本发明涉及一种能以高产率制备玫瑰色红球菌（Rhodococcus rhodochrous）的微生物细胞的方法，其中所述的菌种具有较高的腈水解酶活性。 最近几年，人们不断地尝试用固定化状态的微生物和酶作为催化剂，从而进行单一或复杂的化学反应。
Hideaki Yamada（本发明发明人之一）等人已经发现，可以用腈水解酶作为使腈水解的酶以产生相应的酰胺（参考文献：Agric.Biol.Chem.46：1165，1982）。作为利用这种酶的一个例子，已经提出了这样的方法，在具有腈水解酶的细菌的存在下由腈类制备酰胺（参考文献：日本专利公开37951/1984，美国专利4637982）。
此外，我们已经提出了一种制备酰胺，特别是适于由芳香腈制备酰胺的方法。（参考文献：日本专利申请231744/1988号和美国专利申请243986号）。在这种情况下，一种能以高产率制备具有较高的腈水解酶活性的玫瑰色红球菌细胞的方法将是非常有利的。
本发明的一个目的是通过在该细菌的培养过程中向培养基加入特定物质，即尿素或其特定衍生物以及钴离子来解决上述问题。
因此，根据本发明，培养具有高腈水解酶活性的玫瑰色红球菌细菌的方法包括：在培养能产生腈水解酶的玫瑰色红球菌以制备具有腈水解酶活性地细菌过程中，向培养基中加入至少一种具有下列分子式[Ⅰ]至[Ⅲ]的尿素及尿素衍生物以及钴离子：
R1R2NCONR3R4[Ⅰ]
其中，R1、R2、R3、R4为-H、-CH3或-C2H5，所有取代基不能全是-H;
R5R6NCOOC2H5[Ⅱ]
其中，R5、R6为-H、-CH3或-C2H5;以及
NH2CSNH2[Ⅲ]
在玫瑰色红球菌的培养过程中，向培养基加入至少一种具有分子式[Ⅰ]～[Ⅲ]的尿素和特定的尿素衍生物以及钴离子，能显著地增加单位培养液中的腈水解酶活性。
单位培养液中的腈水解酶活性的提高可能是由于细胞浓度（即产量）和/或细胞活性（即细胞中腈水解酶的质量）的增加而引起的。
在本发明中，加入尿素或其衍生物及钴离子对于提高细胞活性是特别有效的。
Ⅰ、玫瑰色红球菌
本发明中所用的细菌是玫瑰色红球菌，它具腈水解酶活性并能使腈，特别是双芳香腈水解而产生相应的酰胺。这种细菌的一个特例为玫瑰色红球菌J-1菌株（FERM BP-1478），该细菌公布于前面所述的日本专利申请231744/1988和美国专利申请243986中，这些专利申请中给出了下述有关菌株J-1的详细情况。
1、来源及保藏
菌株J-1是我们从日本京都Sakyo-ku的土壤中分离的，并根据布达佩斯条约于1987年9月18日保藏在日本发酵研究所（国际工贸部工业科技署），登记号为FERM BP-1478。
2、细菌特性
（a）形态特征：
（1）细胞的形状及大小：0.9-1.0μ×3-10μ
（2）多态性：培养初期为一种细长棒形细胞，以后长成为具有分支的直杆，然后分裂成短杆菌形态。
（3）游动性：不游动
（4）孢子形成：无
（5）颗粒染色：阳性
（6）酸饥饿性质：阴性
（7）异源粒细胞：可见
（b）在各种培养基中的培养特征（30℃）：
（1）肉汤琼脂平板培养：环形，直径为1mm（48小时），不规则，平滑，表面较干燥，平坦，不透明，浅桔红色。
（2）肉汤琼脂斜面培养：丝状，表面平滑，微微弯曲，横截面较干燥，浅桔红色。
（3）肉汤液体培养：大量生长，伴以膜的形成。当细胞生长时，培养液变得十分混乱，并有沉淀形成。
（4）肉汤凝胶穿刺培养：表面沿穿刺面以漏斗形状生长良好，但下表面生长不足，明胶未液化。
（5）石蕊汁：无变化。
（c）生理特性：
（1）硝酸盐还原 阳性
（2）脱氮作用 阴性
（3）MR试验 阴性
（4）VP试验 阴性
（5）吲哚形成 阳性
（6）硫化氢形成 阳性
（7）淀粉水解 阴性
（8）柠檬酸的利用
Kocur培养基 阴性
Christensen培养基 阳性
（9）无机氮源的利用
硝酸盐 阳性
铵盐 阳性
（10）色素的形成 阴性
（11）尿酶 阳性
（12）氧化酶 阴性
（13）触酶 阳性
（14）纤维素的水解 阴性
（15）生长范围 PH5-10
温度10-41℃
（16）对氧气的性能 需氧
（17）酪氨酸的分解 阳性
（18）腺苷的分解 阳性
（19）磷酸酶 阳性
（20）Tween80的水解 阳性
（21）O-F试验 O（固）
（22）耐热性（在10%脱脂乳中，72℃，15分钟）
无
（23）由糖形成酸和气体
酸 气体
L-阿拉伯糖 - -
D-木糖 - -
D-葡萄糖 + -
D-甘露糖 - -
D-果糖 + -
麦芽糖 + -
蔗糖 + -
乳糖 - -
海藻糖 - -
D-山梨醇 + -
甘露醇 + -
甘油 + -
（24）等单一碳源中的生长
肌醇 -
麦芽糖 +
甘露醇 +
鼠李糖 -
D-山梨醇 +
m-羟苯甲酸 +
乙二酸钠 +
苯甲酸钠 +
柠檬酸钠 +
乳酸钠 +
睾酮 +
L-酪氨酸 +
甘油（1%，W/V） （+）
海藻糖 （+）
对羟苯甲酸（1%，W/V） +
（十）：微阳性
（25）脂肪酸和细胞壁的分析：细胞中含有不饱和与饱和的直链脂肪酸以及结核硬脂酸。霉菌酸的薄层层析显示出单一色斑。
根据上面所列出的细菌特性和伯杰氏系统细菌学手册（1986），菌株J-1是一种需氧的、格兰氏阳性、微弱酸饥饿、触酶阳性及无芽饱形成的无鞭毛杆菌。该菌株在生长初期为细长杆菌形状及菌丝体，以后长出分枝，并分裂成短的杆菌形状。根据这些特性，菌株J-1被归入诺卡氏（Nocardia）型细菌。
对脂肪酸组成的分析揭示出，该细菌含有不饱和及饱和的直链脂肪酸，其中还包括结核硬脂酸。由于霉菌酸的薄层层析显示出单一色斑，该色斑与标准的玫瑰色红球菌（IFO 3338）具有相同的Rf值，故可以将该细菌与分枝菌属细菌区分开来。根据霉菌酸的组成（碳原子数），还可以将该细菌与诺卡氏细菌区分开来。
作为对其他的生化性能的研究结果，可以确认该细菌为玫瑰色红球菌。
Ⅱ、尿素及其衍生物
在本发明中，示于前面的分子式为[Ⅰ]-[Ⅲ]的尿素和尿素衍生物能起酶诱导物的作用，但是，在此之前我们只知道典型的酶诱导物是腈或酰胺，尤其是巴豆酰胺，而完全没有预见到尿素及其衍生物能有效地诱导腈水解酶。出乎人们意料的是，当尿素和其衍生物单独而不与其他酶诱导物结合使用时，它们具有比常用的酶诱导物高得多的效果。此外，由于尿素比其他酶诱导物价格低廉，因此，从经济上考虑可以将本发明的方法用于工业目的。
在本发明所用的尿素衍生物中，分子式[Ⅰ]的化合物例子有甲脲、乙脲、1，1-二甲脲和1，3-二甲脲。
分子式为[Ⅱ]的化合物的例子有尿烷和甲脲烷。
分子式为[Ⅲ]的化合物的例子有硫脲。
可以将尿素或其衍生物以批量形式一次加至培养基中或依次加入，这里所用的“依次”是指“连续”和“递增”。
Ⅲ钴离子
仅仅向培养基中加入尿素或其衍生物是不能获得腈水解酶的，本发明还必须向培养基中加入钴离子（钴离子的存在对于通过如前所述的日本专利申请231744/1988和美国专利申请243986中所定义的本发明的细菌来制备腈水解酶是必需的）。
为此，需通过向含水的培养基中加入水溶性钴化物，从而形成钴离子。水溶性钴化物如化学百科全书中所定义，因此，对于熟悉本领域的人员来说可以很容易地适当选择并使用这些化合物中的一种。
钴化合物的典型例子如那些能提供C++0或C+++0，特别是C++0的化合物，如氯化钴、硫酸钴、乙酸钴、溴化钴和硼酸钴。
另外，维生素B12和金属钴也能作为钴源。维生素B12中含有络合物形成的钴，通过高压釜处理可以使其离子化，而金属钴可以通过培养过程中的微生物氧化作用而离子化。
Ⅳ腈水解酶的培养/制备
除了将尿素或其衍生物和钴离子加入到培养介质中以外，本发明的玫瑰色红球菌可以在任何一种适于此目的的条件下培养。
例如，将预定量的尿素或其衍生物及钴离子加到下面所列的基本培养基中，培养条件为温度15-50℃，优选20℃-45℃，更优选30℃左右，PH为7-9，时间为30小时或更长，优选40小时或更长（直到例如120小时）。
尿素或其衍生物在培基中的总浓度为1-30g/l，2-20g/l优先，5-15g/l更优先，而钴离子的浓度以CoCl2计为5-15mg/l。
基本培养基
培养基A
组分 量（在1l介质中）
K2HPO413.4g
KH2PO46.5g
NaCl 1.0g
MgSO4·7H2O 0.2g
维生素混合物★0.1ml
蒸馏水 余量（pH7.0）
★组成（在1l溶液中）
生物素 2.0μg
泛酚钙 0.4mg
肌醇 2.0mg
烟酸 0.4mg
维生素B1盐酸盐 0.4mg
维生素Bb盐酸盐 0.4mg
对氨基苯甲酸 0.2ng
核黄素 0.2mg
叶酸 0.01ng
蒸馏水 余量
培养基B
K2HPO40.5g
KH2PO40.5g
MgSO4·7H2O 0.5g
酵母膏 3.0g
蒸馏水 余量（pH7.2）
培养基C
葡萄糖 10g
K2HPO40.5g
KH2PO40.5g
MgSO4.7H2O 0.5g
酵母膏 1.0g
胨 7.5g
蒸镏水 余量（PH7.2）
Ⅴ实验例子 酶活性的测定和定义
（1）腈水解酶活性的测定方法
腈水解酶活性按如下方法测定
2ml反应液中含在1.0ml苄腈（20mM），1.0ml3-氰基吡啶（1M）或1.0ml丙烯腈（1M）（作为底物）;0.5ml磷酸钾缓冲液（0.1M，PH7.0）;和预定量的细菌细胞（由培养液分离）在20℃下反应一段预定的时间，然后通过加入0.2ml1N HCl使反应终止。
（2）腈水解酶活性的定义
该活性按下列方法测定比活（S.A.）和总活性（T.A.）
S.A.：微摩尔产物酰胺/mg细胞/分钟
T.A.：微摩尔产物酰胺/ml培养基/分钟
实例1
将预定量的尿素加到含有10mg/lCoCL2的上述基本培养基C中。向60ml所得到的培养基中加入4ml玫瑰色红球菌J-1菌株（FERM BP-1478，用基本培养基C获得）的预培养液，并在28℃下进行振动培养96小时。
为了比较，可以类似地在仅含有尿素或CoCL2的基质中进行培养。
其结果概括于表1中。
由表中可以看出，同时加入尿素和CoCL2对于提高腈水解酶生产是必需的。
实例2
在10ml/lCoCL2存在下，使菌株J-1在上述基本培养基C中进行与实例1相似的培养，温度为28℃，时间为48-120小时，加入或不加入预定量的酶诱导物（尿素和巴豆酰胺），如表2中所示。
表2中所列的T.A.和S.A.值是在活性测定过程中T.A.值最大时获得的。
由该表可以明显看出，单独用尿素作为酶诱导物可以有效地提高腈水解酶的产量。
表1COCL2:（mg/l)脲(g/l)细胞浓度(mg/ml)苄腈氰基 吡啶丙烯腈T.A.S.A.T.A.S.A.T.A.S.A001010101010101007.502.05.07.51015204.615.535.285.175.034.994.724.263.960.110.111.0925.265.62101861911620.020.020.214.8713.042.139.444.940.90.751.003.7039.61625194715153630.160.180.707.6632.210499.712191.73.594.3117.718977424802250246017400.700.783.3536.5154497477578438
表2培养基COCL2（mg/l)脲(g/l)巴豆酰胺(g/l)苄腈T.A. S.A.CCCCC1010101010---5.07.52.04.07.52.0-23.224.616.632.62136.06.15.86.542.2
实例3
将预定量的尿素衍生物加到含有10mg/lCoCL2的上述基本培养基C中。向60ml所得到的培养基中加入4ml玫瑰色红球菌J-1菌株（FERM BP-1478）的预培养液（用基本培养基C获得），在28℃下进行振动培养96小时。
为了比较，在仅含有甲脲或CoCL2的介质中进行类似的培养。
结果示于表3中，其中所示的T.A.和S.A.值是在活性测定过程中T.A.值为最大时获得的。在该表中，加入了由7.5g/l尿素获得的结果以供对比。
由该表可以明显看出，同时使用尿素衍生物和CoCL2对于提高腈水解酶生产是必需的。
表3COCL2（mg/l)酶诱导物酶诱导量(g/l)细胞浓度(mg/ml)3－氰吡啶T.A.S.A.010101010101010甲脲－－甲脲乙脲二甲脲二甲脲甲脲烷硫脲7.507.57.57.57.57.57.54.754.945.725.766.444.166.191.9903.2023024515010416640.200.6540.242.523.325.026.820.210脲7.54.99519104