一种筛选血管内皮生长因子1激酶抑制剂高通量筛选方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201310421211.8 (22)申请日 2013.09.12 G01N 21/64(2006.01) (71)申请人中国药科大学地址 211200 江苏省南京市溧水县永阳镇天生桥大道 688 号科创中心 (72)发明人严明张陆勇胡洁高鹏 (54) 发明名称一种筛选血管内皮生长因子 1 激酶抑制剂高通量筛选方法 (57) 摘要本发明发现了一种筛选血管内皮生长因子 1 激酶抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤： (1) 血管内皮生长因子 1 激酶抑制剂筛选模型的建立与优化：进行激酶浓度、温孵时间、底物浓度。

2、、 ATP 浓度实验； (2) 阳性药验证模型可靠性：选用合适浓度的激酶， ATP Km，底物 Km，激酶和底物每孔分别加入 2l，再按浓度梯度每孔加入 4l 阳性药，加入 2ul ATP 反应，按优化时间室温孵育；每孔加入10l终止液终止反应，室温孵育1小时后检测，分析得阳性药 IC50； (3) 高通量筛选模型验证：按照上述步骤操作，使用Biomek NXP自动化加样仪器和Multidrop自动分液器进行加样，计算Z 因子。本发明的优点主要有： 1) 简便快捷； 2) 灵敏度高； 3) 结果稳定可靠，重现性好，可用于高通量筛选。。

3、(51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图4页 (10)申请公布号 CN 104458674 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104458674 A 1/1 页 2 1. 一种血管内皮生长因子 1 激酶抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤： (1) 激酶抑制剂筛选模型的建立与优化； (2) 阳性药验证模型可靠性； (3) 高通量筛选模型验证。 2. 如权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述的激酶为血管内皮生长因子 1 激酶。 3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1。

4、)中进行血管内皮生长因子1激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、 ATP 浓度实验。 4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，由步骤(1)可得到最佳反应所需的血管内皮生长因子 1 激酶浓度为 0.2ng l，最佳温孵时间为 60min，最佳底物浓度为 148.8nM，最佳 ATP 浓度为 1.1M。 5. 如权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤 (2) 选用步骤 (1) 所到的合适浓度的激酶， ATP Km，底物 Km ；将激酶和底物按 1 ： 2 体积混合，每孔加入 4l，再按浓度梯度每孔加入 4l 阳性药，最后每孔加入 2l ATP 开始反应，按优。

5、化时间室温孵育；配制 SA-XL665 和 TK-Ab，将 SA-XL665 和 TK Ab 按体积比 1 ： 1 混合，每孔加入 10l 终止反应，室温孵育 1 小时后检测，分析数据得阳性药半数抑制率 IC50为 14.18nM。 6. 权利要求 1-5 中所述任一方法在筛选血管内皮生长因子 1 激酶抑制剂的应用。权利要求书 CN 104458674 A 2 1/3 页 3 一种筛选血管内皮生长因子 1 激酶抑制剂高通量筛选方法技术领域 0001 本发明属于药理学领域，利用均相时间分辨荧光检测技术，构建了血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶 (VEGFR) 抑制剂的高。

6、通量筛选模型，用于待测样品对 VEGFR 激酶抑制活性的高通量检测。背景技术 0002 VEGFR家族主要包括VEGFR-1(Flt-1)、 VEGFR-2(Flk-1KDR)、 VEGFR-3(Flt-4)三个成员，属于受体型酪氨酸激酶 (receptor tyrosine kinases， RTKs)，由 3 部分组成，包括胞外的 7 个免疫球蛋白样结构域、跨膜区和胞内的酪氨酸激酶活性区。VEGFR-1 是 VEGF-A、 VEGF-B 和 PIGF 的高亲和性受体，存在于血管内皮细胞、造血干细胞、巨噬细胞和单核细胞表面，与这些细胞的迁移有关。受体或相应配体的过。

7、量表达，会通过多条路径、多种机制激活细胞内信号转导，信号蛋白进入细胞核激活转录因子，导致细胞增殖失调、凋亡抑制、血管生成、细胞侵袭和转移等，进而导致肿瘤和其他相关疾病的发生。VEGFR 酪氨酸激酶抑制剂作用于 VEGFR 信号转导过程的最上游，能阻断多条通路，具有治疗范围广、疗效高和不易耐药等优点。因此，研究 VEGFR 激酶抑制剂具有重大意义。 0003 时间分辨荧光技术 (time-resolved fluorescence， TRF) 是基于镧系元素如铕 (Eu)、钐 (Sm)、镝 (Dy) 等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之。

8、间距离小于 10nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨荧光 (homogeneous time-resolved fluorescence， HTRF) 技术是法国 Cisbio 公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短 ( 一般为几毫秒 )，为了避免短暂的荧光干扰， Cisbio 公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白 (allophycocyanin) 或荧光素修饰，供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间。

9、成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。 0004 目前，已有多种 VEGFR1 激酶抑制剂的筛选方法，多利用 ELISA 法来筛选 VEGFR1 激酶抑制剂，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。发明内容 0005 本发明的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的 VEGFR1 激酶抑制剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。 0006 本发明的技术方案：采用均相时间分辨荧光方法建立体外 VEGFR。

10、1 激酶抑制剂高通量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制 VEGFR1 激酶活性的候选化合物。具体步骤如下： 0007 本发明利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种 VEGFR1 激酶抑制剂高通量筛选说明书 CN 104458674 A 3 2/3 页 4 模型。 0008 步骤一： VEGFR1 激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。 0009 步骤二：阳性药验证模型可靠性。 0010 步骤三：高通量筛选模型验证。附图说明： 0011 图 1 ： VEGFR1 激酶浓度梯度优化实验结果。 0012 图 2 ： VEGFR1 激酶温孵时间优化实验结果。 0013 图 3 。

11、： VEGFR1 激酶底物浓度优化实验结果。 0014 图 4 ： VEGFR1 激酶 ATP 浓度优化实验结果。 0015 图 5 ：阳性药十字孢碱对 VEGFR1 激酶的抑制曲线图。 0016 图 6 ： VEGFR1 激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。 0017 图 7 ：高通量筛选 Z值分布。具体实施方式 0018 以下结合附图说明本发明的具体实施方式： 0019 1.VEGFR1 激酶抑制剂筛选方法建立 0020 (1) 实验材料 0021 VEGFR1 激酶检测试剂盒 (Cisbio，法国 )、 VEGFR1 激酶 (Invitrogen，美国 )、 ATP( 生兴。

12、，中国 )、十字孢碱 ( 碧云天，中国 )、 384 低体积白板 (Corning，美国 )、枪头 (Axygen，美国 )。 0022 (2) 实验步骤 0023 1) 进行 VEGFR1 激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、 ATP 浓度实验，见图 1-4。 0024 2) 待测化合物精确称量，加入 DMSO 溶剂成母液，然后使用检测缓冲液配制待测化合物溶液至所需浓度，初筛浓度约为 110-3mol L。 0025 3)在反应容器中每孔加入VEGFR1激酶溶液2l，底物溶液2l，缓冲液或待筛化合物 4l， ATP2l。室温反应 1 小时。 0026 4) 每孔。

13、加入 Estradiol-XL665 5l， Anti-Estradiol-cryptate 5l，室温孵育 1 小时。 0027 5) 利用美国贝克曼库尔特 (Beckman Coulter) 公司检测平台 HTRF 模块分别检测 665nm 和 610nm 处的荧光强度。 0028 6) 绘制阳性药十字孢碱量效曲线并测定其 IC50值，见图 5。 0029 7) 采集检测信号并绘图，通过信号窗和 Z 值确定高通量筛选模型的可靠性，见图 6， 7。 0030 2. 数据处理 0031 (1) 根据公式计算各孔 665nm 和 610nm 处荧光强度的比值 (Ratio665 610)。

14、； 0032 (2) 根据公式计算各孔的相对抑制率 0033 说明书 CN 104458674 A 4 3/3 页 5 0034 (3) 活性样品进行浓度稀释后检测的相对抑制率值，使用作 Graphpad 软件作图求算半数抑制率 IC50。 0035 实验结果 0036 VEGFR1 激酶筛选模型优化结果：最佳反应所需的 VEGFR1 激酶为 0.2ng l( 见图1)，最佳温孵时间为60min(见图2)，最佳底物浓度为148.8nM(见图3)，最佳ATP浓度为 1.1M( 见图 4)。阳性药半数抑制率 IC50为 14.18nM( 见图 5)，并通过信噪比和 Z 值 ( 见图6， 7)验证表明采用本方法建立的VEGFR1激酶抑制剂体外筛选模型达到了高通量筛选的要求，实验结果稳定可靠，可以用于进行 VEGFR1 激酶抑制剂的高通量筛选。说明书 CN 104458674 A 5 1/4 页 6 图 1 图 2 说明书附图 CN 104458674 A 6 2/4 页 7 图 3 图 4 说明书附图 CN 104458674 A 7 3/4 页 8 图 5 图 6 说明书附图 CN 104458674 A 8 4/4 页 9 图 7 说明书附图 CN 104458674 A 9 。

摘要
申请专利号：	CN201310421211.8	申请日：	2013.09.12
公开号：	CN104458674A	公开日：	2015.03.25
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 21/64申请公布日:20150325\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N21/64申请日:20130912\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N21/64	主分类号：	G01N21/64
申请人：	中国药科大学
发明人：	严明; 张陆勇; 胡洁; 高鹏
地址：	211200江苏省南京市溧水县永阳镇天生桥大道688号科创中心
优先权：
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内容摘要

本发明发现了一种筛选血管内皮生长因子1激酶抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)血管内皮生长因子1激酶抑制剂筛选模型的建立与优化：进行激酶浓度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验；(2)阳性药验证模型可靠性：选用合适浓度的激酶，ATP Km，底物Km，激酶和底物每孔分别加入2μl，再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药，加入2ul ATP反应，按优化时间室温孵育；每孔加入10μl终止液终止反应，室温孵育1小时后检测，分析得阳性药IC50；(3)高通量筛选模型验证：按照上述步骤操作，使用Biomek NXP自动化加样仪器和Multidrop自动分液器进行加样，计算Z因子。本发明的优点主要有：1)简便快捷；2)灵敏度高；3)结果稳定可靠，重现性好，可用于高通量筛选。

权利要求书

1.  一种血管内皮生长因子1激酶抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤：
(1)激酶抑制剂筛选模型的建立与优化；
(2)阳性药验证模型可靠性；
(3)高通量筛选模型验证。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激酶为血管内皮生长因子1激酶。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中进行血管内皮生长因子1激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验。

4.  如权利要求3所述的方法，其特征在于，由步骤(1)可得到最佳反应所需的血管内皮生长因子1激酶浓度为0.2ng／μl，最佳温孵时间为60min，最佳底物浓度为148.8nM，最佳ATP浓度为1.1μM。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)选用步骤(1)所到的合适浓度的激酶，ATP Km，底物Km；将激酶和底物按1：2体积混合，每孔加入4μl，再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药，最后每孔加入2μl ATP开始反应，按优化时间室温孵育；配制SA-XL665和TK-Ab，将SA-XL665和TK Ab按体积比1：1混合，每孔加入10μl终止反应，室温孵育1小时后检测，分析数据得阳性药半数抑制率IC₅₀为14.18nM。

6.  权利要求1-5中所述任一方法在筛选血管内皮生长因子1激酶抑制剂的应用。

说明书

一种筛选血管内皮生长因子1激酶抑制剂高通量筛选方法
技术领域
本发明属于药理学领域，利用均相时间分辨荧光检测技术，构建了血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶(VEGFR)抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对VEGFR激酶抑制活性的高通量检测。
背景技术
VEGFR家族主要包括VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1／KDR)、VEGFR-3(Flt-4)三个成员，属于受体型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)，由3部分组成，包括胞外的7个免疫球蛋白样结构域、跨膜区和胞内的酪氨酸激酶活性区。VEGFR-1是VEGF-A、VEGF-B和PIGF的高亲和性受体，存在于血管内皮细胞、造血干细胞、巨噬细胞和单核细胞表面，与这些细胞的迁移有关。受体或相应配体的过量表达，会通过多条路径、多种机制激活细胞内信号转导，信号蛋白进入细胞核激活转录因子，导致细胞增殖失调、凋亡抑制、血管生成、细胞侵袭和转移等，进而导致肿瘤和其他相关疾病的发生。VEGFR酪氨酸激酶抑制剂作用于VEGFR信号转导过程的最上游，能阻断多条通路，具有治疗范围广、疗效高和不易耐药等优点。因此，研究VEGFR激酶抑制剂具有重大意义。
时间分辨荧光技术(time-resolved fluorescence，TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒)，为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰，供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。
目前，已有多种VEGFR1激酶抑制剂的筛选方法，多利用ELISA法来筛选VEGFR1激酶抑制剂，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。
发明内容
本发明的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的VEGFR1激酶抑制剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
本发明的技术方案：采用均相时间分辨荧光方法建立体外VEGFR1激酶抑制剂高通量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制VEGFR1激酶活性的候选化合物。具体步骤如下：
本发明利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种VEGFR1激酶抑制剂高通量筛选模型。
步骤一：VEGFR1激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。
步骤二：阳性药验证模型可靠性。
步骤三：高通量筛选模型验证。
附图说明：
图1：VEGFR1激酶浓度梯度优化实验结果。
图2：VEGFR1激酶温孵时间优化实验结果。
图3：VEGFR1激酶底物浓度优化实验结果。
图4：VEGFR1激酶ATP浓度优化实验结果。
图5：阳性药十字孢碱对VEGFR1激酶的抑制曲线图。
图6：VEGFR1激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。
图7：高通量筛选Z′值分布。
具体实施方式
以下结合附图说明本发明的具体实施方式：
1.VEGFR1激酶抑制剂筛选方法建立
(1)实验材料
VEGFR1激酶检测试剂盒(Cisbio，法国)、VEGFR1激酶(Invitrogen，美国)、ATP(生兴，中国)、十字孢碱(碧云天，中国)、384低体积白板(Corning，美国)、枪头(Axygen，美国)。
(2)实验步骤
1)进行VEGFR1激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验，见图1-4。
2)待测化合物精确称量，加入DMSO溶剂成母液，然后使用检测缓冲液配制待测化合物溶液至所需浓度，初筛浓度约为1×10^-3mol／L。
3)在反应容器中每孔加入VEGFR1激酶溶液2μl，底物溶液2μl，缓冲液或待筛化合物4μl，ATP2μl。室温反应1小时。
4)每孔加入Estradiol-XL665 5μl，Anti-Estradiol-cryptate 5μl，室温孵育1小时。
5)利用美国贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司检测平台HTRF模块分别检测665nm和610nm处的荧光强度。
6)绘制阳性药十字孢碱量效曲线并测定其IC₅₀值，见图5。
7)采集检测信号并绘图，通过信号窗和Z’值确定高通量筛选模型的可靠性，见图6，7。
2.数据处理
(1)根据公式计算各孔665nm和610nm处荧光强度的比值(Ratio665／610)；
(2)根据公式计算各孔的相对抑制率

(3)活性样品进行浓度稀释后检测的相对抑制率值，使用作Graphpad软件作图求算半数抑制率IC₅₀。
实验结果
VEGFR1激酶筛选模型优化结果：最佳反应所需的VEGFR1激酶为0.2ng／μl(见图1)，最佳温孵时间为60min(见图2)，最佳底物浓度为148.8nM(见图3)，最佳ATP浓度为1.1μM(见图4)。阳性药半数抑制率IC₅₀为14.18nM(见图5)，并通过信噪比和Z’值(见图6，7)验证表明采用本方法建立的VEGFR1激酶抑制剂体外筛选模型达到了高通量筛选的要求，实验结果稳定可靠，可以用于进行VEGFR1激酶抑制剂的高通量筛选。