基于DNA与重金属离子错配原理检测重金属离子的方法.pdf

本发明涉及一种重金属离子检测方法，具体涉及采用DNA错配的方法检测重金属离子。本发明是基于DNA与重金属离子错配原理来实现对环境中重金属离子的检测。本发明提供的基于DNA与重金属离子错配原理检测重金属离子的方法，包括DNA分子链中碱基和重金属离子的错配反应以及荧光检测，并需要在光纤探头上黏附上DNA链，其特征包括如下步骤：（a）在待用DNA链的末端修饰荧光标记；（b）在光纤探头上黏附的DNA链的末端修饰可以捕获荧光标记的捕获剂；（c）向重金属离子溶液中添加在分子链末端修饰了荧光标记的DNA，发生错配反应；（d）将反应液导入光纤探头上。本发明提供的方法由于通过两步完成检测，并且是“turn-on”模式，可以实现快速、灵敏地检测的目的。

1.  一种基于DNA与重金属离子错配原理检测重金属离子的方法，包括DNA分子链和重金属离子的错配反应以及荧光检测，其中DNA分子链和重金属离子的错配反应包括，在光纤探头上黏附上DNA链，其特征是：包括如下步骤：
（a）在待用DNA链的末端修饰荧光标记；
（b）在光纤探头上黏附的DNA链的末端修饰可以捕获荧光标记的捕获剂；
（c）向待测的重金属离子溶液中添加在分子链末端修饰了荧光标记的DNA，使其与重金属离子发生错配反应，并使得荧光标记从DNA链上脱落，得到反应液；
（d）将上述反应液导入光纤探头上，反应液中脱落的荧光标记被光纤探头上的捕获剂捕获，发出荧光，并通过光纤将荧光传输到荧光检测仪上。

2.  按权利要求1所述的基于DNA与重金属离子错配原理检测重金属离子的方法，其特征是：所说的光纤探头在使用前，先通过尿素溶液进行清洗，再用十二烷基磺酸钠溶液（SDS）清洗，最后用超纯水清洗。

基于DNA与重金属离子错配原理检测重金属离子的方法
技术领域
本发明涉及一种重金属离子检测方法，具体涉及采用DNA错配的方法检测重金属离子。
背景技术
目前对重金属的测定方法主要以化学分析法为主，包括分光光度法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子体光谱法、激光荧光法等。其中基于激光荧光法的重金属测定方法灵敏度非常高，但是在使用时需加入以磷酸盐为代表的荧光试剂，该试剂易于受多种重金属离子的影响发生沉淀，此外水体中的腐植酸的荧光也与重金属元素的荧光相似，极大的影响了使用的准确性。而电感耦合等离子体法（ICP)为代表的仪器分析方法尽管具有准确度、高灵敏度高、分析速度快、能同时检测多种微量元素的优点，但所用仪器价格昂贵、运行成本高、不易实现现场监测的目的；其余重金属检测方法存在操作繁琐、样本需预处理，难以满足现场检测快速、灵敏、准确的要求。
而利用物理方法，往往需要高温、高压等极限条件，而这极大限制了仪器的应用场合。因此，现有技术不能满足目前多行业、多领域中重金属离子浓度检测的需求。基于现代分子生物技术的生物传感器是检测环境、食品、医药以及其他领域中衡量重金属污染物浓度的一种新型技术。通常而言，生物传感器具有灵敏度高、体积小便于原位测量以及成本低等特点。文献（Highly selective oligonucleotide-based sensor for mercury (II) in aqueous solutons, <Angew. Chem. Int. Ed>, 2007年，第46 期，P4093-4096）等采用“turn-off”检测模式检测溶液中的Hg²⁺：在荧光探针的两边富集上碱基T，探针的中间为连接碱基C，寡核苷酸的两边分别修饰有荧光基团和淬灭基团和荧光基团，当出现Hg²⁺时，因形成T-Hg²⁺-T特殊性结构，荧光探针形成发卡结构，导致荧光淬灭，且荧光强度随着Hg²⁺浓度的增大逐渐降低。由于“turn-off”检测模式溶液出现假信号，因此，该方法在实际使用时不具有准确性。而文献（Improving fluorescent DNAzeyme biosensors by combining inter-and-interamolecular quenchers, <Anal. Chem.>, 2003年，第75 期，第23 刊，P6666-6672）报道了“turn-on”检测模式：在底物17DS的5′端用荧光进行标记，在酶链17E的3′端用对应的淬灭基团进行标记，当出现Pb²⁺时，底物分裂并释放出荧光基团，产生荧光信号，且荧光信号的强度与Pb²⁺的浓度成正比线性关系。此方法（一步法）虽然克服了假信号问题，但检测限较高，同时，由于T-Pb²⁺-T错配反应发生在光纤探头上，DNA中的碱基与重金属离子反应需要克服非常达的结构排斥作用才可以实现完全错配，所以需要非常长的时间，如几个小时，因此，也存在实用性问题。
发明内容
针对上述所提及的、基于DNA错配原理检测重金属离子的方法所存在检测限较高、灵敏度低以及检测时间长的问题，本发明设计一种灵敏、快速地检测重金属离子的检测方法。
本发明是将现有技术中的“一步法”改为“两步法”来完成的，即先在液相中完成错配反应后，再将反应液导入光纤探头上完成捕获反应液中荧光标记并检测荧光，完成检测。
本发明提供的方案是：一种基于DNA与重金属离子错配原理检测重金属离子的方法，包括DNA分子链和重金属离子的错配反应以及荧光检测，其中DNA分子链和重金属离子的错配反应包括，在光纤探头上黏附上DNA链，其特征是：包括如下步骤：
（a）在待用DNA链的末端修饰荧光标记；
（b）在光纤探头上黏附的DNA链的末端修饰可以捕获荧光标记的捕获剂；
（c）向待测的重金属离子溶液中添加在分子链末端修饰了荧光标记的DNA，使其与重金属离子发生错配反应，并使得荧光标记从DNA链上脱落，得到反应液；
（d）将上述反应液导入光纤探头上，反应液中脱落的荧光标记被光纤探头上的捕获剂捕获，发出荧光，并通过光纤将荧光传输到荧光检测仪上。
本发明由于DNA链中的碱基可以和重金属离子发生错配反应，因此，重金属离子可以解离配对的DNA双链，并和DNA双链中的一条形成稳定的T-Mⁿ⁺-T结构，因此可以通过检测解离DNA双链后剩下的、自由的未成对DNA链的浓度达到检测重金属离子Mⁿ⁺的目的。在自由的未成对DNA链的末端修饰荧光标记，可以通过捕获荧光标记并检测荧光信号的方法实现对未成对的自由DNA链的浓度的检测。同时，由于荧光发光易于被捕获实现信号放大处理，最终保证检测的灵敏性和精确性。虽然，重金属离子和DNA链中的碱基发生错配反应后，释放出了荧光标记并发出荧光，但需要对荧光标记进行收集并实现检测，因此，通过在光纤探头上黏附了末端修饰有荧光标记捕获剂的DNA分子，可以将因错配反应而释放出的荧光标记捕获在光纤探头上。通过直接向重金属离子溶液中加入修饰了荧光标记的DNA双链，可以使得重金属离子与DNA链中碱基的错配反应发生在液相中，克服了常规方法中让错配反应发生在探头表面与溶液间的界面上而出现的非常达的空间结构阻力，因此，可以保证错配反应在短时间内完成（一般只需几分钟）。从而，保证了本发明在检测重金属离子的灵敏性和快捷性。
本发明的实质是先在液相中完成错配反应后，再将反应液导入光纤探头上以便完成捕获反应液中荧光标记并检测荧光。因此，本发明的显著特点是：发明的方法需要两步完成，即，先是液相中完成错配反应，然后是光纤表面与反应液的界面上完成荧光检测，其具体过程如下面的反应式（1）和（2）所示。由于荧光检测在几分钟内即可完成。因此，本发明提及的方法大大节约了检测时间。

为了使光纤探头可以多次重复使用，本发明最好将所说的光纤探头在使用前，先通过尿素溶液进行清洗，再用十二烷基磺酸钠溶液（SDS）清洗，最后用超纯水清洗。
由于尿素可以解离DNA双链，因此，在光纤探头检测完样品后，用尿素冲洗荧光探头可以让修饰了荧光标记和修饰了荧光标记捕获剂的DNA双链解开，以便让修饰了荧光标记的DNA单链脱离探头表面，只剩下紧紧黏附在探头表面的、修饰了荧光标记捕获剂的DNA链，实现光纤探头的再生。同时，由于尿素的黏附性特别弱，在冲洗过程中，不会残留在光纤探头上，影响光纤探头下一次使用的性能。但尿素冲洗不能保证可以完全解离DNA双链，因此，在尿素冲洗完后，需要继续使用SDS溶液冲洗光纤探头，因为，作为阴离子表面活性剂，SDS可以与DNA双链间的氢键反应，分离核酸链，可以达到彻底将修饰了荧光标记的DNA和修饰了荧光标记捕获剂的DNA形成的双链解离，并将修饰了荧光标记的DNA单链彻底从探头表面脱离，降低光纤探头的背景荧光信号，以保证检测的准确性。
最后使用超纯水清洗探头，保证探头表面的洁净。
使用此方法清洗光纤探头可以保证探头的多次重复使用。
由于，本发明提供的检测方法中，检测到的荧光强度取决于液相中脱落下来的荧光标记的量，脱落下的荧光标记的量越多，荧光强度越强，即，重金属离子的浓度越高，荧光强度越强。因此，本发明所提供的基于DNA与重金属离子间错配原理的重金属检测方法是一种“turn-on”检测模式，具有更准确、更灵敏的特性。
附图说明
图1是修饰了荧光标记的DNA链与重金属离子反应脱离荧光标记并与修饰在光纤探头上的荧光标记捕获剂反应过程示意图。
其中1．Cy2，2．BHQ2，3．2’-Cy2-AAAAAAAAAAAAAA-5’
4. 5’-BHQ2-TTTTTTTTTTTTTT-2’，5. Mⁿ⁺（金属离子）6. 5’-NH₂-C12-TTTTTTTTTTTTTT-2’
7. 光纤探针。
以下结合附图说明本发明的实施方式和具体细节。
具体实施方式
实施例1
     通过采用本发明提供的重金属离子的检测方法对Hg污染的场地的土壤中Hg²⁺的含量进行检测：
1）取待测污染土壤颗粒100 mg并研碎到小于2 mm颗粒大小以下，配置成1000 mL悬浊液，搅拌，震荡，让土壤中的Hg²⁺充分地浸出，沉淀，最终过滤得水溶液962 mL,取10 mL继续过滤，得到待测溶液；
2）在配对的两条DNA链，即2’-Cy2-AAAAAAAAAAAAAA-5’和5’-BHQ2-TTTTTTTTTTTTTT-2’（图1中的3和4）的末端分别修饰上Cy2和BHQ2（图1中的1和2），其中Cy2是荧光标记，可以发出黄绿色荧光；
3）在光纤探头7上修饰上可以捕获荧光标记Cy2的捕获剂6：5’-NH₂-C12-TTTTTTTTTTTTTT-2’；
4）配置Hg²⁺的标准溶液，浓度分别为5，20，40，60和100 nmol/L六个浓度的标准Hg(NO₃)₂溶液；
5）向200 uL Hg²⁺的标准溶液中添加图1中分别修饰了Cy2和BHQ2的DNA双链溶液10 uL，反应5分钟，将反应液导入光纤探头上；
6）在482 nm波线长度上检测Cy2所发射出的黄蓝色荧光谱线信号强度；
7）得到标准Hg²⁺溶液浓度与谱线信号强度间的关系为：y=53x+9.81 (x为浓度，y为谱线信号强度)；
8）将待测溶液按照上述4）-5）过程检测，得到的光谱谱线信号强度为528，因此，按照步骤6）所得的浓度与谱线信号强度之间的关系，得待测溶液的浓度为9.78 nmol/L；
9）因此，土壤中Hg²⁺的含量为：9.78*201*962/(1000*10⁹)/(100*10^-6)*10⁶=18.9 mg/kg。