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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410723762.4 (22)申请日 2014.12.03 G01N 33/68(2006.01) (71)申请人 上海交通大学医学院附属上海儿童 医学中心 地址 200127 上海市浦东新区东方路 1678 号 (72)发明人 刘锦纷 洪海筏 叶霖财 (74)专利代理机构 上海卓阳知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 31262 代理人 马伟 (54) 发明名称 NCX1 和 NCKX4 作为诊断动脉导管闭合或开放 的标志物 (57) 摘要 本发明涉及NCX1和NCKX4作为诊断动脉导管 闭合或开放的标志物。 本发明通过wes。
2、tern blot、 Qrt-PCR 和免疫荧光三种方法对动脉导管闭合及 开放的患者进行了蛋白表达差异的分析， 首次证 明 NCX1、 NCKX4 蛋白在人动脉导管组织中表达， 并 且这些蛋白在闭合和开放的两组动脉导管组织中 的相对表达量具有明显的差异， 可能是调控动脉 导管闭合或开放的关键因子， 可用于动脉导管未 闭的临床诊断， 且诊断的准确度高。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104502604 A (43)申请公布日 2015.04.08 CN 104502604 A 1。
3、/1 页 2 1.NCX1 蛋白或其特异性抗体的用途， 其特征在于， 用于制备诊断动脉导管未闭的试剂 或试剂盒。 2.一种用于诊断动脉导管未闭的试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒包含检测 NCX1 蛋 白含量的试剂和检测 -actin 蛋白含量的试剂。 3.根据权利要求 2 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的检测 NCX1 蛋白含量的试剂为 NCX1 蛋白的特异性抗体， 所述的检测 -actin 蛋白含量的试剂为 -actin 蛋白的特异性 抗体。 4.一种芯片或阵列， 其特征在于， 所述的芯片或阵列上具有检测 NCX1 蛋白的试剂和检 测 -actin 蛋白含量的试剂。 5.根据权利要求。
4、 4 所述的芯片或阵列， 其特征在于， 所述的检测 NCX1 蛋白含量的试剂 为 NCX1 蛋白的特异性抗体， 所述的检测 -actin 蛋白含量的试剂为 -actin 蛋白的特异 性抗体。 6.NCKX4 蛋白或其特异性抗体的用途， 其特征在于， 用于制备诊断动脉导管未闭的试剂 或试剂盒。 7.一种用于诊断动脉导管未闭的试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒包含检测 NCKX4 蛋白含量的试剂和检测 -actin 蛋白含量的试剂。 8.根据权利要求 7 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的检测 NCKX4 蛋白含量的试剂为 NCKX4蛋白的特异性抗体， 所述的检测-actin蛋白含量的试剂为-。
5、actin蛋白的特异性 抗体。 9.一种芯片或阵列， 其特征在于， 所述的芯片或阵列上具有检测 NCKX4 蛋白的试剂和 检测 -actin 蛋白含量的试剂。 10.根据权利要求 9 所述的芯片或阵列， 其特征在于， 所述的检测 NCKX4 蛋白含量的试 剂为 NCKX4 蛋白的特异性抗体， 所述的检测 -actin 蛋白含量的试剂为 -actin 蛋白的 特异性抗体。 权 利 要 求 书 CN 104502604 A 2 1/5 页 3 NCX1 和 NCKX4 作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学及医学的临床诊断技术领域， 具体地说， 涉及 NCX1。
6、 和 NCKX4 作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物。 背景技术 0002 动脉导管是主动脉与肺动脉之间的一根管道， 为胎儿循环的重要通路。小儿出生 后， 动脉导管即在功能上关闭， 绝大多数婴儿生后 3 个月左右在解剖上逐渐闭合成为动脉 韧带， 若不闭合即称动脉导管未闭。 动脉导管的闭合分为两期 ： 1.第一期为生理闭合期。 婴 儿出生啼哭后第一口吸气， 肺泡即膨胀， 肺血管阻力随之下降， 肺动脉血流开始直接进入肺 脏， 建立正常的肺循环， 而不流经动脉导管， 促进其闭合。动脉导管的组织学结构与两侧的 主动脉、 肺动脉不同， 管壁主要由平滑肌而不是弹性纤维组织组成， 中层含粘性物质。足月 婴儿。
7、出生后血氧张力升高， 作用于平滑肌， 使之环形收缩， 同时管壁粘性物质凝固， 内膜垫 突入管腔， 造成血流阻滞， 营养障碍和细胞分解性坏死， 因而导管发生生理性闭合。一般在 出生后 10 15 小时内完成， 但在 7 8 天内有潜在性再开放的可能。2. 此后内膜垫弥漫 性纤维增生完全封闭管腔， 最终形成导管韧带。 导管纤维化一般起始于肺动脉侧， 向主动脉 延伸， 但主动脉端可以不完成， 因而呈壶腹状。纤维化解剖性闭合， 88婴儿于 8 周内完成。 如这闭合过程延迟称动脉导管延期未闭。动脉导管出生后 6 个月未能闭合， 将终生不能闭 合， 则称持续动脉导管闭锁不全， 临床上简称动脉导管闭锁不全。。
8、 0003 钠钙交换蛋白 (NCX) 是广泛存在于动物细胞膜上的一种离子转运蛋白， 它在调节 细胞内钙离子平衡中发挥着关键的作用。迄今为止， 科学家已克隆出 8 个不同类型、 两大家 族的 NCX， 他们分别是 NCX1、 NCX2、 NCX3 以及钾以来的 NCX NCKX1、 NCKX2、 NCKX3、 NCKX4 以 及 NCKX5。 0004 有许多从左向右分流心内畸形在胸骨左缘可听到同样的连续性机器样杂音或接 近连续的双期心杂音， 难以辨识， 在建立动脉导管未闭诊断进行治疗前必须予以鉴别。 目前 尚未见关于动脉导管闭合诊断标志物的报道。 发明内容 0005 本发明的目的是针对现有技术。
9、中的不足， 提供用于诊断动脉导管未闭的标志物。 0006 在本发明的第一方面， NCX1 蛋白可用作诊断动脉导管未闭的标志物。 0007 据此， 本发明提供了 NCX1 蛋白或其特异性抗体的用途， 用于制备诊断动脉导管未 闭的试剂或试剂盒。 0008 还提供了一种用于诊断动脉导管未闭的试剂盒， 所述的试剂盒包含检测 NCX1 蛋 白含量的试剂和检测 -actin 蛋白含量的试剂。 0009 优选地， 所述的检测NCX1蛋白含量的试剂为NCX1蛋白的特异性抗体， 所述的检测 -actin 蛋白含量的试剂为 -actin 蛋白的特异性抗体。 0010 还提供了一种芯片或阵列， 所述的芯片或阵列上具。
10、有检测 NCX1 蛋白的试剂和检 说 明 书 CN 104502604 A 3 2/5 页 4 测 -actin 蛋白含量的试剂。 0011 优选地， 所述的检测NCX1蛋白含量的试剂为NCX1蛋白的特异性抗体， 所述的检测 -actin 蛋白含量的试剂为 -actin 蛋白的特异性抗体。 0012 在本发明的另一方面， NCKX4 蛋白可用作诊断动脉导管未闭的标志物。 0013 据此， 本发明提供了 NCKX4 蛋白或其特异性抗体的用途， 用于制备诊断动脉导管 未闭的试剂或试剂盒。 0014 还提供了一种用于诊断动脉导管未闭的试剂盒， 所述的试剂盒包含检测 NCKX4 蛋 白含量的试剂和检测。
11、 -actin 蛋白含量的试剂。 0015 优选地， 所述的检测NCKX4蛋白含量的试剂为NCKX4蛋白的特异性抗体， 所述的检 测 -actin 蛋白含量的试剂为 -actin 蛋白的特异性抗体。 0016 还提供了一种芯片或阵列， 所述的芯片或阵列上具有检测 NCKX4 蛋白的试剂和检 测 -actin 蛋白含量的试剂。 0017 优选地， 所述的检测NCKX4蛋白含量的试剂为NCKX4蛋白的特异性抗体， 所述的检 测 -actin 蛋白含量的试剂为 -actin 蛋白的特异性抗体。 0018 本发明优点在于 ： 0019 本发明通过 western blot、 Qrt-PCR 和免疫荧光。
12、三种方法对动脉导管闭合及开放 的患者进行了蛋白表达差异的分析， 首次证明 NCX1、 NCKX4 蛋白在人动脉导管组织中表达， 并且这些蛋白在闭合和开放的两组动脉导管组织中的相对表达量具有明显的差异， 可能是 调控动脉导管闭合或开放的关键因子， 可用于动脉导管未闭的临床诊断， 且诊断的准确度 高。 附图说明 0020 附图 1 是 NCX1、 NCKX3 和 NCKX4 的 Western-blot 实验结果。 0021 附图 2 是 NCX1、 NCKX3 和 NCKX4 的 Qrt-PCR 实验结果， 其中白色立柱为闭合组， 黑 色立柱为开放组。 0022 附图 3 是 NCX1、 NCK。
13、X3 和 NCKX4 的免疫荧光实验结果， 其中白色立柱为闭合组， 黑 色立柱为开放组。 具体实施方式 0023 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验手册 (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建 议的条件。 0024 实施例 1 0025 1. 材料和方法 0026 1.1 分离人动脉导管组织 0027 该实验所有步骤和过程均获得上海交通大学医学院伦理委员会批准。开放 (n 1。
14、0， 年龄 30.26.3 天 ) 或闭合 (n 10， 年龄 25.37.9 天 ) 的动脉导管组织取自于 手术过程中的动脉导管依赖的先天性心脏病患儿 ( 患儿详细信息见表 1)。所有病人在手 说 明 书 CN 104502604 A 4 3/5 页 5 术前均使用前列腺素 E1， 但闭合组的动脉导管在手术前依然闭合了。动脉导管的状态 ( 开 放或闭合 ) 均经过心脏超声和 CT 确认， 并在手术过程加以确认。所有样本用生理盐水冲洗 后， 分成四部分， 并迅速冻存于液氮中。 0028 表 1 患儿临床信息 0029 开放组闭合组P 体重 (kg)3.30.822.90.640.209 年龄 。
15、(days)30.26.325.37.90.141 性别 (male/female)7/38/21.000 氧饱和度 (SO2)79.65.771.14.70.002* 诊断 TGA/IVS45 PA/IVS23 IAA31 PS11 0030 0031 注 ： *P0.05 开放组 vs 闭合组 ； TGA/IVS ： 完全性大动脉转位 / 室间隔完整型 ； PA/ IVS ： 肺动脉阻滞 / 室间隔完整型 ； IAA ： 主动脉弓中断 ； PS ： 肺动脉狭窄。 0032 1.2 Western blotting 分析 0033 进 行 Western blotting 分 析 所 用 一。
16、 抗 信 息 如 下 ： Anti-NCX1(Abcam， ab2869)， anti-NCKX3(Santa Cruz,sc-50129)， anti-NCKX4(Abcam， ab105715)， 和 anti-actin(Abcam， ab8226)。 0034 将提纯的蛋白用10的分离胶进行分离， 80伏， 1小时。 蛋白进行常规转膜， 5脱 脂奶粉封闭1小时。 按照抗体说明书， 加入一抗， 常温下孵育2小时后， 加入相应的HRP耦合 的二抗(1:5000 ； Thermo Scientific Pierce)孵育1小时后， 加入ECL化学发光液(Merck， Milipore， US。
17、A)。条带的光密度用 Chemi-Doc 成像系统 (Bio-Rad Laboratories) 进行分 析。 0035 1.3 实时荧光定量 PCR 分析 0036 采用 SYBR Green(Applied Biosystems) 两步法检测上述蛋白的 mRNA 水平。用总 RNA 提取试剂盒 ( 天根 ) 从冰冻组织中提取 RNA， 而后用 Takara 反转录试剂盒反转录合成 cDNA， 再用 SYBR Green Power Premix(ABI) 进行聚合酶链反应。反应体系为 10l， DNA 模 板为 1.0l。ABI7900 实时荧光定量 PCR 反应体系如下 ： 95 度 1。
18、0 秒 1 个循环， 95 度 15 秒 40 个循环， 60 度 60 秒。引物由中国杰瑞生物科技有限公司合成， 序列如下 ： 说 明 书 CN 104502604 A 5 4/5 页 6 0037 NCX1(sense,5 -GGTTGGGACTAACAGCTGGA-3 ； antisense,5 -AATCTTTCAGGCCAATGG TG-3 ) ； 0038 NCKX3(sense,5 -TCCTACATCCGGCTGAATAG-3 ； antisense,5 -GCACAGGAACACACCAT ACA-3 ) ； 0039 NCKX4(sense,5 -CCGTCCTCGGCAT。
19、CCACCTA-3 ； antisense,5 -TCGTCTTCCCGGCACAT CG-3 ) ； 0040 GAPDH(sense,5 -TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ； antisense,5 -GGCATGGACTGTGGTCA TGAG-3 )。 0041 所有样本均做 3 个复孔， 复孔间 Ct 值的差异如果大于 0.3， 则该复孔不予考虑。 0042 1.4 免疫荧光分析 0043 动脉导管组织经 4多聚甲醛 4 度过夜后， PBS 洗涤， OCT 包埋。莱卡冰冻切片 机切片 (5m)。0.5 Triton 破膜后， 室温下 10胎牛血清封闭 0.5 小时后， 。
20、加入一抗 4 度过夜。PBS 洗涤 3 次， 加入 AF488 荧光二抗， 共聚焦显微镜检测。所用一抗信息如下 ： Anti-NCX1(Abcam， ab2869)， anti-NCKX3(Santa Cruz， sc-50129)， 和 anti-NCKX4(Abcam， ab105715)。 0044 1.5 统计分析 0045 结果以均数标准差表示， 成组设计定量资料t检验， P0.05认为统计上有差异。 0046 1.6 制作受试者工作特征 (ROC) 曲线 0047 对开放组作 ROC 曲线， 以评价具有表达差异的蛋白的诊断效果。 0048 2. 实验结果 0049 NCX1、 NC。
21、KX3 和 NCKX4 的 Western-blot 实验结果见图 1， NCX1、 NCKX3 和 NCKX4 的 Qrt-PCR 实验结果见图 2， NCX1、 NCKX3 和 NCKX4 的免疫荧光实验结果见图 3。以上结果表 明， NCX1、 NCKX3 和 NCKX4 蛋白在人动脉导管组织中表达， 且在开放组和闭合组中， NCX1 和 NCKX4 蛋白的相对表达量差异达到显著水平 (*P0.05)， NCX1 和 NCKX4 蛋白的 mRNA 相对含 量差异达到极显著水平(*P0.01)， 提示NCX1和NCKX4可能是调控动脉导管闭合或开放的 关键因子。 0050 针对10名开放组。
22、患者NCX1和NCKX4蛋白水平进行ROC曲线分析， 两种蛋白的诊断 价值如表 2 所示。结果表明 NCX1 和 NCKX4 蛋白对动脉导管未闭具有较高的诊断价值， AUC 分别可达 0.853 和 0.904。 0051 表 2 NCX1 和 NCKX4 蛋白相对含量对动脉导管未闭的诊断价值 0052 诊断指标AUC灵敏度特异度 NCX1 相对表达量 6.20(NCX1/-actin)0.85382.573.5 NCX1 相对表达量 5.80(NCX1/-actin)0.73673.067.2 NCKX4 相对表达量 5.20(NCX1/-actin)0.90490.188.4 NCKX4 。
23、相对表达量 5.00(NCX1/-actin)0.81575.368.1 说 明 书 CN 104502604 A 6 5/5 页 7 0053 注 ： AUC 为 ROC 曲线下面积 ； AUC 越接近于 1， 说明诊断效果越好 ； AUC 在 0.5 0.7 时有较低准确性， AUC 在 0.7 0.9 时有一定准确性， AUC 在 0.9 以上时有较高准确性。 0054 实施例 2 0055 对 20 名疑似动脉导管未闭患者以 NCX1 和 NCKX4 蛋白相对含量为标志物进行 诊断。采用 Western blotting 进行分析， 具体方法同实施例 1。以 NCX1 相对表达量 6.。
24、20(NCX1/-actin) 以及 NCKX4 相对表达量 5.20(NCX1/-actin) 为诊断临界值， 高 于以上临界值即判定为动脉导管未闭， NCX1 蛋白标志物的诊断结果显示 14 名患者为动脉 导管未闭， NCKX4 蛋白标志物的诊断结果也显示相同的 14 名患者为动脉导管未闭。后期 14 名患者均实施了动脉导管闭合手术， 手术中确认该 14 名患者均为动脉导管未闭。其他 6 名 患者有 5 名进一步实施了心脏手术， 手术中确认 5 名均非动脉导管未闭。 0056 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明方法的前提下， 还可以做出若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。 说 明 书 CN 104502604 A 7 1/3 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 104502604 A 8 2/3 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 104502604 A 9 3/3 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 104502604 A 10 。