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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410571719.0 (22)申请日 2011.01.18 10151109.5 2010.01.19 EP 201180006497.2 2011.01.18 A61K 39/395(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/574(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 霍夫曼 - 拉罗奇有限公司 地址 瑞士巴塞尔 (72)发明人 P德尔马 D福恩兹勒 S谢勒 (74)专利代理机构 北京坤瑞律师事务所 11494 代理人 封新琴 (54) 发明名称 用于贝伐单。
2、抗联合疗法的基于肿瘤组织的生 物标志 (57) 摘要 本发明涉及用于贝伐单抗联合疗法的基于肿 瘤组织的生物标志。本发明提供了用于改善患有 胃肠癌， 特别是转移性结肠直肠癌 (mCRC) 的患者 的无进展存活的方法， 其通过相对于在诊断为胃 肠癌， 特别是转移性结肠直肠癌 (mCRC) 的患者中 的对照水平测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的 一种或多种的表达水平通过与化学疗法方案组合 用贝伐单抗 () 治疗来进行。本发明 进一步提供了用于评估患者对与化学疗法方案组 合的贝伐单抗 () 的敏感性或响应性 的方法， 其通过相对于诊断为胃肠癌， 特别是转移 性结肠直肠癌 (mCRC) 的患。
3、者中的对照水平测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表 达水平来进行。 (30)优先权数据 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书19页 序列表9页 附图11页 (10)申请公布号 CN 104474545 A (43)申请公布日 2015.04.01 CN 104474545 A 1/1 页 2 1.一种通过对化学疗法方案添加贝伐单抗来改善患有胃肠癌的患者的无进展存活的 方法， 所述方法包括 ： (a) 自所述患者获得样品 ； (b) 测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的。
4、一种或多种的表达水平 ； 并 (c) 对相对于在诊断为转移性结肠直肠癌的患者中测定的对照水平具有升高的 VEGFA 水平、 和 / 或降低的 HER2 和 / 或神经毡蛋白水平的所述患者施用与化学疗法方案组合的贝 伐单抗。 2.一种用于鉴定对将贝伐单抗治疗添加至化学疗法方案响应或敏感的患者的体外方 法， 所述方法包括 ： (a) 自怀疑患有或易于患有胃肠癌的患者获得样品 ； 并 (b) 测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平 ； 由此相对于在患有转移性结肠直肠癌的患者中测定的对照水平， 升高的 VEGFA 和 / 或 CD31水平， 和/或降低的HER2和/或神经毡。
5、蛋白水平指示所述患者对将贝伐单抗添加至所 述方案的敏感性。 3.一种可用于实施权利要求 1 的方法的试剂盒， 其包含能够测定 VEGFA、 HER2 和神经 毡蛋白中的一种或多种的表达水平的寡核苷酸或多肽。 4.寡核苷酸或多肽用于测定权利要求 1 的 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种 的表达水平的用途。 5.贝伐单抗用于改善患有胃肠癌的患者的无进展存活的用途， 包括下列步骤 ： (a) 自所述患者获得样品 ； (b) 测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平 ； 并 (c) 对相对于在诊断为转移性结肠直肠癌的患者中测定的对照水平具有升高的 VEGFA。
6、 水平、 和 / 或降低的 HER2 和 / 或神经毡蛋白水平的所述患者施用与化学疗法方案组合的贝 伐单抗。 权 利 要 求 书 CN 104474545 A 2 1/19 页 3 用于贝伐单抗联合疗法的基于肿瘤组织的生物标志 0001 本申请是申请日为 2011 年 01 月 18 日、 中国申请号为 201180006497.2、 发明名称 为 “用于贝伐单抗联合疗法的基于肿瘤组织的生物标志” 的发明申请的分案申请。 0002 本发明提供了用于改善患有胃肠癌， 特别是转移性结肠直肠癌 (mCRC) 的患者的 无进展存活的方法， 其通过相对于在诊断为胃肠癌， 特别是转移性结肠直肠癌 (mCR。
7、C) 的患 者中的对照水平测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平通过与化学疗 法方案组合用贝伐单抗(bevacizumab)治疗来进行。 本发明进一步提供了用于 评估患者对与化学疗法方案组合的贝伐单抗的敏感性或响应性的方法， 其通过 相对于诊断为胃肠癌， 特别是转移性结肠直肠癌 (mCRC) 的患者中的对照水平测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平来进行。 0003 因而， 本发明涉及胃肠癌， 特别是转移性结肠直肠癌 (mCRC) 的生物标志的鉴定和 选择， 所述生物标志与对与化学治疗方案， 诸如基于奥沙利铂 (oxaliplatin) 。
8、的化学疗法 组合的血管发生抑制剂， 例如贝伐单抗的敏感性或响应性相关联。 在这方面， 本 发明涉及使用相对于在诊断为胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者中建立的对照的 VEGFA、 HER2 和 神经毡蛋白中的一种或多种的肿瘤特异性表达概况， 来鉴定对将血管发生抑制剂， 例如贝 伐单抗添加至标准的化学疗法敏感或响应的患者。本发明进一步涉及用于改 善患有胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者的无进展存活的方法， 其通过相对于在诊断为胃肠癌， 特别是转移性结肠直肠癌的患者中的对照测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种 的肿瘤特异性表达水平通过将血管发生抑制剂， 例如， 贝伐单抗添加至标。
9、准的 化学疗法， 例如， 基于奥沙利铂的化学疗法来进行。作为依照本文中所描述的方法来测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平的备选或在依照本文中所描述的方 法来测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平外， 相对于诊断为胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者中建立的对照水平的肿瘤样品中的血管数目可以作为生物标志测定， 所述生物标志为对将血管发生抑制剂， 例如贝伐单抗添加至标准的化学疗法敏 感或响应的患者的指示物。本发明还提供了用于鉴定对血管发生抑制剂， 特别是贝伐单抗 敏感或响应的患者 ( 依照本发明的方法来测定并限定 ) 的试剂盒和组合物。 00。
10、04 血管发生对于癌症形成是必需的， 其不仅调节原发性肿瘤大小和生长， 而且还影 响侵入性和转移性潜力。因而， 已经调查了介导血管生成过程的机制作为用于定向抗癌疗 法的潜在靶物。早先在血管生成调控物的研究中， 发现了血管内皮生长因子 (VEGF) 信号传 导途径优先调节多种癌症类型中的血管生成活性， 并且已经开发出多种治疗剂来在多个点 调控此途径。这些疗法包括贝伐单抗、 舒尼替尼 (sunitinib)、 索拉非尼 (sorafenib) 和瓦 他拉尼 (vatalanib) 等。虽然血管生成抑制剂在临床中的使用已经显示成功， 但是， 不是 所有患者都响应或不能完全响应血管发生抑制剂疗法。 此。
11、类不完全响应根本的机制是未知 的。因此， 不断需要鉴定对抗血管生成癌症疗法敏感或响应的患者人群。 0005 虽然许多血管发生抑制剂是已知的， 但是最主要的血管发生抑制剂是贝伐单抗 贝伐单抗是一种重组人源化单克隆 IgG1 抗体， 其特异性结合并阻断 VEGF( 血 说 明 书 CN 104474545 A 3 2/19 页 4 管内皮生长因子 ) 的生物学效果。VEGF 是肿瘤血管发生 ( 肿瘤生长和转移， 即肿瘤散布 至身体的其它部分需要的一种必需过程 ) 的一种至关重要的驱动物。在欧洲已 经得到批准， 用于治疗晚期阶段的四种常见癌症类型 ： 结肠直肠癌、 乳腺癌、 非小细胞肺癌 (NSCL。
12、C) 和肾癌， 这些癌症每年共同引起超过 250 万例死亡。在美国，是第一种 得到 FDA 批准的抗血管生成疗法， 并且现在它已经过批准用于治疗 5 种肿瘤类型 ： 结肠直 肠癌、 非小细胞肺癌、 乳腺癌、 脑 ( 成胶质细胞瘤 ) 和肾 ( 肾细胞癌 )。至今已经用 Avastin 治疗了超过50万名患者， 并且具有超过450项临床试验的全面临床项目正调查在不同背景 ( 例如， 晚期或早期阶段疾病 ) 的多种癌症类型 ( 包括结肠直肠、 乳腺、 非小细胞肺、 脑、 胃、 卵巢和前列腺 ) 的治疗中进一步使用 Avastin。重要地，已经显示了有希望作为 共治疗剂， 其在与一大批化学疗法和其它。
13、抗癌治疗组合时表明效力。已经发表了 III 期研 究， 其表明组合贝伐单抗与标准的化学治疗方案的有益效果 ( 见例如， Saltz 等 ,2008,J. Clin.Oncol.,26:2013-2019 ； Yang 等 ,2008,Clin.Cancer Res.,14:5893-5899 ； Hurwitz 等,2004,N.Engl.J.Med.,350:2335-2342)。 然而， 如在血管生成抑制剂的先前研究中的， 这 些中的一些 III 期研究已经显示了一部分患者经历对将贝伐单抗添加至其化 学治疗方案的不完全响应。 0006 因而， 需要确定那些如下的患者的方法， 所述患者响应或。
14、有可能响应包含血管发 生抑制剂， 特别是贝伐单抗的联合疗法。如此， 本发明根本的技术问题是提 供用于鉴定患有或易于患有胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者的方法和手段， 所述患者可以受 益于对化学治疗方案， 例如基于奥沙利铂的抑制剂添加血管发生抑制剂， 特别是贝伐单抗 0007 通过提供权利要求书中表征的实施方案来解决该技术问题。 0008 因此， 本发明提供了一种通过对所述化学疗法方案添加贝伐单抗来改善患有胃肠 癌， 特别是 mCRC 的患者的化学疗法方案的治疗效果的方法， 所述方法包括 ： 0009 (a) 测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平 ； 并 0010。
15、 (b) 对相对于在诊断为胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者中测定的对照水平具有升高的 VEGFA 水平、 和 / 或降低的 HER2 和 / 或神经毡蛋白水平的所述患者施用与化学疗法方案组 合的贝伐单抗。 0011 本发明涉及一种通过对化学疗法方案添加贝伐单抗来改善患有胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者的化学疗法方案的治疗效果的方法， 所述方法包括 ： 0012 (a) 自所述患者获得样品 ； 0013 (b) 测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平 ； 并 0014 (c) 对相对于在诊断为胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者中测定的对照水平具有升高的 VEGFA。
16、 水平、 和 / 或降低的 HER2 和 / 或神经毡蛋白水平的所述患者施用与化学疗法方案组 合的贝伐单抗。 0015 因此， 本发明提供了一种通过对化学疗法方案添加贝伐单抗来改善患有胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者的无进展存活的方法， 所述方法包括 ： 0016 (a) 测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平 ； 并 0017 (b) 对相对于在诊断为胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者中测定的对照水平具有升高的 说 明 书 CN 104474545 A 4 3/19 页 5 VEGFA 水平、 和 / 或降低的 HER2 和 / 或神经毡蛋白水平的所述患者施用与。
17、化学疗法方案组 合的贝伐单抗。 0018 因此， 本发明提供了一种通过对化学疗法方案添加贝伐单抗来改善患有胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者的无进展存活的方法， 所述方法包括 ： 0019 (a) 自所述患者获得样品 ； 0020 (b) 测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平 ； 并 0021 (c) 对相对于在诊断为胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者中测定的对照水平具有升高的 VEGFA 水平、 和 / 或降低的 HER2 和 / 或神经毡蛋白水平的所述患者施用与化学疗法方案组 合的贝伐单抗。 0022 在一个备选的实施方案中， 本发明涉及一种用于鉴定对将贝伐单。
18、抗添加至化学疗 法方案响应或敏感的患者的体外方法， 所述方法包括 ： 0023 (a) 自怀疑患有或易于患有胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者获得样品 ； 并 0024 (b) 测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平 ； 0025 由此相对于在诊断为胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者中测定的对照水平， 升高的 VEGFA 水平， 和 / 或降低的 HER2 和 / 或神经毡蛋白水平指示所述患者对将贝伐单抗添加至 所述方案的敏感性。 0026 作为依照本文中所描述的方法来测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种 的表达水平的备选或在依照本文中所描述的方。
19、法来测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一 种或多种的表达水平外， 相对于诊断为胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者中建立的对照水平的肿 瘤样品中的血管数目可以作为生物标志测定， 所述生物标志为对将血管发生抑制剂， 例如 贝伐单抗添加至标准的化学疗法敏感或响应的患者的指示物。因此， 本发明的 方法涵盖测定所述样品中的血管数目， 其中此类血管数目测定例如在固体组织样品诸如组 织活组织检查和 / 或组织切除中是有可能的或预期是有可能的， 如熟练技术人员认可的。 可以通过本文中所描述的任何方法或如本领域中对于此类测量已知的那样实施血管数目 测定。 一种用于血管数目测定的例示性方法是通过使用对。
20、一种或多种内皮细胞标志物特异 性的一种或多种抗体来检测内皮细胞的标志物。在优选的实施方案中， 肿瘤细胞不表达内 皮细胞的生物标志。因为血管结构自内皮细胞形成， 所以一种或多种内皮细胞标志物区别 血管结构与肿瘤 ( 细胞 )， 容许容易地测定血管数目。熟练技术人员， 例如病理学家会能够 容易地确定适合于检测 / 区分内皮细胞 ( 特别是相对于肿瘤细胞 ) 的抗体及用于检测此类 抗体及随后分析样品的方法两者。依照本发明的方法来分析样品可以是手动的， 如熟练技 术人员， 例如病理学家实施的， 如本领域中已知的， 或者可以是自动化的， 其使用为了加工 并分析病理学图像， 例如， 为了测定组织活组织检查。
21、或切除中的血管数目或其它分析而设 计的商品化软件 ( 例如， MIRAX SCAN、 Carl Zeiss AG、 Jena,Germany) 来实现。 0027 一种公认为在依照本发明的方法测定血管数目中使用的内皮细胞标志物的例示 性抗原是CD31。 例如， 通过以产品号M0823可购自Dako A/S(Glostrup,Denmark)的抗体克 隆 JC70A 识别抗原 CD31， 其用途被本发明的方法涵盖。因而， 本发明涵盖测定患者样品中 的 CD31 的肿瘤特异性表达水平或表达样式 (1) 作为所述患者中所述患者对将贝伐单抗添 加至化学治疗方案的敏感性或响应性的指示物， 或 (2) 作。
22、为方法的一部分以改善所述患者 的无进展存活， 其中所述患者患有或预期患有胃肠癌， 特别是 mCRC。因为 CD31 对内皮细胞 说 明 书 CN 104474545 A 5 4/19 页 6 染色， 并且较大的血管数目与较大的内皮细胞数目相关联， 所以样品中的血管数目也与肿 瘤特异性 CD31 表达水平正相关。因而， 本发明涵盖用于改善患有胃肠癌的患者的无进展存 活的方法， 包括测定所述患者中的肿瘤特异性血管数目和 / 或肿瘤特异性 CD31 表达水平， 并对相对于诊断为胃肠癌， 特别是mCRC的患者中测定的对照水平具有增加的血管数目(和 / 或升高的 CD31 表达 ) 的患者施用与化学疗法。
23、方案组合的贝伐单抗。类似地， 本发明涵盖 一种用于鉴定对将贝伐单抗添加至化学疗法方案响应或敏感的患者的体外方法， 包括测定 所述患者中的肿瘤特异性血管数目和/或肿瘤特异性CD31表达水平， 并且由此相对于诊断 为胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者中测定的对照水平， 来自所述患者的肿瘤样品中增加的血管 数目 ( 和 / 或升高的 CD31 表达 ) 指示患者对将贝伐单抗添加至所述方案的敏感性。 0028 因而， 本发明解决了鉴定的技术问题， 因为令人惊讶地， 显示了相对于诊断为胃肠 癌， 特别是 mCRC 的患者中测定的对照水平， VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种在给 定患者中。
24、的肿瘤特异性表达水平与施用与化学疗法方案组合的血管发生抑制剂的那些患 者中的治疗效果相关联。具体地， 令人惊讶地， 将 VEGFA、 HER2 和 / 或神经毡蛋白的肿瘤特 异性表达水平的变化鉴定为响应将贝伐单抗添加至基于奥沙利铂的化学治疗 方案的胃肠癌患者的无进展存活改善的标志物/预测物。 展现出对将贝伐单抗 添加至化学疗法方案的响应或敏感性的患者鉴定为相对于自诊断为转移性胃肠癌的患者 获得的样品中建立的对照水平具有下列一项或多项 ： 升高的 VEGFA 表达、 降低的神经毡蛋 白表达和降低的 HER2 表达。此外， 在如本文中所描述的 VEGFA、 HER2 和 / 或神经毡蛋白中 的一种。
25、或多种的表达改变外， 令人惊讶地， 将相对于诊断为胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者中 建立的对照水平， 给定患者的肿瘤特异性血管数目 ( 其与一种或多种内皮细胞标志物， 例 如CD31的肿瘤特异性表达水平相关联)增加鉴定(1)为无进展存活改善的标志物/预测物 之一， 和 / 或 (2) 为与施用与化学疗法方案组合的血管发生抑制剂的胃肠癌患者中的治疗 效果相关联的标志物 / 预测物之一。术语 “标志物” 和 “预测物” 可以互换使用， 指 VEGFA、 HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平， 如本文中所描述的。 在VEGFA、 HER2和/或 神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平外， 本。
26、发明还涵盖使用术语 “标志物” 和 “预测物” 来 指依照本文中所描述的方法的内皮细胞标志物， 例如CD31的肿瘤特异性血管数目和/或肿 瘤特异性表达水平。本发明还涵盖使用术语 “标志物” 和 “预测物” 来指 VEGFA、 HER2 和神 经毡蛋白的肿瘤特异性表达水平中的任何两项或更多项的组合， 和肿瘤特异性血管数目。 0029 在本发明的上下文中，“VEGFA” 指图 6 中显示的以 SEQ ID NO:1 例示的血管内皮 生长因子蛋白 A。术语 “VEGFA” 涵盖具有氨基酸序列 SEQ ID NO:1 的蛋白质及其同系物 和同等型。术语 “VEGFA” 还涵盖 VEGFA 的已知同等型。
27、， 例如， 剪接同等型， 例如， VEGF121、 VEGF145、 VEGF165、 VEGF189 和 VEGF206， 及其变体、 同系物和同等型。在本发明的上下文中， 术语 “VEGFA” 还涵盖与氨基酸序列 SEQ ID NO:1， 或者与其变体和 / 或同系物的氨基酸序 列， 及所述序列的片段具有至少 85、 至少 90或至少 95同源性的蛋白质， 只要变体蛋 白质 ( 包括同等型 )、 同源蛋白质和 / 或片段被一种或多种 VEGFA 特异性抗体， 诸如可购自 Abcam,Inc(Cambridge,Massachusetts,U.S.A.) 的抗体克隆 SP28 识别。 003。
28、0 在本发明的上下文中，“HER2” 指属于表皮生长因子受体家族的 I 型跨膜蛋白， 又 称为c-erbB2、 ErbB2或Neu， 其在图7中显示、 以氨基酸序列SEQ ID NO:2例示。 在本发明的 上下文中， 术语 “HER2” 还涵盖HER2的同系物、 变体和同等型， 包括剪接同等型。 术语 “HER2” 说 明 书 CN 104474545 A 6 5/19 页 7 进一步涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO:2、 或与HER2同系物、 变体和同等型中的一种或多种的 序列， 及所述序列的片段具有至少 85、 至少 90或至少 95同源性的蛋白质， 只要变体 蛋白质(包括同等型)、 同。
29、源蛋白质和/或片段被一种或多种HER2特异性抗体， 诸如以可购 自Dako A/S(Glostrup,Denmark)的HerceptestTM提供的抗体识别。 所述Herceptest TM中的 HER2 特异性抗体是一种针对人 HER2 蛋白的合成 C 端胞质内片段 ( 与匙孔虫戚血蓝蛋白偶 联的免疫原 ) 的亲和纯化的家兔抗体。商品化的且适合于依照本发明的方法使用的其它例 示性抗HER2抗体包括但不限于可购自Ventana Medical Systems S.A.(Illkirch,France) 的克隆4B5 ； 可购自Novocastra/Leica GmbH(Wetzler,Ger。
30、many)的克隆CB11、 5A2、 10A7、 和 CBE1中的一种或多种 ； 可购自Thermo Fisher Scientific(Fremont,CA,USA)的克隆SP3和 可购自 InvitrogenTM(Carslbad,CA,USA) 的克隆 TAB250。 0031 在本发明的上下文中，“神经毡蛋白” 指神经毡蛋白 -1 蛋白， 即一种又称为 NRP-1， 且在图 8 中显示、 以氨基酸序列 SEQ ID NO:3 例示的 I 型跨膜蛋白如本文中所使用的，“神 经毡蛋白” 也可以指神经毡蛋白 -2/NRP-2， 其与 NRP-1 共享约 44同源性， 如本领域中已 知的。在本。
31、发明的上下文中， 术语 “神经毡蛋白” 还涵盖 NRP-1 和 / 或 NRP-2 的同系物、 变 体和同等型。术语 “神经毡蛋白” 进一步涵盖与氨基酸序列 SEQ ID NO:1， 或与 NRP-1 和 / 或 NRP-2 同系物、 变体和同等型 ( 包括剪接同等型 ) 中的一种或多种的序列， 及所述序列 的片段具有至少 85、 至少 90或至少 95同源性的蛋白质， 只要变体蛋白质 ( 包括同等 型)、 同源蛋白质和/或片段被一种或多种NRP-1和/或NRP-2特异性抗体， 诸如可购自R&D Systems,Inc.(Minneapolis,Minnesota,U.S.A.) 的克隆 44。
32、6915 识别。 0032 作为测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的肿瘤特异性表达水平的备 选或在测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的肿瘤特异性表达水平外， 本发明 还涵盖测定血管数目作为本文中所描述的方法中使用的生物标志之一。 如本领域中已知的 及本文中所描述的， 可以例如通过检测一种或多种内皮细胞标志物， 例如 CD31 的免疫组织 化学方法来评估患者样品， 例如包含肿瘤组织的样品内的血管数目。CD31 被认为是一种适 合于测定肿瘤样品中的血管数目的内皮细胞标志物， 并且通常使用特异性抗体诸如以产品 号M0823以克隆JC70A可购自Dako A。
33、/S(Glostrup,Denmark)的抗CD31抗体探查。 作为测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的肿瘤特异性表达水平的备选或在测定 VEGFA、 HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的肿瘤特异性表达水平外， 本发明进一步涵盖Dako A/S 抗体克隆 JC70A( 产品号 M0823) 用于依照本文中所描述的方法测定血管数目、 检测内皮细 胞、 和 / 或检测内皮细胞标志物的表达水平的用途。 0033 因而， 本发明涵盖测定蛋白质， 包括但不限于如本文中所描述的氨基酸序列的表 达水平。在此上下文中， 本发明涵盖检测 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的。
34、同系 物、 变体和同等型 ； 所述同等型或变体包含等位变体或剪接变体等。 还涵盖的是检测与如本 文中所描述的 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种或其片段同源， 例如与氨基酸序 列 SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3 或其片段具有至少 60、 70、 80、 90、 95、 96、 97、 98或 99序列同一性的蛋白质。或者 / 另外， 本发明涵盖检测由如下 的核酸序列或其片段编码的蛋白质的表达水平， 所述核酸序列与编码 SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3 或其片段、 变体或同等型的核酸序列至少。
35、 60、 70、 80、 90、 95、 96、 97、 98或 99相同。在此上下文中， 术语 “变体” 意指 VEGFA、 HER2、 和 / 或 说 明 书 CN 104474545 A 7 6/19 页 8 神经毡蛋白氨基酸序列、 或编码所述氨基酸序列的核酸序列与以SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3 鉴定和 / 或以上文所鉴定的 GenBank 登录号可获得的独特序列差别在于突 变， 例如， 删除、 添加、 替代、 倒位等。另外， 术语 “同系物” 指与如 SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2 或SEQ ID NO:3中所显示的一种。
36、或多种多肽或其片段具有至少60， 更优选地至少80且 最优选地至少 90序列同一性的分子。 0034 本发明进一步涵盖测定患者样品中的血管数目， 该数目与如本领域中已知的一种 或多种内皮细胞标志物的肿瘤特异性表达， 例如 CD31 的肿瘤特异性表达水平相关联。在此 上下文中， 本发明涵盖检测一种或多种内皮细胞标志物或其变体的同系物、 变体和同等型， 并且可以包含内皮细胞标志物的等位变体或剪接变体等。 还涵盖的是检测与如本领域中已 知的一种或多种内皮细胞标志物同源， 例如与内皮细胞的已知标志物或其片段， 例如 CD31 或其片段的氨基酸序列具有至少 60、 70、 80、 90、 95、 96、。
37、 97、 98或 99序 列同一性的蛋白质。或者 / 另外， 本发明还涵盖检测由如下的核酸序列或其片段编码的蛋 白质的表达水平， 所述核酸序列与编码内皮细胞标志物， 例如 CD31 或其片段、 变体或同等 型的核酸序列是至少 60、 70、 80、 90、 95、 96、 97、 98或 99相同的。 0035 为了测定氨基酸或核酸序列与如本文中所描述的氨基酸或核酸序列是否具有某 种程度的同一性， 技术人员可以手工或者通过使用本领域中已知的或本文中所描述的计算 机程序使用本领域中公知的手段和方法， 例如比对。 0036 依照本发明， 术语 “相同” 或 “百分比同一性” 在两种或更多种氨基酸或。
38、核酸序列的 上下文中指相同的， 或者如使用如本领域中已知的序列比较算法， 或者通过手动比对和视 觉检查测量的， 为了在比较窗里， 或在指定区里得到最大对应而比较和比对时具有规定百 分比的相同氨基酸残基或核苷酸(例如， 与例如SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3 的氨基酸序列， 或内皮细胞的已知标志物， 例如 CD31 的氨基酸序列的 60或 65同一性， 优选地， 70-95同一性， 更优选地， 至少 95同一性 ) 的两种或更多种序列或亚序列。认 为具有例如 60至 95或更大序列同一性的序列是基本上相同的。此类定义也适用于测 试序列的互补物。优选地， 所。
39、描述的同一性存在于长度为至少约 15 至 25 个氨基酸或核苷 酸的区域里， 更优选地， 在长度为约 50 至 100 个氨基酸或核苷酸的区域里。本领域技术人 员会知道如何使用例如算法， 诸如那些基于 CLUSTALW 计算机程序 (Thompson Nucl.Acids Res.2(1994),4673-4680) 或 FASTDB(Brutlag Comp.App.Biosci.6(1990),237-245) 的算 法来测定序列间的百分比同一性， 如本领域中已知的。 0037 虽然 FASTDB 算法在其计算中通常不考虑序列中的内部不匹配删除或添加， 即 缺口， 但是这可以手动校正以避免。
40、同一性的过度评估。然而， CLUSTALW 在其同一性计 算中确实考虑序列缺口。本领域技术人员也可用的是 BLAST( 基本局部比对搜索工具 (Basic Local Alignment Search Tool)和BLAST 2.0算法(Altschul,1997,Nucl.Acids Res.25:3389-3402 ； Altschul,1993J.Mol.Evol.36:290-300 ； Altschul,1990,J.Mol. Biol.215:403-410)。用于核酸序列的 BLASTN 程序使用作为缺省的字长度 (W) 为 11、 预期 (E) 为 10、 M 5、 N 4、 。
41、和两条链的比较。对于氨基酸序列， BLASTP 程序使用作为缺省的 字长度 (W) 为 3、 和预期 (E) 为 10。BLOSUM62 评分矩阵 (Henikoff(1989)PNAS 89:10915) 使用比对 (B) 为 50、 预期 (E) 为 10、 M 5、 N 4、 和两条链的比较。 0038 如上文所讨论的 BLAST 算法产生氨基酸和核苷酸序列两者的比对以测定序列相 说 明 书 CN 104474545 A 8 7/19 页 9 似性。由于比对的局部性质， BLAST 特别可用于测定精确匹配或鉴定相似序列。BLAST 算法 输出的基本单元是高得分区段对 (High-scor。
42、ing Segment Pair,HSP)。HSP 由任意的但相 等长度的两个序列片段组成， 所述序列片段比对是局部最大的， 并且对于所述序列片段， 比 对得分满足或超过用户设置的阈值或截留得分。BLAST 方法寻找询问序列与数据库序列间 的 HSP， 以评估找到的任何匹配的统计学显著性， 并且仅报告那些满足用户选定的显著性阈 值的匹配。参数 E 建立用于报告数据库序列匹配的统计学显著性阈值。E 解读为整个数据 库搜索的背景内的 HSP( 或 HSP 组 ) 的偶然发生的预期频率的上界。在程序输出中报告其 匹配满足 E 的任何数据库序列。 0039 使用 BLAST 的类似计算机技术可以用于搜。
43、索蛋白质或核苷酸数据库诸如 GenBank 或 EMBL 中的相同或相关分子。此分析比基于膜的多重杂交快得多。另外， 可以改良计算机 搜索的灵敏性以测定任何特定匹配是否分类为精确的或类似的。搜索的基础是乘积得分， 其定义为 ： 0040 0041 并且考虑两个序列间的相似性程度和序列匹配长度两者。例如， 在乘积为 40 的情况中， 匹配在 1-2的误差内会是精确的 ； 而在 70 时， 匹配会是精确的。虽然较低 的得分可以鉴定相关分子， 但是通常通过选择那些显示 15 和 40 间乘积得分的分子来鉴 定相似的分子。关于能够产生序列比对的程序的另一个例子是 CLUSTALW 计算机程序 (Tho。
44、mpson,1994,Nucl.Acids Res.2:4673-4680) 或 FASTDB(Brutlag,1990,Comp.App. Biosci.6:237-245)， 如本领域中已知的。 0042 可以分开认为 VEGFA、 HER2 和 / 或神经毡蛋白的肿瘤特异性表达水平是个别标志 物， 或者在两个或更多个的组中， 是表达概况， 以预测患者对将贝伐单抗添加至化学疗法方 案的敏感性。 因此， 本发明的方法涵盖基于一种或多种标志物的表达水平来测定表达概况。 作为依照本文中所描述的方法来测定 VEFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水 平的备选或在其之外， 也可以使用相。
45、对于诊断为胃肠癌， 特别是 mCRC 的患者中建立的对照 水平， 在肿瘤样品中的血管数目作为一种或多种生物标志， 所述生物标志为对将血管发生 抑制剂， 例如， 贝伐单抗添加至标准的化学疗法敏感或响应的患者的指示物。 0043 依照本发明， 在 NO1966 群体中令人惊讶地发现了， 较大的贝伐单抗治疗效果与肿 瘤细胞上高的CD31表达(高的血管数目)、 较高的VEGFA表达、 较低的神经毡蛋白表达和较 低的 HER2 表达有关。 0044 标志物 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平可以通过本领域中 已知的适合于测定患者样品中的特定蛋白质水平的任何方法来评估， 并且优选。
46、地， 通过采 用对 VEGFA、 HER2、 神经毡蛋白和 / 或 CD31 中的一种或多种特异性的抗体的免疫组织化学 (“IHC” ) 方法来测定。此类方法是本领域中公知的且常规执行的， 并且相应的商业抗体和 /或试剂盒是容易地可获得的。 例如， 用于VEGFA、 HER2、 神经毡蛋白和CD31的商品化抗体/ 测试试剂盒可以分别以克隆 SP28 获自 Abcam,Inc(Cambridge,Massachusetts,U.S.A.)， 以 HerceptestTM获自 Dako A/S(Glostrup,Denmark)， 以克隆 446915 获自 R&D Systems,Inc. 说 。
47、明 书 CN 104474545 A 9 8/19 页 10 (Minneapolis,Minnesota,U.S.A.)， 和以克隆 JC70A 获自 Dako A/S(Glostrup,Denmark)。 优选地， 使用抗体或试剂盒制造商的试剂和 / 或方案推荐来评估本发明的标志物 / 指示物 蛋白质的表达水平。技术人员还会知道通过 IHC 方法来测定 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋白中 的一种或多种的表达水平的其它手段。因此， 本领域技术人员无需过度负担便可以常规并 可再现地确定本发明的一种或多种标志物 / 指示物的表达水平。然而， 为了确保精确的且 可再现的结果， 本发明还涵盖在可。
48、以确保测试规程的确认的专门实验室中测试患者样品。 0045 优选地， 在含有或怀疑含有癌细胞的生物学样品中评估 VEGFA、 HER2 和神经毡蛋 白中的一种或多种的表达水平。 样品可以是自患有、 怀疑患有或诊断为胃肠癌， 特别是mCRC 的患者获得的胃肠组织切除、 胃肠组织活组织检查或转移性损伤。 优选地， 样品是结肠直肠 组织的样品、 结肠直肠肿瘤的切除或活组织检查、 已知的或受怀疑的转移性胃肠癌损伤或 切片、 或已知或怀疑包含循环癌细胞， 例如胃肠癌细胞的血液样品， 例如， 外周血样品。 样品 可以包含癌细胞， 即肿瘤细胞和非癌性细胞两者， 并且在优选的实施方案中， 包含癌性和非 癌性细。
49、胞两者。在包括测定样品中的血管数目的本发明的方面， 样品包含癌 / 肿瘤细胞和 作为内皮细胞的非癌性细胞两者。 熟练技术人员， 例如， 病理学家可以容易地辨别癌细胞与 非癌性， 例如， 内皮细胞， 以及测定样品内的血管数目， 例如， 通过对样品染色以检测内皮细 胞标志物， 例如 CD31 来进行。作为直接测定血管数目的备选或在直接测定血管数目外， 也 可以测定一种或多种内皮细胞标志物， 例如 CD31 的表达水平， 该水平与血管数目相关联。 获得包含组织切除、 活组织检查和体液的生物学样品， 例如包含癌 / 肿瘤细胞的血液样品 的方法是本领域中公知的。 0046 在本发明的上下文中， 要在一种或多种化学治疗剂外或作为与一种或多种化学治 疗剂的共疗法或共治疗施用贝伐单抗， 所述化学治疗剂作为如本领域中已知的标准化学疗 法方案的一部分施用。此类化学治疗剂的例子包括 5- 氟尿嘧啶、 甲酰四氢叶酸、 伊立替康、 吉西他滨 (gemcitabine)- 厄洛替。