一种检测钠离子浓度的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410743760.1 (22)申请日 2014.12.08 G01N 21/78(2006.01) G01N 21/31(2006.01) (71)申请人 中国科学院化学研究所 地址 100080 北京市海淀区中关村北一街 2 号 (72)发明人 孙红霞 陈宏博 唐亚林 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 赵静 (54) 发明名称 一种检测钠离子浓度的方法 (57) 摘要 本发明提供一种检测钠离子浓度的方法。方 法包括 ： 配制标准溶液DNA酶体系 ； 配制待测溶液 DNA 酶体系 ； 。

2、配制标准溶液及待测溶液 ； 测量标准 溶液样本在 420nm 处的吸光度， 绘制钠离子浓度 与吸光强度值的标准曲线 ； 测量待测溶液样本在 420nm 处的吸光度， 根据标准曲线， 得到待测样品 中钠离子的浓度。本发明利用 DNA 酶特异识别钠 离子调控的 G- 四链体结构， 可在生理钾离子浓度 下操作而不受影响， 对钠离子特异性高 ； 使用 DNA 酶设计的探针， 对钠离子调控的 G- 四链体结构变 化十分敏感， 伴有颜色的改变， 同时在紫外吸收 光谱中展现出明显的变化 ； 只需要紫外吸收光谱 仪， 测试成本低廉 ； 所用试剂品种少， 只需按比例 混合就可检测， 操作简单、 快捷且成本低廉，。

3、 该体 系在缓冲液环境中操作， 环保无污染。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书9页 序列表2页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104458728 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104458728 A 1/2 页 2 1. 一种检测钠离子浓度的方法， 包括下述 ： (1) 配制标准溶液 DNA 酶体系 用含钾离子的缓冲液溶解可溶性钠盐配置多个浓度梯度的钠离子溶液， 分别向每个浓 度梯度的钠离子溶液中均加入 DNA， 得到多个 DNA 含量相同的钠离子 -DNA 体系 ； 所述多个 DNA 含量相。

4、同的钠离子 -DNA 体系反应后， 得到多个构型不同的 DNA G- 四链体的体系， 分别 向各个所述 DNA G- 四链体的体系中加入氯化血红素， 得到氯化血红素含量相同的多个 DNA G- 四链体 - 氯化血红素体系， 所述多个 DNA G- 四链体 - 氯化血红素体系反应后， 得到多个 标准溶液 DNA 酶体系 ； 所述 DNA 为能够形成 G- 四链体的 DNA ； (2) 配制待测溶液 DNA 酶体系 将待测样品加入到所述含钾离子的缓冲液， 得到待测样品溶液， 向所述待测样品溶液 中加入所述 DNA， 得到待测样品 -DNA 体系， 所述待测样品 -DNA 体系中所述 DNA 的含量。

5、与所 述多个 DNA 含量相同的钠离子 -DNA 体系中所述 DNA 的含量相同 ； 所述待测样品 -DNA 体系 反应后， 得到DNA G-四链体的体系， 向该体系中加入氯化血红素， 反应后， 得到DNA G-四链 体 - 氯化血红素体系， 所述 DNA G- 四链体 - 氯化血红素体系中的氯化血红素含量与所述多 个 DNA G- 四链体 - 氯化血红素体系中的氯化血红素含量相同 ； 所述 DNA G- 四链体 - 氯化 血红素体系反应后， 得到待测溶液 DNA 酶体系 ； (3) 标准溶液及待测溶液的配制 将 2,2 - 联氨 - 双 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 ) 二胺盐 AB。

6、TS 溶液与 H2O2混合， 得 到混合液， 将该混合液称为底物溶液， 向所述多个标准溶液 DNA 酶体系中的每一个标准溶 液 DNA 酶体系中加入所述底物溶液进行反应， 得到多个标准溶液样本 ； 向所述待测溶液 DNA 酶体系中加入所述底物溶液进行反应， 得到待测溶液样本 ； (4) 标准曲线的制备 测量所述多个标准溶液样本在 420nm 处的吸光度， 绘制钠离子浓度与吸光强度值的标 准曲线 ； (5) 待测样本检测 测量所述待测溶液样本在 420nm 处的吸光度， 根据所述标准曲线， 得到所述待测样品 中钠离子的浓度。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 (1) 中。

7、， 所述含钾离子的缓冲液通过 下述至少一种缓冲液制备得到 ： 三羟甲基氨基甲烷 - 盐酸缓冲液、 硼酸 - 硼砂缓冲液、 三乙 醇胺缓冲液、 咪唑-盐酸缓冲液、 双甘氨肽缓冲液、 2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、 磷酸二 氢钾 - 磷酸氢二钾缓冲液、 柠檬酸 - 柠檬酸钾缓冲液 ； 所述含钾离子的缓冲液的 pH 值为 6.2-8.2。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述能够形成 G- 四链体的 DNA 选 自 下 述 至 少 一 种 ： GGGCCAGGGAGCGGGGCGGAGGGGG、 AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 和 TTAGGGTTA。

8、GGGTTAGGGTTAGGG。 4. 根据权利要求 1-3 中任一项所述的方法， 其特征在于 ： 所述 (3) 中， 所述混合液中的 ABTS 与 H2O2 的摩尔浓度比为 0.1 50 ； 所述标准溶液样本中的钾离子浓度大于 0 小于等于 30mmol/L ； 所述标准溶液样本中的 DNA 分子的浓度为 0.01 10mol/L ； 权 利 要 求 书 CN 104458728 A 2 2/2 页 3 所述标准溶液样本中氯化血红素的浓度为 0.01 10mol/L。 5. 根据权利要求 1-4 中任一项所述的方法， 其特征在于 ： 所述 (2) 中， 所述待测样品为 人或动物体液。 权 利。

9、 要 求 书 CN 104458728 A 3 1/9 页 4 一种检测钠离子浓度的方法 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 具体涉及一种检测钠离子浓度的方法。 背景技术 0002 人体内的钠是维持细胞生理活动的主要阳离子， 是保持机体的正常渗透压及酸碱 平衡， 参与糖及蛋白质代谢， 保证神经肌肉的正常功能所必需， 其含量是人体生理活动的重 要指标。尿液、 血清中钠离子的含量水平在临床上可用于诊断一些肾脏、 心脏等方面的疾 病。 0003 正常情况下， 人体的钠离子浓度有一个合理的参考范围， 如血清中 ： 135 155mmol/L ； 尿液中 130 260mmol/24h。当钠离。

10、子高于参考值， 表现出高钠症， 其原因主要 有 ： 急性肾功能衰竭、 严重溶血或组织损伤、 急性酸中毒或组织缺氧、 肾上腺皮质功能减退、 醛固酮缺乏、 长期应用利尿剂等。 血清钠高还可引起严重的肌肉、 心肌和呼吸功能的抑制性 应激紊乱， 以及特异的心电图改变。反之当钠的摄入量不足、 钠丢失严重、 肾脏疾病转入多 尿期等情况时则会出现低钠症。 0004 现有技术中测定钠离子浓度的方法主要有 ： 中子活化法、 同位素稀释质谱法、 化学 测定法、 火焰光度法、 离子选择电极法、 酶动力学法、 原子分光光度法等。目前， 临床上经常 使用的方法是火焰光度法和离子选择电极法。 0005 (1) 火焰光度法。

11、 ： 火焰光度法是一种发射光谱分析法， 利用火焰中激发态原子回 降至基态时发射的光谱强度进行含量分析， 可检测血清、 尿液、 脑脊液及胸腹水的 Na+， 该方 法属于经典的标准参考法， 优点是结果准确可靠， 广为临床采用。 0006 (2) 离子选择电极法 (ISE 法 ) ： 在专用仪器上进行血清和尿液的钠离子测定。因 其具有标本用量少， 快速准确， 操作简便等优点， 是目前所有方法中最为简便准确的方法， 几乎有取代其他方法的趋势。 其原理是 ： 离子选择电极是一种电化学传感器， 其结构中有一 个对特定离子具有选择性响应的敏感膜电极， 将离子活度转换成电位信号， 在一定范围内， 其电位与溶液。

12、中特定离子活度的对数呈线性关系， 通过与已知离子浓度的溶液比较可求得 未知溶液的离子活度， 按其测定过程又分为直接测定法和间接测定法， 目前大部分采用间 接测定法， 由于间接测定法将待测样本稀释后测定， 所测离子活度更接近离子浓度。 目前主 要的电极种类有 ： 玻璃膜电极， 感应材料为玻璃膜 ； 固相电极， 由难溶金属物质加压成型 ； 液态膜电极， 将环氧树脂或内装聚氯乙烯作为感应膜 ； 缬氨霉素膜制成的 K+ 电极。这些电 极都具有一定寿命， 使用一段时间后， 电极会老化， 且价格昂贵。 0007 (3) 酶法 ： 酶法测定钠的原理是利用对丙酮酸激酶的激活作用， 后者催化磷酸烯 醇式丙酮酸变。

13、为乳酸同时伴有还原型辅酶的消耗， 在波长 340nm 处测 NADH 的吸光度下 降。 0008 (4) 原子分光光度法也可用于检测血清中钠离子， 但操作复杂， 误差较大， 不及火 焰光度法简便。 说 明 书 CN 104458728 A 4 2/9 页 5 发明内容 0009 本发明的目的是提供一种检测钠离子浓度的方法。 0010 本发明所提供的检测钠离子浓度的方法， 包括下述 ： 0011 (1) 配制标准溶液 DNA 酶体系 0012 用含钾离子的缓冲液溶解可溶性钠盐配置多个浓度梯度的钠离子溶液， 分别向每 个浓度梯度的钠离子溶液中均加入 DNA， 得到多个 DNA 含量相同的钠离子 -。

14、DNA 体系 ； 所述 多个 DNA 含量相同的钠离子 -DNA 体系反应后， 得到多个构型不同的 DNA G- 四链体的体系， 分别向各个所述DNA G-四链体的体系中加入氯化血红素， 得到氯化血红素含量相同的多个 DNA G- 四链体 - 氯化血红素体系， 所述多个 DNA G- 四链体 - 氯化血红素体系反应后， 得到 多个标准溶液 DNA 酶体系 ； 所述 DNA 为能够形成 G- 四链体的 DNA ； 0013 (2) 配制待测溶液 DNA 酶体系 0014 将待测样品加入到所述含钾离子的缓冲液， 得到待测样品溶液， 向所述待测样品 溶液中加入所述 DNA， 得到待测样品 -DNA 。

15、体系， 所述待测样品 -DNA 体系中所述 DNA 的含量 与所述多个DNA含量相同的钠离子-DNA体系中所述DNA的含量相同 ； 所述待测样品-DNA体 系反应后， 得到DNA G-四链体的体系， 向该体系中加入氯化血红素， 反应后， 得到DNA G-四 链体 - 氯化血红素体系， 所述 DNA G- 四链体 - 氯化血红素体系中的氯化血红素含量与所述 多个 DNA G- 四链体 - 氯化血红素体系中的氯化血红素含量相同 ； 所述 DNA G- 四链体 - 氯 化血红素体系反应后， 得到待测溶液 DNA 酶体系 ； 0015 (3) 标准溶液及待测溶液的配制 0016 将 2,2 - 联氨 。

16、- 双 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 ) 二胺盐 ABTS 溶液与 H2O2混 合， 得到混合液， 将该混合液称为底物溶液， 向所述多个标准溶液 DNA 酶体系中的每一个标 准溶液 DNA 酶体系中加入所述底物溶液进行反应， 得到多个标准溶液样本 ； 向所述待测溶 液 DNA 酶体系中加入所述底物溶液进行反应， 得到待测溶液样本 ； 0017 (4) 标准曲线的制备 0018 测量所述多个标准溶液样本在 420nm 处的吸光度， 绘制钠离子浓度与吸光强度值 的标准曲线 ； 0019 (5) 待测样本检测 0020 测量所述多个待测溶液样本在 420nm 处的吸光度， 根据所述标准曲线，。

17、 得到所述 待测样品中钠离子的浓度。 0021 上述方法所述 (1) 中， 所述多个可为 2 个以上， 如 7 个。 0022 上述方法所述 (1) 中， 所述含钾离子的缓冲液通过下述至少一种缓冲液制备得 到 ： 三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、 硼酸-硼砂缓冲液、 三乙醇胺缓冲液、 咪唑-盐酸缓冲 液、 双甘氨肽缓冲液、 2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、 磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液、 柠 檬酸 - 柠檬酸钾缓冲液。 0023 所述含钾离子的缓冲液的 pH 值为 6.2-8.2。 0024 所述钾离子来源于可溶性钾盐， 如氯化钾、 硫酸钾、 硝酸钾、 溴化钾或碘化钾。 0025 所述可溶性。

18、钠盐的非限制性实例包括 ： 氯化钠、 溴化钠、 碘化钠和硝酸钠等。 0026 上述方法所述 (1) 中， 所述 DNA 为能够形成 G- 四链体的 DNA， 所述能够形成 G- 四链体的 DNA 选自下述至少一种 ： GGGCCAGGGAGCGGGGCGGAGGGGG( 核苷酸序列如序列 说 明 书 CN 104458728 A 5 3/9 页 6 表中序列 1 所示 )、 AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG( 核苷酸序列如序列表中序列 2 所示 ) 和 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG( 核苷酸序列如序列表中序列 3 所示 )。 0027 上述方法所述 (2) 中，。

19、 所述待测样品为人或动物血液、 尿液或其他体液。 0028 上述方法所述 (3) 中， 所述混合液中的 ABTS 与 H2O2的摩尔浓度比为 0.1 50， 优 选为 0.2 10。 0029 所述标准溶液样本中的钾离子浓度可为大于 0 小于等于 30mmol/L， 如 0-10mmol/ L、 1-5mmol/L 或 2-4mmol/L。 0030 所述标准溶液样本中的DNA分子的浓度可为0.0110mol/L， 如0.12mol/ L。 0031 所述标准溶液样本中氯化血红素的浓度可为 0.01 10mol/L， 如 0.1 2mol/L。 0032 上述方法所述 (1)、 (2) 和 (。

20、3) 中， 所述反应的时间均为 0.1-3 小时。 0033 上述方法所述 (3) 中， 所述待测溶液样本中的钾离子浓度、 DNA 分子的浓度、 和氯 化血红素的浓度分别与所述标准溶液样本中的钾离子浓度、 DNA 分子的浓度、 和氯化血红素 的浓度相等。 0034 本发明的方法可以方便地用于检测各种溶液样品中的钠离子浓度， 例如， 可以检 测人或动物血液、 尿液或其他体液中的钠离子浓度。 0035 本发明的方法的主要优点在于 ： 0036 1)本发明利用DNA酶特异识别钠离子调控的G-四链体结构， 可在生理钾离子浓度 下操作而不受影响， 对钠离子特异性高 ； 0037 2) 本发明使用 DNA。

21、 酶设计的探针， 对钠离子调控的 G- 四链体结构变化十分敏感， 伴有颜色的改变， 同时在紫外吸收光谱中展现出明显的变化 ； 0038 3) 本发明所设计的探针， 只需要紫外吸收光谱仪， 测试成本低廉， 便于行业内推广 应用 ； 0039 4) 本发明所用试剂成分只有 4 5 种， 只需按比例混合就可检测， 操作简单、 快捷 且成本低廉， 该体系在缓冲液环境中操作， 环保无污染 ； 0040 5) 本发明所用试剂成分简单、 种类少， 相互之间不会产生影响， 且稳定性好， 可长 时间储存， 能很好保证应用测试效果 ； 0041 6) 应用本发明提供的检测方法可以用来测定人体和其它动物体内钠离子的。

22、含量， 也可用来检测水质等其他样本中的钠离子水平。 附图说明 0042 图1为标准溶液样本中钾离子浓度为10mmol/L时， 钠离子浓度与吸光强度值的标 准曲线。 0043 图 2 为标准溶液样本中钾离子浓度为 7mmol/L 时， 钠离子浓度与吸光强度值的标 准曲线。 0044 图 3 为标准溶液样本中钾离子浓度为 3mmol/L 时， 钠离子浓度与吸光强度值的标 准曲线。 0045 图4为标准溶液样本中钾离子浓度为15mmol/L时， 钠离子浓度与吸光强度值的标 说 明 书 CN 104458728 A 6 4/9 页 7 准曲线。 0046 图 5 为标准溶液样本中钾离子浓度为 3mmo。

23、l/L 时， 钠离子浓度与吸光强度值的标 准曲线。 0047 图 6 为标准溶液样本中钾离子浓度为 8mmol/L 时， 钠离子浓度与吸光强度值的标 准曲线。 具体实施方式 0048 下面通过具体实施例对本发明进行说明， 但本发明并不局限于此。 0049 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法 ； 下述实施例中所 用的试剂、 生物材料等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0050 下述实施例中用于测量吸光值的仪器为安捷伦 - 可见光谱仪 (Agilent 8453UV-visible spectrophotometer) ； Hitachi F4500spectrofl。

24、uorometer(Japan)。 能够 形成 G- 四链体的 DNA 均购自上海生工生物技术有限公司。 0051 实施例 1 0052 对两个尿液样本的钠离子浓度进行验证， 各尿液样本的实际钠离子浓度如下 ： 尿 样 1 为 148.3mmol/L、 尿样 2 为 31.3mmol/L。在本实施例中使用的能够形成 G- 四链体的 DNA 为 AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG( 核苷酸序列如序列表中序列 2 所示 )。 0053 将 0.1molDNA 样品溶解于 1mL 不含金属离子的 Tris-HCl 缓冲液 (pH7.4) 中， 制 备浓度为 100mol/L 的 DNA 母。

25、液， 用于 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶的配制。 0054 (1) 配制标准溶液 DNA 酶 0055 用 28.5L 含有 12.4mmol/L 钾离子的 Tris-HCl 缓冲溶液溶解可溶性钠盐配制 多个浓度梯度的钠离子溶液， 分别向每个浓度梯度的钠离子溶液中加入 1.5L 100mol/ L 的 DNA 母液， 反应 0.1-3 小时， 得到一系列构型不同的 DNA G- 四链体的体系， 分别向所述 DNA G-四链体的体系中的每一个中加入20L的10mol/L的氯化血红素溶液， 反应0.1-3 小时， 得到 50L 一系列含 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶的体系 。

26、； 0056 (2) 配制待测溶液 DNA 酶 0057 将 17.5L 尿样 1 加入到 11L 含有 12.4mmol/L 钾离子 Tris-HCl 缓冲溶液中， 向得到的溶液中加入和步骤 (1) 相同量的 DNA， 反应 0.1-3 小时， 得到 DNA G- 四链体的体 系， 向该体系中加入和步骤 (1) 相同量的氯化血红素， 反应 0.1-3 小时， 得到 50L 待测溶 液 DNA 酶体系 ； 0058 (3) 标准溶液和待测溶液的配制 0059 取 225L 105mmol/L 的 2,2 - 联氨 - 双 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 ) 二胺盐 (ABTS) 加入 3。

27、375L Tris-HCl( 含有 12.4mmol/L K+)， 平均分到 9 个管里， 每份 400L， 在 每份中随后加入 50L 9mmol/L 的 H2O2， 形成显色底物。将步骤 (1) 和步骤 (2) 的 50L 含 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶加入上述显色底物， 反应 10 分钟， 得到标准溶液样本和待测 溶液。( 其中， 标准溶液样本钠离子浓度分别为 0、 2、 4、 6、 8、 10、 15mmol/L， 标准溶液样本和 待测溶液中， DNA 分子的浓度均为 0.3mol/L， 氯化血红素的浓度均为 0.4mol/L) 0060 (4) 标准曲线的制备 0061。

28、 测量标准溶液样本在 420nm 处的吸光度， 绘制钠离子浓度与吸光强度值的标准曲 说 明 书 CN 104458728 A 7 5/9 页 8 线， 如图 1。 0062 (5) 待测样本检测 0063 测试溶液在 420nm 处的吸光度在标准曲线上找到对应的钠离子浓度， 将测得的吸 光度与步骤 (4) 中得到的标准溶液样本的吸光度进行比较， 结合尿液 1 的稀释比例 ( 待测 样本溶液中尿液1占3.5)， 计算出尿液1中的钠离子浓度为145.2mmol/L， 与尿样1中钠 离子的实际浓度(148.3mmol/L)吻合， 得到尿液2中的钠离子浓度为32.6mmol/Lmmol/L， 与 尿样。

29、 2 中钠离子的实际浓度 (31.3mmol/L) 吻合。 0064 实施例 2 0065 对两个尿液样本的钠离子浓度进行验证， 各尿液样本的实际钠离子浓度如下 ： 尿 样 3 为 65.0mmol/L、 尿样 4 为 47.9mmol/L。在本实施例中使用的能够形成 G- 四链体的 DNA 为 GGGCCAGGGAGCGGGGCGGAGGGGG( 核苷酸序列如序列表中序列 1 所示 )。 0066 将 0.1molDNA 样品溶解于 1mL 磷酸二氢钾 - 磷酸氢二钾缓冲液 (pH 7.0) 中， 制 备浓度为 100mol/L 的 DNA 母液， 用于 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA。

30、 酶的配制。 0067 (1) 配制标准溶液 DNA 酶 0068 用 29.5L 含有 8.6mmol/L 钾离子的磷酸二氢钾 - 磷酸氢二钾缓冲溶液溶解 可溶性钠盐配制多个浓度梯度的钠离子溶液， 分别向每个浓度梯度的钠离子溶液中加入 0.5L100mol/L 的 DNA 母液， 反应 0.1-3 小时， 得到一系列构型不同的 DNA G- 四链体的 体系 ； 分别向所述DNA G-四链体的体系中的每一个中加入20L的12mol/L的氯化血红 素溶液， 反应 0.1-3 小时， 得到一系列含 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶的体系 ； 0069 (2) 配制待测溶液的 DNA 酶 0。

31、070 将 20L 尿样 3 加入到 9.5L 含有 8.6mmol/L 钾离子的磷酸二氢钾 - 磷酸氢二 钾缓冲溶液中， 向得到的溶液中加入和步骤 (1) 相同量的 DNA， 反应 0.1-3 小时， 得到 DNA G- 四链体的体系， 向该体系中加入和步骤 (1) 相同量的氯化血红素， 反应 0.1-3 小时， 得到 待测溶液 DNA 酶体系 ； 0071 (3) 标准溶液和待测溶液的配制 0072 取 225L 92mmol/L 的 2,2 - 联氨 - 双 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 ) 二胺盐 (ABTS) 加入 3375L 磷酸二氢钾 - 磷酸氢二钾缓冲溶液 ( 含有 8。

32、.6mmol/L K+)， 平均分到 9 个管里， 每份 400L， 在每份中随后加入 50L 13mmol/L 的 H2O2，形成显色底物。将步骤 (1) 和步骤 (2) 的 50L 含 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶加入上述显色底物， 反应 10 分 钟， 得到标准溶液样本和待测溶液。( 其中， 标准溶液样本中钠离子浓度分别为 0、 2、 4、 6、 8、 10、 15mmol/L， 标准溶液样本和待测溶液中 DNA 分子的浓度均为 0.1mol/L、 氯化血红素的 浓度均为 0.48mol/L) 0073 (4) 标准曲线的制备 0074 测量标准溶液样本在 420nm 处的吸。

33、光度， 绘制钠离子浓度与吸光强度值的标准曲 线， 如图 1。 0075 (5) 待测样本检测 0076 测试溶液在 420nm 处的吸光度在标准曲线上找到对应的钠离子浓度， 将测得的吸 光度与步骤 (4) 中得到的标准溶液样本的吸光度进行比较， 结合尿液 3 的稀释比例 ( 待测 样本溶液中尿液 3 占 4 )， 计算出尿液 3 中的钠离子浓度为 63.2mmol/L， 与尿样 3 中钠离 说 明 书 CN 104458728 A 8 6/9 页 9 子的实际浓度 (65.0mmol/L) 吻合， 得到尿液 4 中的钠离子浓度为 48.9mmol/Lmmol/L， 与尿 样 4 中钠离子的实际。

34、浓度 (47.9mmol/L) 吻合。 0077 实施例 3 0078 对两个尿液样本的钠离子浓度进行验证， 各尿液样本的实际钠离子浓度如下 ： 尿 样 5 为 142.7mmol/L、 尿样 6 为 106.5mmol/L。在本实施例中使用的能够形成 G- 四链体的 DNA 为 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG( 核苷酸序列如序列表中序列 3 所示 )。 0079 将 0.1molDNA 样品溶解于 1mL 不含金属离子的 Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.0) 中， 制备浓度为 100mol/L 的 DNA 母液， 用于 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶的配制。。

35、 0080 (1) 配制标准溶液的 DNA 酶 0081 用 25.5L 含有 3.7mmol/L 钾离子的三乙醇胺 -HCl 缓冲溶液 (pH 6.8) 溶解可溶 性钠盐配制多个浓度梯度的钠离子溶液， 分别向每个浓度梯度的钠离子溶液中加入 4.5L 100mol/L 的 DNA 母液， 反应 0.1-3 小时， 得到一系列构型不同的 DNA G- 四链体的体系 ； 分别向所述 DNA G- 四链体的体系中的每一个中加入 20L 的 15mol/L 的氯化血红素溶 液， 反应 0.1-3 小时， 得到一系列含 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶的体系 ； 0082 (2) 配制待测溶液的。

36、 DNA 酶 0083 将 17.5L 尿样 5 加入到 8L 含有 3.7mmol/L 钾离子的三乙醇胺 -HCl 缓冲溶液 (pH6.8)中， 向得到的溶液中加入和步骤(1)相同量的DNA， 反应0.1-3小时， 得到DNA G-四 链体的体系 ； 向所述DNA G-四链体的体系加入和步骤(1)相同量的氯化血红素， 反应0.1-3 小时， 得到 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶体系 ； 0084 (3) 标准溶液和待测溶液的配制 0085 取 225L 110mmol/L 的 2,2 - 联氨 - 双 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 ) 二胺盐 (ABTS) 加入 3375L。

37、 三乙醇胺 -HCl 缓冲液 ( 含有 3.7mmol/L K+)， 平均分到 9 个管里， 每 份 400L， 在每份中随后加入 50L 27mmol/L 的 H2O2， 形成显色底物。将步骤 (1) 和步骤 (2) 的 50L 含 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶加入上述显色底物， 反应 13 分钟， 得到标准 溶液样本和待测溶液。( 其中， 标准溶液样本中钠离子浓度分别为 0、 2、 4、 6、 8、 10、 15mmol/ L， 标准溶液样本和待测溶液中 DNA 分子的浓度均为 0.9mol/L， 氯化血红素的浓度均为 0.6mol/L) 0086 (4) 标准曲线的制备 00。

38、87 测量标准溶液样本在 420nm 处的吸光度， 绘制钠离子浓度与吸光强度值的标准曲 线， 如图 3。 0088 (5) 待测样本检测 0089 测试溶液在 420nm 处的吸光度在标准曲线上找到对应的钠离子浓度， 将测得的吸 光度与步骤 (4) 中得到的标准溶液样本的吸光度进行比较， 结合尿液 5 的稀释比例 ( 待测 样本溶液中尿液5占3.5)， 计算出尿液5中的钠离子浓度为144.2mmol/L， 与尿样5中钠 离子的实际浓度 (142.7mmol/L) 吻合， 得到尿液 6 中的钠离子浓度为 102.9mmol/L， 与尿样 6 中钠离子的实际浓度 (106.5mmol/L) 吻合。。

39、 0090 实施例 4 0091 对两个血清样本的钠离子浓度进行验证， 各血清样本的实际钠离子浓度如下 ： 血 清样 1 为 128.3mmol/L、 血清样 2 为 132.7mmol/L。在本实施例中使用的能够形成 G- 四链 说 明 书 CN 104458728 A 9 7/9 页 10 体的 DNA 为 AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG( 核苷酸序列如序列表中序列 2 所示 )。 0092 将 0.1molDNA 样品溶解于 1mL 不含金属离子的 Tris-HCl 缓冲液 (pH8.2) 中， 制 备浓度为 100mol/L 的 DNA 母液， 用于 G- 四链体 - 氯。

40、化血红素 DNA 酶的配制。 0093 (1) 配制标准溶液的 DNA 酶 0094 用 26.5L 含有 18.7mmol/L 钾离子的咪唑 - 盐酸缓冲液 (pH 6.8) 溶解可 溶性钠盐配制多个浓度梯度的钠离子溶液， 分别向每个浓度梯度的钠离子溶液中加入 3.5L100mol/L 的 DNA 母液， 反应 0.1-3 小时， 得到一系列构型不同的 DNA G- 四链体的 体系 ； 分别向所述 DNA G- 四链体的体系中的每一个中加入 20L 的 8mol/L 的氯化血红 素溶液， 反应 0.1-3 小时， 得到一系列含 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶的体系 ； 0095 (。

41、2) 配制待测溶液的 DNA 酶 0096 将 22.5L 血清样 1 加入到 4L 含 18.7mmol/L 钾离子的咪唑 - 盐酸缓冲液 (pH 6.8) 中， 向得到的溶液中加入和步骤 (1) 相同量的 DNA， 反应 0.1-3 小时， 得到 DNA G- 四链 体的体系 ； 向所述 DNA G- 四链体的体系加入和步骤 (1) 相同量的氯化血红素， 反应 0.1-3 小时， 得到 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶体系 ； 0097 (3) 标准溶液和待测溶液的配制 0098 取 225L 74mmol/L 的 2,2 - 联氨 - 双 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 )。

42、 二胺 盐 (ABTS) 加入 3375L 咪唑 - 盐酸缓冲液 ( 含有 18.7mmol/L K+)， 平均分到 9 个管里， 每 份 400L， 在每份中随后加入 50L 16mmol/L 的 H2O2， 形成显色底物。将步骤 (1) 和步骤 (2) 的 50L 含 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶加入上述显色底物， 反应 5 分钟， 得到标准 溶液样本和待测溶液。( 其中， 标准溶液样本中钠离子浓度分别为 0、 2、 4、 6、 8、 10、 15mmol/ L， 标准溶液样本和待测溶液中 DNA 分子的浓度均为 0.7mol/L、 氯化血红素的浓度均为 0.32mol/L) 。

43、0099 (4) 标准曲线的制备 0100 测量标准溶液样本在 420nm 处的吸光度， 绘制钠离子浓度与吸光强度值的标准曲 线， 如图 4。 0101 (5) 待测样本检测 0102 测试溶液在 420nm 处的吸光度在标准曲线上找到对应的钠离子浓度， 将测得的吸 光度与步骤 (4) 中得到的标准溶液样本的吸光度进行比较， 结合血清 1 的稀释比例结合 血清 1 的稀释比例 ( 待测样本溶液中血清 1 占 4.5 )， 计算出血清 1 中的钠离子浓度为 134.2mmol/L， 与血清 1 中钠离子的实际浓度 (128.3mmol/L) 吻合， 得到血清 2 中的钠离子 浓度为 130.6m。

44、mol/L， 与血清 2 中钠离子的实际浓度 (132.7mmol/L) 吻合。 0103 实施例 5 0104 对两个血清样本的钠离子浓度进行验证， 各血清样本的实际钠离子浓度如下 ： 血 清样 3 为 106.5mmol/L、 血清样 4 为 144.8mmol/L。在本实施例中使用的能够形成 G- 四链 体的 DNA 为 GGGCCAGGGAGCGGGGCGGAGGGGG( 核苷酸序列如序列表中序列 1 所示 )。 0105 将 0.1molDNA 样品溶解于 1mL 不含金属离子的 Tris-HCl 缓冲液 (pH7.4) 中， 制 备浓度为 100mol/L 的 DNA 母液， 用于。

45、 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶的配制。 0106 (1) 配制标准溶液的 DNA 酶 0107 用 28L 含有 5mmol/L 钾离子的双甘氨肽缓冲液配制多个浓度梯度的钠离子溶 说 明 书 CN 104458728 A 10 8/9 页 11 液， 分别向每个浓度梯度的钠离子溶液中加入 2L 100mol/L 的 DNA 母液， 反应 0.1-3 小 时， 得到一系列构型不同的DNA G-四链体的体系 ； 分别向所述DNA G-四链体的体系中的每 一个中加入 20L 的 20mol/L 的氯化血红素溶液， 反应 0.1-3 小时， 得到一系列含 G- 四 链体 - 氯化血红素 D。

46、NA 酶的体系 ； 0108 (2) 配制待测溶液的 DNA 酶 0109 将 7.5L 血清样 3 加入到 20.5L 含有 5mmol/L 钾离子的双甘氨肽缓冲液中， 向 得到的溶液中加入和步骤 (1) 相同量的 DNA， 反应 0.1-3 小时， 得到 DNA G- 四链体的体系 ； 向所述 DNA G- 四链体的体系加入和步骤 (1) 相同量的氯化血红素， 反应 0.1-3 小时， 以形 成 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶体系 ； 0110 (3) 标准溶液和待测溶液的配制 0111 取 225L 132mmol/L 的 2,2 - 联氨 - 双 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6。

47、- 磺酸 ) 二胺盐 (ABTS)加入3375L双甘氨肽缓冲液(含有5mmol/L K+)， 平均分到9个管里， 每份400L， 在每份中随后加入50L 17mmol/L的H2O2，形成显色底物。 将步骤(1)和步骤(2)的50L 含 G- 四链体 - 氯化血红素 DNA 酶加入上述显色底物， 反应 7 分钟， 得到标准溶液样本和待 测溶液。( 其中， 标准溶液样本中钠离子浓度分别为 0、 2、 4、 6、 8、 10、 15mmol/L， 标准溶液样 本和待测溶液中 DNA 分子的浓度均为 0.4mol/L、 氯化血红素的浓度均为 0.8mol/L) 0112 (4) 标准曲线的制备 011。

48、3 测量标准溶液样本在 420nm 处的吸光度， 绘制钠离子浓度与吸光强度值的标准曲 线， 如图 5。 0114 (5) 待测样本检测 0115 测试溶液在 420nm 处的吸光度在标准曲线上找到对应的钠离子浓度， 将测得的吸 光度与步骤 (4) 中得到的标准溶液样本的吸光度进行比较， 结合血清 3 的稀释比例 ( 待 测样本溶液中血清 3 占 1.5 ) 结合血清 3 的稀释比例， 计算出血清 3 中的钠离子浓度为 105.2mmol/L， 与血清 3 中钠离子的实际浓度 (106.5mmol/L) 吻合， 得到血清 4 中的钠离子 浓度为 143.8mmol/L， 与血清 4 中钠离子的实际浓度 (144.8mmol/L) 吻合。 0116 实施例 6 0117 对两个血清样本的钠离子浓度进行验证， 各血清样本的实际钠离子浓度如下 ： 血 清样 5 为 132.7mmol/L、 血清样 6 为 126.5mmol/L。在本实施例中使用的能够形成 G- 四链 体的 DNA 为 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG( 核苷酸序列如序列表中序列 3 所示 )。 0118 将 0.1molDNA 样品溶解于 1mL 不含金属离子的 Tris-。