一种家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法.pdf

本发明提供一种家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法，包括家蚕微孢子虫孢壁蛋白抗原的制备，鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立，家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的腹水制备及纯化，以及家蚕微孢子虫AlphaLISA检测方法的建立。采用本发明方法进行检测时，在生物分子不存在特异的相互作用时，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生，进而带来了更高的敏感性和精确性，检测结果更加精确，具有较高的均一性，且背景干扰少、背景低，具有广泛的动态检测范围；使用本发明试剂盒进行检测时样本需求量极少，且在检测过程中无需洗涤，简化了检测流程，具有良好的市场前景。

1.  一种家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法，包括如下步骤：
1）家蚕微孢子虫孢壁蛋白抗原的制备：先将微孢子虫的孢子用玻璃珠破碎12~13小时后，进行DAPI染色观察，并进行筛选，视野里没有看到发出蓝光的孢子核，通过观察多个视野统计，所制备孢壳的纯度为99%以上，得到微孢子虫孢壳；然后，将所述微孢子虫孢壳再用玻璃珠破碎12~13小时，得到孢壳碎片蛋白，即家蚕微孢子虫孢壁蛋白抗原；
2）鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立：以步骤1）制得的孢壳碎片蛋白为抗原，免疫BALB/C小鼠，采用PEG1500细胞融合技术，并经过亚克隆筛选，得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
 3）家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的腹水制备及纯化：复苏步骤2）制得的家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，培养至对数生长期时，腹腔注射BALB/C小鼠，收集腹水，并采用辛酸-硫酸铵法进行抗体的纯化；将纯化的家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体分为两份，一份用生物素标记，另一份与受体微球偶联；
 4）家蚕微孢子虫AlphaLISA检测方法的建立：采用双抗体夹心法检测微孢子虫；
 ① 家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体与生物素连接：取步骤3）制备的纯化抗体l mg加入带有滤膜的离心管中，以9000 r/min离心8 min；用标记缓冲液（ 0.1mol/L Na₂CO₃/NaHCO₃，pH9.5）重复洗涤6次；收集抗体，配制成50 μL的抗体溶液，所述抗体溶液中包括家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体、标记缓冲液和5 μL 22 mg／mL的生物素（用DMSO配制）；将所述抗体溶液于室温振动孵育4 h，利用带有滤膜的离心管去除多余生物素，得到生物素化抗体，并将生物素化抗体用1xAphaLISA缓冲溶液调整浓度为0.5 mg/mL；
 ② 家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体与受体微球偶联：取步骤3）制备的纯化抗体0.2 mg 加入带有滤膜的离心管中，以9 000 r/min 离心8 min，用缓冲液（0.13 mol/L，pH 8.0 PBS）重复洗涤6 次后收集抗体，在抗体溶液中加入1 mg受体微球、10 μL 25 mg/mL NaBH₃CN（用PBS缓冲液配制，现配现用）、1.25 μL质量浓度为10%的Tween-20，而后用缓冲液将总体积补充到200 μL，于37 ℃避光振荡反应48 h；最后加入10 μL 65 mg/mL 羧甲基羟胺盐酸盐溶液（用0.8 mol/L NaOH配制，现配现用），于37 ℃避光孵育1 h 封闭未结合位点，离心洗涤，得到已连接抗体的受体微球，用1xAphaLISA缓冲液调整受体微球浓度为5 mg/mL；
 ③ 方法的建立：将步骤②制得的已连接抗体的受体微球与1xAphaLISA缓冲液按照1:50~1:100的体积比进行稀释，步骤 ①制得的生物素化抗体与1xAphaLISA缓冲液按照1:200~1:400的体积比进行稀释；在微孔板中分别加入标准品或待检测样品、连接抗体的受体微球和生物素化抗体各25 μL，于37℃振动孵育20 min，然后避光条件下加入链霉亲和素化的供体微球l75 μL，于37℃振动孵育20 min后，在AlphaScreen/Lisa检测仪上检测信号值。

2.  如权利要求1所述家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述步骤③方法的建立具体步骤包括：
    （1）将所述已连接抗体的受体微球与1xAphaLISA缓冲液按照1:50~1:100的体积比进行稀释，作为试剂1；
（2）将所述生物素化抗体与1xAphaLISA缓冲液按照1:200~1:400的体积比进行稀释，作为试剂2；
（3）将10×AlphaLISA assay Buffer用超纯水稀释成1×AlphaLISA assay Buffer，将所述链霉亲和素化的供体微球用1×AlphaLISA assay Buffer稀释至终浓度为40 μg/mL，作为试剂3；
（4）将家蚕蚕卵用PBS缓冲液（0.01mol/L, pH7.4）研磨后，用纱布过滤，取滤液于500~600 r/min离心2~3 min，收集上清液，并将上清液再于3000~3500 r/min离心10~11 min，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液（0.01mol/L, pH7.4）稀释到5mL，作为蚕卵研磨液；
（5）向步骤（4）制备的蚕卵研磨液中加入家蚕微孢子虫，使家蚕微孢子虫在蚕卵研磨液中的浓度依次为10⁷ spores/mL、10⁶ spores/mL、10⁵ spores/mL、10⁴spores/mL和10³spores/mL；
（6）标准曲线的建立：取步骤（5）各浓度含有家蚕微孢子虫的蚕卵研磨液、步骤（1）制备的试剂1和步骤（2）制备的试剂2各25 μL，混合均匀，组成标准品实验组；取步骤（4）制备的蚕卵研磨液、步骤（1）制备的试剂1和步骤（2）制备的试剂2各25 μL，混合均匀，作为阴性对照；将所述标准品实验组和阴性对照的样品均于37℃振动孵育20 min，然后于避光条件下加入175 μL步骤（3）制备的试剂3，再于37℃振动孵育20 min后，在AlphaScreen/Lisa检测仪上615 nm处，检测标准品实验组的各信号值；以标准品组各浓度的对数值为横坐标，各浓度标准品的信号值与阴性对照的信号值的比值为纵坐标，绘制标准曲线；
（7）待测样品的检测：待测样品采用与步骤（4）相同的方法进行处理，得到待测样品研磨液；取待测样品研磨液、步骤（1）制备的试剂1和步骤（2）制备的试剂2各25 μL，混合均匀，于37℃振动孵育20 min，然后于避光条件下加入175 μL步骤3）制备的试剂3，再于37℃振动孵育20 min后，在AlphaScreen/Lisa检测仪上615 nm处，检测待测样品的信号值，并根据步骤（6）建立的标准曲线，进行计算，得到待测样品研磨液中微孢子虫的浓度，进而检测出家蚕蚕卵中的微孢子虫含量。

3.  如权利要求1或2所述家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述受体微球和供体微球均为纳米级微粒；所述受体微球表面包被有化学发光剂和镧系元素铕；所述供体微球表面包被有链酶亲和素和光敏剂。

一种家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法。
背景技术
家蚕微孢子虫(Nosema bombycis，Nb)侵染家蚕引发的微粒子病是家蚕的毁灭性传染病，被确定为世界养蚕地区惟一的检疫病害。近年来国内外学者在家蚕微粒子病的检测方面开展了大量研究工作，取得较大进展，但由于成本、实际灵敏度、操作的复杂性等方面的影响，至今未能有一种技术能够取代现行的光学显微镜检测法。AlphaLISA技术是一种基于微珠的化学发光的新型均相检测技术，AlphaLISA的检测原理类似于双抗夹心法，主要依赖于Alpha供体微珠和受体微珠的相互作用，当生物反应使供体微珠和受体微珠相互接近时，激光激发级联反应，从而产生极大放大的信号，进而被检测到。
近年来，该技术已在医学及分子生物学领域得到了广泛的应用，但针对家蚕微孢子虫的AlphaLISA检测试剂盒，目前国内外均未见报道。与传统的ELISA技术相比，AlphaLISA检测试剂盒具有更高的敏感性、精确性、均一性、背景低、广泛的动态检测范围，而且无需洗涤及样本需求量极少等特点。该技术已在医学及分子生物学领域得到了广泛的应用。但是，针对家蚕微孢子虫AlphaLISA检测国内外均未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法。
实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法，包括如下步骤：
1)家蚕微孢子虫孢壁蛋白抗原的制备：先将微孢子虫的孢子用玻璃珠破碎12～13小时后，进行DAPI染色观察，并进行筛选，视野里没有看到发出蓝光的孢子核，通过观察多个视野统计，所制备孢壳的纯度为99％以上，得到微孢子虫孢壳；然后，将所述微孢子虫孢壳再用玻璃珠破碎12～13小时，得到孢壳碎片蛋白，即家蚕微孢子虫孢壁蛋白抗原；
2)鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立：以步骤1)制得的孢壳碎片蛋白为抗原，免疫BALB/C小鼠，采用PEG1500细胞融合技术，并经过亚克隆筛选，得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
3)家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的腹水制备及纯化：复苏步骤2)制得的家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，培养至对数生长期时，腹腔注射BALB/C小鼠，收集腹水，并采用辛酸-硫酸铵法进行抗体的纯化；将纯化的家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体分为两份，一份用生物素标记，另一份与受体微球偶联；
4)家蚕微孢子虫AlphaLISA检测方法的建立：采用双抗体夹心法检测微孢子虫；
①家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体与生物素连接：取步骤3)制备的纯化抗体lmg加入带有滤膜的离心管中，以9000r/min离心8min；用标记缓冲液(0.1mol/L Na₂CO₃/NaHCO₃，pH9.5)重复洗涤6次；收集抗体，配制成50μL的抗体溶液，所述抗体溶液中包括家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体、标记缓冲液和5μL 22mg/mL的生物素(用DMSO配制)；将所述抗体溶液于室温振动孵育4h，利用带有滤膜的离心管去除多余生物素，得到生物素化抗体，并将生物素化抗体用1xAphaLISA缓冲溶液调整浓度为0.5mg/mL；
②家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体与受体微球偶联：取步骤3)制备的纯化抗体0.2mg加入带有滤膜的离心管中，以9000r/min离心8min，用缓冲液(0.13mol/L，pH 8.0PBS)重复洗涤6次后收集抗体，在抗体溶液中加入1mg受体微球、10μL 25mg/mLNaBH₃CN(用PBS缓冲液配制，现配现用)、1.25μL质量浓度为10％的Tween-20，而后用缓冲液将总体积补充到200μL，于37℃避光振荡反应48h；最后加入10μL 65mg/mL羧甲基羟胺盐酸盐溶液(用0.8mol/L NaOH配制，现配现用)，于37℃避光孵育1h封闭未结合位点，离心洗涤，得到已连接抗体的受体微球，用1xAphaLISA缓冲液调整受体微球浓度为5mg/mL；
③方法的建立：将步骤②制得的已连接抗体的受体微球与1xAphaLISA缓冲液按照1:50～1:100的体积比进行稀释，步骤①制得的生物素化抗体与1xAphaLISA缓冲液按照1:200～1:400的体积比进行稀释；在微孔板中分别加入标准品或待检测样品、连接抗体的受体微球和生物素化抗体各25μL，于37℃振动孵育20min，然后避光条件下加入链霉亲和素化的供体微球l75μL，于37℃振动孵育20min后，在AlphaScreen/Lisa检测仪上检测信号值。
进一步，所述步骤③方法的建立具体步骤包括：
(1)将所述已连接抗体的受体微球与1xAphaLISA缓冲液按照1:50～1:100的体积比进行稀释，作为试剂1；
(2)将所述生物素化抗体与1xAphaLISA缓冲液按照1:200～1:400的体积比进行稀释，作为试剂2；
(3)将10×AlphaLISA assay Buffer用超纯水稀释成1×AlphaLISA assay Buffer，将所述链霉亲和素化的供体微球用1×AlphaLISA assay Buffer稀释至终浓度为40μg/mL，作为试剂3；
(4)将家蚕蚕卵用PBS缓冲液(0.01mol/L,pH7.4)研磨后，用纱布过滤，取滤液于500～600r/min离心2～3min，收集上清液，并将上清液再于3000～3500r/min离心10～11min，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液(0.01mol/L,pH7.4)稀释到5mL，作为蚕卵研磨液；
(5)向步骤(4)制备的蚕卵研磨液中加入家蚕微孢子虫，使家蚕微孢子虫在蚕卵研磨液中的浓度依次为10⁷spores/mL、10⁶spores/mL、10⁵spores/mL、10⁴spores/mL和10³spores/mL；
(6)标准曲线的建立：取步骤(5)各浓度含有家蚕微孢子虫的蚕卵研磨液、步骤(1)制备的试剂1和步骤(2)制备的试剂2各25μL，混合均匀，组成标准品实验组；取步骤(4)制备的蚕卵研磨液、步骤(1)制备的试剂1和步骤(2)制备的试剂2各25μL，混合均匀，作为阴性对照；将所述标准品实验组和阴性对照的样品均于37℃振动孵育20min，然后于避光条件下加入175μL步骤(3)制备的试剂3，再于37℃振动孵育20min后，在AlphaScreen/Lisa检测仪上615nm处，检测标准品实验组的各信号值；以标准品组各浓度的对数值为横坐标，各浓度标准品的信号值与阴性对照的信号值的比值为纵坐标，绘制标准曲线；
(7)待测样品的检测：待测样品采用与步骤(4)相同的方法进行处理，得到待测样品研磨液；取待测样品研磨液、步骤(1)制备的试剂1和步骤(2)制备的试剂2各25μL，混合均匀，于37℃振动孵育20min，然后于避光条件下加入175μL步骤3)制备的试剂3，再于37℃振动孵育20min后，在AlphaScreen/Lisa检测仪上615nm处，检测待测样品的信号值，并根据步骤(6)建立的标准曲线，进行计算，得到待测样品研磨液中微孢子虫的浓度，进而检测出家蚕蚕卵中的微孢子虫含量。
进一步，所述受体微球和供体微球均为纳米级微粒；所述受体微球表面包被有化学发光剂和镧系元素铕；所述供体微球表面包被有链酶亲和素和光敏剂。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明方法先采用杂交瘤技术建立鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株；通过腹水纯化制备鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体；并通过试验验证了制得的单克隆抗体稳定性良好，对家蚕微孢子虫具有特异性，可用于家蚕微孢子虫病原的检 测。
2、本发明将制得的鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白1G5单克隆抗体包被于AlphaLISA法的受体微球上，并用生物素标记制得的鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白2D9单克隆抗体，与供体微球一并组成用于检测微孢子虫的检测试剂盒；采用本发明方法进行检测时，Alpha供体微珠和受体微珠相互作用，在680nm的激光照射下，供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧，单体氧扩散至受体微珠，产生一系列的化学发光反应，最后将能量传递到受体微珠上的铕上，发射波长为615nm，进而进行检测。
3、采用本发明用于检测微孢子虫的试剂盒进行检测时，在生物分子不存在特异的相互作用时，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生，进而带来了更高的敏感性和精确性，检测结果更加精确。
4、本发明用于检测微孢子虫的试剂盒具有较高的均一性，且背景干扰少、背景低，具有广泛的动态检测范围；使用本发明试剂盒进行检测时样本需求量极少，且在检测过程中无需洗涤，简化了检测流程，具有良好的市场前景。
附图说明
图1为破碎孢子总蛋白、破碎孢壳碎片、发芽孢子总蛋白和发芽孢壳碎片的SDS-PAGE图；
图2为鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体进行细胞融合后第8天的生长情况(10×10)；
图3为家蚕微孢子虫胞壁蛋白1G5单克隆抗体腹水纯化前后SDS-PAGE电泳鉴定；
图4为自制试剂剂量－反应曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，实施例中所用原料如无特殊说明，即为普通市售；所采用的生物学试验如无特殊说明，即为常规方法。
一、一种家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法，包括以下步骤：
1、鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株1G5、2D9的建立；
2、家蚕微孢子虫胞壁蛋白1G5、2D9单克隆抗体的腹水制备及纯化；
3、家蚕微孢子虫AlphaLISA的检测；
4、AlphaLISA检测方法的评价。
二、具体步骤包括：
1、鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立；
1.1家蚕微孢子虫孢壁蛋白抗原的制备：
基于“尽可能保留抗原蛋白的天然空间构象”的原则，采用“两步破碎法”制备家蚕微孢子虫的“孢壳碎片”；
将微孢子虫的孢子和发芽孢子用玻璃珠破碎12小时后，进行DAPI染色观察并进行筛选，得到的较纯的孢壳，视野里没有看到发出蓝光的孢子核，通过观察多个视野统计，所制备孢壳的纯度为99％以上，用于进一步破碎制备孢壳碎片；将上述一次破碎后的孢壳进行第二次破碎，并将所制备的“破碎孢子总蛋白”、“破碎孢壳碎片”、“发芽孢子总蛋白”和“发芽孢壳碎片”进行SDS-PAGE检测，结果如图1；图1中M泳道为Marker；1：发芽孢子总蛋白；2：破碎孢子总蛋白；3：孢子悬液被破碎4小时后的上清；4：孢子悬液被破碎2小时后的上清；5：发芽孢壳碎片；6：破碎孢壳碎片。从图1可以得出：两种孢壳碎片体系在25-35KDa之间有三条明显的条带，在25KDa以下也有条带，而且这些条带都包含在总蛋白的条带中，说明所制备的孢壳碎片条带比较丰富。
1.2鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白单抗杂交瘤细胞株的建立：
将1.1制备的家蚕微孢子虫破碎孢壳碎片蛋白免疫BALB/C小鼠(所述家蚕微孢子虫孢壳碎片蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，采用PEG1500细胞融合技术，制备单克隆抗体，结果显示一次融合共分装384孔(分为4板96孔板来分装384个样品)，融合成功370孔，融合率达96.3％，ELISA初检阳性率达17.3％；选择阳性值较高的38个孔亚克隆，经过2次亚克隆，不断反复筛选，最终得到了2株较稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，命名为1G5、2D9。细胞融合的筛选结果如表1、图2所示；表1中显示了4个96孔板中融合孔数，ELISA阳性孔数和ELISA阳性率。图2表明鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体进行细胞融合后第8天生长状态良好。
表1细胞融合及阳性率一览表

1.3单抗的生物特性鉴定
1.3.1阳性杂交瘤细胞稳定性试验
将1.2得到的1G5和2D9细胞株继代培养6个月以上，取培养上清液进行ELISA效价测定(所用ELISIA法进行效价测定为现有公知技术)，结果显示其培养上清ELISA效价仍保持在1:3200-6400；将1G5和2D9细胞株分别冻存1、2、4和6个月后复苏，进行效价测定，结果显示其培养上清ELISA效价仍保持在1:3200-6400；综上可以得出，1G5和2D9阳性杂交瘤细胞株具有良好的稳定性。
1.3.2单克隆抗体的特异性分析
用三抗体夹心ELSIA(TAS-ELISA)法鉴定1G5和2D9分泌单克隆抗体的特异性(所用ELISIA法鉴定单抗的特异性为现有公知技术)，用制备的兔抗孢子虫多克隆抗体作为包被抗原、1G5或2D9细胞株分泌的单克隆抗体为待检测的抗体，酶标抗体为羊抗小鼠IgG-HRP，选择变形微孢子虫(山东株)、家蚕核型多角体病毒(NPV)、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、黑胸败血芽孢杆菌、沙雷氏菌、家蚕微孢子虫和健康家蚕中肠液进行特异性分析，以此来确定单抗的特异性，结果如表2和表3所示；由表2可知，除了阳性对照组以外的各个抗原的两种浓度都显示为阴性，表明1G5单抗对于阳性对照的家蚕微孢子虫具有特异性；由表3可知，除了阳性对照组以外的各个抗原的两种浓度都显示为阴性，表明2D9单抗对于阳性对照的家蚕微孢子虫具有特异性。
表2 1G5单克隆抗体的特异性分析

备注：以样本的OD值比阴性的OD值大于2.0判断为阳性。
表3 2D9单克隆抗体的特异性分析


备注：以样本的OD值比阴性的OD值大于2.0判断为阳性
2、家蚕微孢子虫胞壁蛋白1G5、2D9单克隆抗体腹水的制备及纯化：
2.1家蚕微孢子虫胞壁蛋白1G5、2D9单克隆抗体的制备及纯化
复苏家蚕微孢子虫胞壁蛋白1G5、2D9杂交瘤细胞，培养至对数生长期时，取12周龄的BALB/c小鼠20只，腹腔注射弗氏不完全佐剂，0.2-0.3mL/只；3天后腹腔分别接种用无血清培养基稀释的1G5、2D9杂交瘤细胞，每只小鼠3×10⁶/0.3mL，各10只；间隔5-7天后，采集腹水，连续采2-3次，每只小鼠采集5-10mL腹水，共收集1G5腹水75mL，2D9腹水60mL，分别采用辛酸-硫酸铵法进行抗体的纯化。将纯化前后的腹水进行SDS-PAGE电泳鉴定，结果如图3，表明提纯腹水家蚕微孢子虫胞壁蛋白1G5单克隆抗体主要出现清晰的重链和轻链，纯度较好。经紫外分光光度计测得提纯后1G5、2D9抗体浓度分别为为8.6mg/mL、6.7mg/mL；采用间接ELISA测定小鼠1G5、2D9腹水抗体纯化前后的效价，提纯前小鼠1G5、2D9腹水抗体效价分别为1：128000、1:64000，提纯后1G5、2D9抗体效价为1：64000、1:16000，表明抗体提纯后效价损失小。制备的腹水家蚕微孢子虫胞壁蛋白1G5、2D9单克隆抗体为后续的研究提供了有效的试剂。
2.2抗体的生物素标记：
取纯化后家蚕微孢子虫胞壁蛋白1G5单克隆抗体lmg加入Millipore公司的带有滤膜的离心管中，以9000r/min离心8min；用标记缓冲液(0.1mol/LNa₂CO₃/NaHCO_3，pH9.5))重复洗涤6次；收集抗体，配制成50μL的抗体溶液，所述抗体溶液中包括家蚕微孢子虫孢壁蛋白1G5单克隆抗体、标记缓冲液和5μL 22mg/mL的生物素(用DMSO配制)；将所述抗体溶液于室温振动孵育4h，利用Millipore公司的带有滤膜的离心管去除多余生物素，得到生物素化抗体并；将生物素化抗体用1xAphaLISA缓冲溶液调整浓度为0.5mg/mL。
2.3抗体与受体微球偶联
取纯化后家蚕微孢子虫胞壁蛋白2D9单克隆抗体0.2mg加入Millipore公司的带有滤膜的离心管中，以9000r/min离心8min，用缓冲液(0.13mol/L，pH 8.0PBS)重复洗涤6 次后收集抗体，在抗体溶液中加入1mg受体微球(Perkinelmer公司产品，货号：AL105C)、10μL 25mg/mL NaBH3CN(用缓冲液配制，现配现用)、1.25μL质量浓度为10％的Tween-20，而后用缓冲液将总体积补充到200μL，于37℃避光振荡反应48h；最后加入10μL 65mg/mL的CMO(羧甲基羟胺盐酸盐溶液)(用0.8mol/L NaOH配制，现配现用)后，于37℃避光孵育1h封闭未结合位点，离心洗涤，得到已连接鼠抗家蚕微孢子虫孢壁蛋白单抗的受体微球，用1xAphaLISA缓冲液调整受体微球浓度为5mg/mL。
其中，所使用的受体微球(Perkinelmer公司产品，货号：AL105C)、供体微球(Perkinelmer公司产品，货号：6760002s)、AlphaLISA Immunoassay Buffer(10x)(Perkinelmer公司产品，货号：AL000F)。
3、家蚕微孢子虫AlphaLISA检测方法的建立：
将步骤2.3中得到的已连接家蚕微孢子虫孢壁蛋白2D9单克隆抗体的受体微球与1xAphaLISA缓冲液按照1:50～1:100的体积比进行稀释；步骤2.2得到的生物素标记的微孢子虫孢壁蛋白1G5单克隆抗体与1xAphaLISA缓冲液按照1:200～1:400的体积比进行稀释；与链酶亲和素抗体微球一起组成用于检测微孢子虫的AlphaLISA试剂盒；其中，供体微球为Perkinelmer公司产品，货号：6760002s。
3.1参考标准品及样品的处理：
蚕卵的处理：“无毒”蚕卵用PBS缓冲液(0.01mol/L,pH7.4)研磨，纱布过滤，滤液于500r/min离心2min，收集上清，再以3000r/min离心10min，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液(0.01mol/L,pH7.4)稀释到5mL，作为实验用蚕卵研磨液。检测时，标准品组的蚕卵研磨液里加入纯化Nb孢子(家蚕微孢子虫孢子)，使Nb孢子含量从10⁷spores/mL开始依次倍比稀释，稀释后的浓度依次为：10⁶spores/mL、10⁵spores/mL、10⁴spores/mL和10³spores/mL；阴性对照采用蚕卵研磨液。
3.2AlphaLISA系统的建立：
在微孔板中分别加入标准品或待检测样品、上述配制的连接抗体的受体微球稀释液、生物素化抗体稀释液各25μL，于37℃振动孵育20min，然后避光条件下加入链霉亲和素化的供体微球(使用前1×AlphaLISA assay Buffer稀释至终浓度为40μg/mL)l75μL，再于37℃振动孵育20min后，在AlphaScreen/Lisa检测仪615nm处，检测信号值。
具体步骤包括：
(1)将所述已连接抗体的受体微球与1xAphaLISA缓冲液按照1:50～1:100的体积比进行稀释，作为试剂1；
(2)将所述生物素化抗体与1xAphaLISA缓冲液按照1:200～1:400的体积比进行稀释， 作为试剂2；
(3)将10×AlphaLISA assay Buffer用超纯水稀释成1×AlphaLISA assay Buffer，将所述链霉亲和素化的供体微球用1×AlphaLISA assay Buffer稀释至终浓度为40μg/mL，作为试剂3；
(4)将家蚕蚕卵用PBS缓冲液(0.01mol/L,pH7.4)研磨后，用纱布过滤，取滤液于500～600r/min离心2～3min，收集上清液，并将上清液再于3000～3500r/min离心10～11min，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液(0.01mol/L,pH7.4)稀释到5mL，作为蚕卵研磨液；
(5)向步骤(4)制备的蚕卵研磨液中加入家蚕微孢子虫，使家蚕微孢子虫在蚕卵研磨液中的浓度依次为10⁷spores/mL、10⁶spores/mL、10⁵spores/mL、10⁴spores/mL和10³spores/mL；
(6)标准曲线的建立：取步骤(5)各浓度含有家蚕微孢子虫的蚕卵研磨液、步骤(1)制备的试剂1和步骤(2)制备的试剂2各25μL，混合均匀，组成标准品实验组；取步骤(4)制备的蚕卵研磨液、步骤(1)制备的试剂1和步骤(2)制备的试剂2各25μL，混合均匀，作为阴性对照；将所述标准品实验组和阴性对照的样品均于37℃振动孵育20min，然后于避光条件下加入175μL步骤(3)制备的试剂3，再于37℃振动孵育20min后，在AlphaScreen/Lisa检测仪上615nm处，检测标准品实验组的各信号值；以标准品组各浓度的对数值为横坐标，各浓度标准品的信号值与阴性对照的信号值的比值为纵坐标，绘制标准曲线；
(7)待测样品的检测：待测样品采用与步骤(4)相同的方法进行处理，得到待测样品研磨液；取待测样品研磨液、步骤(1)制备的试剂1和步骤(2)制备的试剂2各25μL，混合均匀，于37℃振动孵育20min，然后于避光条件下加入175μL步骤3)制备的试剂3，再于37℃振动孵育20min后，在AlphaScreen/Lisa检测仪上615nm处，检测待测样品的信号值，并根据步骤(6)建立的标准曲线，进行计算，得到待测样品研磨液中微孢子虫的浓度，进而检测出家蚕蚕卵中的微孢子虫含量。
所述受体微球和供体微球均为纳米级微粒；所述受体微球表面包被有化学发光剂和镧系元素铕；所述供体微球表面包被有链酶亲和素和光敏剂。
3.3AlphaLISA系统的优化：
3.3.1剂量-反应曲线
以上述自制用于检测微孢子虫的AlphaLISA试剂盒中参考标准品浓度的对数(lg10ⁿ spores/mL)为横坐标，待检样品信号值与阴性样品信号值的比值(Bx/B0)为纵坐标，绘制试剂盒中参考标准品剂量-反应曲线(图4)，在测量范围内，自制标准品剂量-反应曲线 方程为Y＝10.95X+0.9785，相关系数r＝0.9757，表明自制的孢子虫光激化学发光免疫检测试剂具有良好的剂量反应。
3.3.2精密度实验
将标准品配制低中高3个浓度，各设10个平行孔，同一次实验内和不同实验中多次测定。结果显示：本实施例自制的用于检测微孢子虫的AlphaLISA试剂盒分析内变异系数为4.56％～6.74％，分析间变异系数为6.45％～8.52％，精密度良好。
3.3.3特异性实验
本发明选择家蚕微孢子虫(Nb)、变形微孢子虫(山东株)、家蚕核型多角体病毒(NPV)、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌(E coli)、黑胸败血芽孢杆菌以及沙雷氏菌7种病原体，阴性为正常蚕卵研磨液，用本实施例自制的用于检测微孢子虫的AlphaLISA试剂盒进行AlphaLISA检测，以此来确定该方法的特异性，检测结果如表4所示，结果显示仅家蚕微孢子虫检测值明显偏高，结果判定为阳性，而其他病原体检测值较低，按判断标准为阴性，表明该方法特异性较高。
表4特异性实验结果

备注：判定标准为待检样品的信号值与阴性(NC)的比值大于2.0，即可判为阳性。
3.3.4稳定性实验
将自制用于检测微孢子虫的AlphaLISA试剂盒室温放置7d后，再次进行检测，与之前的检测结果相比，发现各批试剂信号值变化不大，线性关系良好，且参考标准品信号值未见明显升高，说明稳定性良好。
4、AlphaLISA检测方法的评价
本发明取经母蛾镜检法检测的样品156份，已确定其中阳性样品95份，阴性样品61份；将上述156份样品用本实施例用于检测微孢子虫的AlphaLISA试剂盒，经AlphaLISA法进行检测，结果如表5所示，发现95份阳性样品中检测阳性样品93份，发现61份阴性样品中检测阴性样品58份，检测的灵敏度为97.9％，特异性95.1％，阳性预测值为96.9％，阴性预测值为96.7％。结果表明所建立的AlphaLISA检测方法具有较高的灵敏度和特异性、能满足高通量，快速检测的要求，具有潜在推广应用价值。
表5 AlphaLISA检测方法评价

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110>  西南大学；重庆理工大学；
 
<120>  一种家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法；
 
<160>  1
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
 
<210>  1
<211>  316
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  SEQ ID NO.1的氨基酸序列
 
<400>  1
MKTSVVILAM SYITSIFANN SYDFCDGEFA ISEKDDKCGF SFNPCTLYKQ IQKEYSNCVI         60
LRFYLKAISN MLESICDNNK RCLPFSIDSL YRPLYNREQF KHKHHHTLYA LFRNCLYLVN        120
PIYFKEYQDA LACNQLDVCY FLIRRTVCPK YGVTKYIECL KKRCEDRFDE KELAIFICDS        180
ETFVNIKLEI DACRKICPAD CTLDICKIYS LDFWERRDLL KAIFDYHYCH VLSSDNTRDE        240
IIKKIEEIYL NGTERDIKFT SFIIYQLFTD LVACKSSDKN IKRILDLICL YEKKDKCPSG        300
VMVMIEFFVK VCSYQC                                                        316