隆抗体，包括抗体轻链和抗体重链，其抗体轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或其保守型 变异序列，其抗体重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或其保守型变异序列，重链和轻链通过 二硫键连接。
本发明第二方面提供一种分离的DNA分子，编码所述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆 抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸。
本发明第三方面提供一种构建体，含有所述的分离的DNA分子。
优选的，所述构建体由所述分离的DNA分子插入到表达载体的多克隆位点构建而成。
本发明中的表达载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺 乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
更优选的，所述表达载体为pCI-neo等。
本发明第四方面提供一种单克隆抗体的表达系统，由所述构建体转染到宿主细胞构建而 成。
本发明中的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞； 或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的 细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO或Bowes黑素瘤 细胞的动物细胞等。
优选的，所述宿主细胞是CHO细胞，保存号为20089278。
本发明第五方面提供所述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法，包括如下步 骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养所述单克隆抗体的表达系统，从而表达出所述的单 克隆抗体，纯化分离出所述的单克隆抗体。
本发明中所用的宿主细胞均为现有技术，可通过商业途径直接获取，培养中所用的培养 基亦为各种常规培养基，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生 长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或 化学诱导）诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细 胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特 性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方 法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破 菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC） 和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明从单克隆培养的细胞株中筛选获取目的抗体的基因序列，用以构建真核表达载体， 表达后即可重建抗体的活性，获得抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体。
本发明第六方面提供所述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体在制备肿瘤治疗或肿瘤诊 断类药物上的用途。
本发明第七方面提供一种药物组合物，包括治疗有效量的所述抗血管抑素受体人鼠嵌合 单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合 物以所述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体为活性成分，加上一种或多种药物可接受的载 体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领 域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括（但不限于）乳糖、玉米淀粉或其衍生 物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羚基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如 此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定 剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于 提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可 以使用抑制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本 发明的单克隆抗体可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给 药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂进行 给药。
本发明还进一步对抗血管抑素受体单克隆抗体通过体外肿瘤细胞的效果测定和体内动物 实验研究了该抗体在细胞与动物体内的治疗有效性。
本发明提供的抗血管抑素受体的单克隆抗体为嵌合抗体，在保持其抗血管抑素受体活性 的同时，使之更适合体内应用。该单抗具有与肿瘤细胞膜表面天然抗原结合活性，并可明显 抑制肿瘤细胞膜表面ATP合成，对抗肿瘤治疗有重要的意义。
附图说明
图1：实施例1中构建的表达载体图谱。
图2：实施例2中HAI178(McAb178)抗体抑制肿瘤细胞/血管内皮细胞膜ATP合成酶活性 示意图。
图3：实施例3中HAI178抗体的生物学活性分析图。
图4：实施例4中HAI178抗体抑制白血病细胞的体内生长能力分析图。
图5：实施例5中流式细胞仪检测100μg/ml HAI-178抗体改变细胞周期的作用示意图； (A)HAI-178抗体对MDA-MB-231细胞增殖周期的影响；(B)HAI-178抗体对A549细胞增殖 周期的影响。
图6：实施例5中HAI178抗体影响白血病细胞周期的分析图。
图7：实施例5中Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测100μg/ml HAI-178抗体诱导的人 乳腺癌和肺癌细胞凋亡作用示意图。
图8：实施例5中Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测50μg/ml HAI-178抗体诱导的人 白血病细胞MV4-11和HL-60的凋亡作用示意图。
图9：实施例6中100μg/mlHAI-178抗体作用48h及72h后抑制人乳腺癌和肺癌细胞增 殖效率示意图。
图10：实施例6中HAI-178抗体作用120h后抑制不同白血病细胞增殖效率示意图。
图11：实施例6中HAI178抗体抑制肿瘤细胞的克隆性生长示意图。
图12：实施例7中HAI178抗体抑制HUVEC体外血管肢形成示意图。
图13：实施例8中HAI178抗体抑制人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长（瘤重）示意图。
图14：实施例8中HAI178抗体抑制人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长（瘤体积）示意图。
图15：实施例8中HAI178抗体抑制人肺癌细胞裸鼠移植瘤的生长（瘤重）示意图。
图16：实施例8中HAI178抗体抑制人肺癌细胞裸鼠移植瘤的生长（瘤体积）示意图。
图17：实施例10中HAI178抗体与不同白血病细胞的特异性结合示意图。
图18：实施例11中HAI178抗体与乳腺癌组织的特异性结合示意图：A、B、C、D、E、 F为乳腺癌组织；G为正常乳腺组织；H、I、J、K为不典型增生乳腺组织。
图19A-B：实施例11中HAI178抗体与肺癌组织的特异性结合示意图：A为正常肺组织； B为肺癌组织。
图20A-B：实施例11中HAI178抗体与胃癌组织的特异性结合示意图：A为正常胃组织； B为胃癌组织。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定 的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指 出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例 中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常 规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor  Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN  MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987and periodic updates；the series  METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN  STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS  IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic  Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin  Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
嵌合抗体的制备
1）小鼠源特异性单克隆抗体的制备
以经人ATP合成酶抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞常规融合，获得杂交瘤细胞 株，从中筛选出一株阳性克隆杂交瘤细胞株命名为：7E10(McAb178)。
2）小鼠源特异性单克隆抗体克隆7E10Fab基因的获得
取阳性克隆杂交瘤7E10细胞株：5000-10000个细胞，用Trizol（Invitrogen公司产品） 分离总RNA，使用反转录酶（Invitrogen公司产品）以获取cDNA。上述操在均按照厂家说明 书进行。用下述引物和条件进行PCR，所用扩增酶为KOD plus（TOYOBO）确保扩增过程中 减少可能的突变。
抗体Fab区的扩增引物为4组，分别为mouse IgG-5’/mouse IgG1-3’，mouse IgG-5’/mouse  IgG2a-3’，mouse IgG-5’/mouse IgG3-3’，(LC1+LC2+LC3+LC4+LC5+LC6+LC7)/mouse  kappa-3’，延伸时间1min。PCR产物电泳回收，并克隆至载体pMD19-T测序。根据Fab区测 序结果设计引物，扩增可变区，并克隆至载体pMD19-T测序。
PCR条件：
a)反应体系的组成：

上机反应

表1克隆嵌合抗体相关引物设计


3）特异性人-鼠嵌合抗体HAI178（7E10，McAb178）基因的获得 杂交瘤细胞信号肽区扩增：
根据对重、轻链Fab区序列分析结果设计引物，应用cRACE法扩增杂交瘤细胞的信号肽 区。PCR产物电泳回收，并克隆至载体pMD19-T获得pMD19-7E10L及pMD19-7E10H,测序。 人IgG1重、轻链恒定区扩增：
人IgG1重、轻链恒定区基因进行PCR扩增，并克隆至载体pMD19-T测序。 拼接构建嵌合重链和嵌合轻链基因：
分别利用7E10LP1-P6的这组引物及7E10LHP1-P6这组引物，以7E10反转录所获得的 cDNA为模板，使用拼接PCR(SOE-PCR)将7E10的信号肽区、可变区、人IgG1的重、轻链 恒定区进行拼接获得嵌合重链和嵌合轻链基因。将两者的PCR产物电泳回收，并克隆至载体 pMD19-T测序。
SEQ ID NO:1嵌合轻链序列：
＋Kozak序列＋信号肽+FR1++FR2++FR3++CL+MluI 核苷酸序列（SEQ ID NO:3）：
GCTAGCGCCGCCACCATGGACATGCGGGTTCCAGCCCAGCTTCTCGGACTTCTGCTGTT GTGGCTGCGCGGAGCACGGTGCGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTG TCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTA ATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTG ATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATC AGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAACAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATT TCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAA ATCAAAACCCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG TTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC AAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCA AAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAG CTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGACGCGT
氨基酸序列（SEQ ID NO:1）：
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCELVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLH WYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGIYFCSQSTHVPP WTFGGGTKLEIKTRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:2嵌合重链：
重链：EcoRI---NotI
＋Kozak序列＋信号肽+FR1++FR2++FR3++CH+NotI 核苷酸序列（SEQ ID NO:4）：
GAATTCGCCGCCACCATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAA GGGTGTGCAGTGTGAGGTCCAGCTGCTCGAGTCAGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGG GCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGACTTCTGGATTCACATTCACTGACTACAACATGCAC TGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTTATCCTTACAAT GGTGCTACTGGCTACAACCAGAACTTCAAGAACAAGGCCACATTGACTGTAGACAGTTC CTCCAGTACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTA CTGTGCAAGTTCATTACTACGGGTGGGGGGTTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTC TCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCC AAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCG AACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCA GCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCT GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGC
氨基酸序列（SEQ ID NO:2）：
MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLLESGPELVKPGASVKISCKTSGFTFTDYNMHWVKQSHG KSLEWIGYIYPYNGATGYNQNFKNKATLTVDSSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASSLLRVG GFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在测序获得重、轻链可变区序列后，可以通过全合成或者拼接PCR的方法来获得含有重、 轻链可变区的序列的嵌合重链和嵌合轻链基因，此技术为本技术领域的技术人员所熟知。
4）嵌合抗体的真核表达载体pHAI-7E10H、pHAI-7E10L、pHAI-7E10LH的构建
用NheI和MluI分别酶切嵌合轻链克隆载体pMD-7E10L及表达载体pCI-neo，电泳回收 后，T4连接酶16℃连接2h。连接产物转化TOP10感受态细菌。重组质粒经PCR和酶切鉴 定后，筛选出阳性克隆pCI-7E10L。
用EcoRI和NotI分别酶切嵌合重链克隆载体pMD-7E10H及表达载体pCI-neo，电泳回 收后，T4连接酶16℃连接2h。连接产物转化TOP10感受态细菌。重组质粒经PCR和酶切 鉴定后，筛选出阳性克隆pCI-7E10H。
同时构建嵌合表达载体，将polyA和CMV克隆至pMD-19T载体，两端分别添加MluI 和NotI酶切位点，在CMV序列之后、NotI酶切位点之前添加EcoRI位点，用EcoRI和NotI 酶切嵌合重链克隆载体pMD-7E10H，将重链片段切下，电泳回收目的片段。同时，EcoRI和 NotI酶切pMD-polyA-CMV，T4连接酶16℃连接2h。连接产物转化TOP10感受态细菌。重 组质粒经PCR和酶切鉴定后，筛选出阳性克隆pMD-polyA-CMV-7E10H。pCI-neo、pMD- polyA-CMV-7E10H用MluI和NotI双酶切，电泳回收pCI-neo和polyA-CMV-7E10H片段， T4连接酶16℃连接2h。连接产物转化TOP10感受态细菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后， 筛选出阳性克隆pCI-polyA-CMV-7E10H。用NheI和MluI双酶切pMD-7E10L、pCI -polyA-CMV-7E10H，电泳回收酶切产物，T4连接酶16℃连接2h。连接产物转化TOP10感 受态细菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后，筛选出阳性克隆pHAI-7E10LH。
表达载体pCI-7E10LH中NheI位点与NotI位点之间的全长序列如下（如图1所示）：
全长序列SEQ ID NO:5：7E10L+PolyA+pCMV+7E10H
＋Kozak序列＋信号肽+FR1++FR2++FR3++CL+MluI +polyA+pCMV+＋Kozak序列＋信号肽+FR1++FR2++FR3++C H+NotI
GCTAGCGCCGCCACCATGGACATGCGGGTTCCAGCCCAGCTTCTCGGACTTCTGCTGTT GTGGCTGCGCGGAGCACGGTGCGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTG TCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTA ATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTG ATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATC AGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAACAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATT TCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAA ATCAAAACCCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG TTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC AAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCA AAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAG CTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGACGCGT（7E10L）
ttccctttagtgagggttaatgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgcttt atttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagg gggagatgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtaaaatccgataagg（polyA）
tcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctattggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacattt atattggctcatgtccaatatgaccgccatgttggcattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatg gagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccat agtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagt ccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctac gtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccacc ccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactgcgatcgcccgccccgttgacgcaaat gggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcactagaagctttattgcggtagtttatcacag ttaaattgctaacgcagtcagtgcttctgacacaacagtctcgaacttaagctgcagtgactctcttaaggtagccttgcagaagttggtcgtgagg cactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgat aggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaattacagctcttaaggctagagtacttaatacga ctcactataggctagcctcga（pCMV）
GAATTCGCCGCCACCATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAA GGGTGTGCAGTGTGAGGTCCAGCTGCTCGAGTCAGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGG GCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGACTTCTGGATTCACATTCACTGACTACAACATGCAC TGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTTATCCTTACAAT GGTGCTACTGGCTACAACCAGAACTTCAAGAACAAGGCCACATTGACTGTAGACAGTTC CTCCAGTACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTA CTGTGCAAGTTCATTACTACGGGTGGGGGGTTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTC TCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCC AAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCG AACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCA GCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCT GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGC（7E10H）
5）HAI178抗体稳定表达细胞的获得
CHO-DG44细胞培养、转染与加压筛选：
CHO-DG44细胞采用含10%FBS、0.03mmol/L次黄嘌呤（H）、0.003mmol/L胸腺嘧啶 脱氧核苷（T）、0.1mmol/L脯氨酸（Pro）、0.1mmol/L甘氨酸（Gly）、2mmol/L谷氨酰胺、 100U/ml青链霉素的F12完全培养基在37℃、5％CO₂培养，常规按1：4传代。
7E10嵌合表达质粒（pCI-7E10LH）的转染：
1）质粒抽提。
2）细胞瞬时转染：细胞转染按Lipofectamine^TM2000操作说明书进行，以6孔板中的1 孔为例，简要步骤如下：向该孔接种4×10⁵细胞，37℃、5％CO₂培养18h后换液1次，12h 后开始转染,贴壁细胞在转染时的理想汇合度为90-95%。将4μg质粒DNA和10μl  Lipofectamine^TM2000分别用无抗生素、无血清的培养基稀释至250μl，温和混匀，室温静置 15min形成脂质体复合物。用PBS洗涤细胞一次，并加入2mlF12作培养基，再滴入脂质体 复合物，将板前后振荡，温和混匀。37℃、5％CO₂培养6h后更换5ml含10％FBS的F12 完全培养基培养48－72h，之后用不含H、T、Gly的无血清培养基EX-CELL 302培养以筛 选dhfr⁺表型的细胞克隆。
将在EX-CELL 302中培养的细胞消化，计数，按1.5个细胞/孔接种于96孔培养板中进 行亚克隆，采用羊抗小鼠Fab包被的夹心ELISA筛选嵌合抗体高表达的克隆。挑选嵌合抗体 表达最高的细胞克隆，按1:5传代后换含30nmol/L氨甲喋呤（MTX）的EX-CELL 302选择 培养基进行培养。待细胞适应了30nmol/L MTX后，如前所述继续进行亚克隆，筛选嵌合抗 体表达最高的细胞克隆，按同样方法相继换含100nmol/L MTX、1μmol/L MTX的EX-CELL 302选择培养基进行培养，进行亚克隆，待96孔板细胞基本长满后，换液继续培养2d，取 上清测定其嵌合抗体含量，以此法筛选嵌合抗体表达最高的细胞克隆。将细胞克隆移至25cm²培养瓶中扩大培养，待细胞长满后，换液继续培养4天，取上清测定其嵌合抗体含量，并以 此次测得的抗体含量值为准，挑选嵌合抗体表达最高的细胞克隆77-6-15，经测序鉴定表达嵌 合抗体的氨基酸序列符合预期。
本发明构建了抗血管抑素的人鼠嵌合抗体基因，并在CHO-DG44细胞成功表达，表达产 物之后简称7E10（HAI-178）。表达产物保持了亲本鼠抗的抗原结合性，同时在恒定区以人源 代替了鼠源，在分泌克隆上清中表达量为287ng/ml。
6）HAI178抗体表达的检测
ELISA检测HAI178的表达：
1）间接ELISA检测HAI178的抗原结合性和人源性，每个样品都用羊抗人IgG Fc-HRP 酶标二抗和羊抗鼠IgG Fc-HRP分别进行检测。
2）双抗体夹心ELISA，以1μg/ml的羊抗小鼠Fab抗体包被酶标板过夜，以羊抗人IgG  Fc-HRP酶标二抗检测。
以rhATP5B包被酶标板进行间接ELISA实验，用羊抗人IgG Fc-HRP为二抗时，转染细 胞克隆77-6-15培养上清中的HAI178既可结合包被的rhATP5B，也可被羊抗人IgG(H+L)识 别，呈现阳性反应。用羊抗鼠IgG Fc-HRP为二抗时，亲本m7E10（鼠源）呈阳性反应，而 嵌合抗体HAI178呈阴性反应（结果见表2）。这证明HAI178含有人抗体的恒定区片段，并 与m7E10一样可以结合rhATP5B。
表2间接ELISA检测转染细胞株嵌合抗体HAI178的抗原结合性和人源性
A:羊抗人IgG(H+L)-HRP为二抗，B:羊抗鼠IgG(H+L)-HRP为二抗