猪戊型肝炎病毒ELISA诊断试剂盒的制备方法 【技术领域】
本发明属免疫学领域，具体涉及一种猪戊型肝炎病毒ELISA诊断试剂盒的制备方法。
背景技术
戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV，简称戊肝)是一种经粪、口途径传播的非甲-非乙型肝炎病毒。该病毒会在人群引起暴发流行，主要侵害青壮年，对孕妇可造成20％的病死率。1986-1988年我国新疆南部地区因饮水污染导致戊型肝炎流行，共计发病119280例，死亡707例，是迄今世界上最大的一次戊型肝炎流行。近年来戊型肝炎发病率有逐年增加的趋势，据我国卫生部统计，戊肝发病率2003年比2002年上升40.4％。因此，戊肝防控已列入各级公共卫生机构的工作日程。
近年来研究发现，HEV可以感染猪、牛、羊、鼠和鸡等动物。其中，病毒在猪和鼠的抗体阳性率高于50％，由此推测动物是HEV传播的重要中间宿主。基因序列分析表明，从动物体内分离的戊型肝炎病毒与人的HEV有极高的基因同源性，并且已有人食用野猪肉和鹿肉而感染戊肝的报道，证明戊肝是一种可以通过食物传播的人畜共患疫病。葛胜祥等【中国人兽共患病杂志，2003，19(2)，108-109】对我国20个省、市和自治区的120个养猪场的8626只成年猪进行了HEV血清学调查，结果表明平均感染阳性率为83.4％，其中最高省份为内蒙古(100％)，最低为湖北(68％)。鉴于我国HEV居高不下的感染率，对猪戊肝病毒的表位进行研究，建立特异、有效的猪戊肝检测方法，研制安全、有效的猪戊肝疫苗，了解的流行发病规律，阻断该病由猪向人的传播，对于保证人民的健康安全意义重大。
虽然猪戊肝研究越来越得到全世界的重视，但目前国内外对猪戊肝的研究多限于局部区域的流行病学调查和一些简单的动物感染试验。在猪戊肝防控研究方面尚有以下有待回答问题和技术瓶颈。目前还没有猪戊肝病毒的表位研究报道，用于检测猪戊型肝炎病毒的方法还不是很完善，市场上用于猪戊肝检测的试剂盒是用于人戊肝检测的试剂盒，如北京万泰试剂盒和上海科华试剂盒。虽然猪戊肝病毒与人戊肝病毒序列同源性很高，但是他们之间毕竟还是有些差别，用人的戊肝病毒表位来检测猪戊肝病毒导致检测的特异性不强，不能特异反映出猪戊肝流行规律。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种猪戊型肝炎病毒ELISA诊断试剂盒的制备方法，以解决猪戊型肝炎病毒快速检测问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：
一种猪戊型肝炎病毒ELISA诊断试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)抗原表位的计算机筛选；
2)抗原的制备；
3)血清的采集；
4)间接ELISA方法的建立；
5)间接ELISA方法的敏感性和特异性验证；
6)试剂盒的稳定性验证；
7)对屠宰场进行临床检测。
所述间接ELISA方法还包括：抗原稀释、封闭、加一抗、加二抗、显色、终止等步骤。
本发明的制备方法简单、快速、灵敏度高、特异性强、稳定性合格、重复性好。应用该方法制得的试剂盒能有效检出感染猪的戊型肝炎病毒，适用于大批量发病样本的检测，可用于猪戊肝的快速诊断，并预防、控制猪戊肝病毒的流行和阻断戊肝病毒由猪向人传播。
【具体实施方式】
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
实验试剂和材料
多肽swHEV11(由GL-Biochem(shanghai)Ltd.多肽合成仪合成)，Na2HPO4(上海新华化工厂)，NaH2PO4(上海新华化工厂)，Na2CO3(上海试剂二厂)，NaHCO3(上海文妟生化科技有限公司)，NaCl(国药集团化学试剂有限公司)，KCl(上海试一化学试剂有限公司)，Tris-Base(上海双向巴斯科技发展有限公司)，Tween-20(Farco Chemical Supplies)，二甲基亚砜(上海凌峰化学试剂有限公司)，3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)(上海斯高勒生物科技有限公司)，柠檬酸(上海化学试剂有限公司)，柠檬酸三钠(国药集团化学试剂有限公司)，H2O2(上海化学试剂有限公司)，浓盐酸(国药集团化学试剂有限公司)，BSA(上海斯高勒生物科技有限公司)，二抗(Immunology ConsultantsLaboratory，Inc.)，D-海藻糖(上海沪峰生物科技有限公司)，万泰试剂盒(北京万泰生物药业有限公司)，酶标板(厦门市云鹏科技发展有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，洗板机(Wellwash 4MK2)和酶标仪(Multiskan MK3)(Thermo electron corporation)，PH检测仪(Mettler Toledo)，微量振荡器和漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
实施例1
一、计算机筛选猪戊型肝炎病毒表位并合成多肽
利用计算机软件从猪戊型肝炎病毒全基因组开放阅读框ORF1、ORF2和ORF3的对应蛋白中筛选识别表位。表位识别的主要依据是蛋白质或多肽氨基酸序列的亲水性、表面度、柔韧度、Chou-Fasman的螺旋、片状和转角、Robson-Garnier的二级结构及C-和N-末端来预测抗原综合数据(Antigenic Index，AI)。利用现有的软件，如：GCG(Madison，Wisconsin，USA)及DNAStar(Madison，Wisconsin，USA)从猪HEV的ORF1、ORF2和ORF3的蛋白中计算AI和辅助识别抗原区。根据猪HEV的ORF1、ORF2和ORF3的已知蛋白质取得的氨基酸序列，再用计算机程序来估计它们的抗原区(AI)(一般10到15个氨基酸)。
通过分析，分别从HEV ORF1、ORF2和ORF3选定12个多肽(参见表1)。
表1 多肽多抗原swHEV-1-12的氨基酸序列
上述序列由GL-Biochem(shanghai)Ltd通过多肽合成仪合成后，再由HPLC纯化得到纯度大于95％的多肽。
二、采集血清
用北京万泰实业生物医药有限公司生产的猪HEV总抗体ELISA试剂盒对采集到的猪血清进行进行鉴定，筛选出猪HEV阳性血清和阴性血清。
三、间接ELISA方法的建立
用猪HEV阳性血清和阴性血清对合成得到的猪HEV多肽进行ELISA鉴定，筛选出猪HEV表位抗原。其具体步骤如下：
1.抗原稀释
取10μl浓度为10mg/ml地多肽(将5mg合成的多肽溶解在0.5ml二甲基亚砜DMSO而得)与90μl PBS液混匀，得到的抗原稀释液溶度为1μg/μl。再取15μl抗原稀释液与5ml包被液混匀，得到的抗原稀释溶度为3μg/ml。在酶标板上加入抗原稀释溶度100μl/孔，4℃包被12h。
2.封闭
吸去包被液，每孔加入200μl封闭液于37℃封闭2h。封闭液为3％牛血清白蛋白(BSA)/TBS液。
3.加一抗
用TBST液洗板3次，每孔加100μl 1％BSA/TBST液和10μl血清，震荡混匀，置37℃温育1h。
4.加二抗
用TBST液洗板5次，每孔加100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG或IgM(均购自于Immunology Consultants Laboratory，Inc.，USA)稀释液，置37℃温育1h。二抗用1％BSA/TBST液稀释(IgG以1∶10000稀释，IgM以1∶100000稀释)。
5.显色
用TBST液洗板5次，每孔加底物液100μl，37度显色10min。底物液是由10ml柠檬酸缓冲液，0.4mlTMB和33μl 3％H2O2配置而成的。
6.终止
每孔加50μl 1mol/l HCl的终止液来终止反应，用酶标仪测OD值。当(样品OD值/阴性对照OD值)＞2.1为阳性，当(样品OD值/阴性对照OD值)＜2.1为阴性。实验结果见表2和表3。
表2 合成猪HEV多肽与猪HEV阳、阴性血清盘的免疫反应(对于IgG)
注：+，阳性；-，阴性。
表3 合成猪HEV多肽与猪HEV阳性血清盘的免疫反应(对于IgM)
注：+，阳性；-，阴性。
经鉴定多肽swHEV-2、swHEV-3、swHEV-5、swHEV-7、swHEV-9、swHEV-10、swHEV-11、swHEV-12是阳性表位，是猪HEV表位。将swHEV-11作为包被抗原制作成猪戊型肝炎病毒诊断试剂盒。
四、试剂盒的重复性实验
对试剂盒做批内重复和批间重复实验。批内重复变异系数小于10％，批间重复变异系数小于20％，实验结果表明该试剂盒重复性良好(参见表4)。
表4 批内重复性试验和批间重复性试验结果
注：X，平均OD值；S.D.，标准差；CV，变异系数。
五、敏感性实验
将试验血清样品做一系列稀释后，再用本发明的试剂盒和万泰试剂盒进行ELISA敏感性试验，两者有较高的符合率(参见表5)。
表5 间接ELISA敏感性试验结果
六、特异性实验
与其它猪病血清样品的ELISA特异性试验，结果显示含有PCV和PRRS的猪血清样品为HEV阳性，表明现在猪中带有其它类型的病毒中也带有戊肝病毒，与现在的猪HEV的高流行率一致(参见表6)。
表6 间接ELISA特异性试验结果
七、与抗原重组为基础的试剂盒比较
与万泰试剂盒比较，符合率为73.4％(参见表7)，而与科华试剂盒比较，符合率为47.9％(参见表8)，说明本方法能很好的检测出猪戊型肝炎病毒。
表7 与万泰试剂盒比较结果
注：+，阳性；-，阴性。
表8 与科华试剂盒比较结果
注：+，阳性；-，阴性。
八、用本试剂盒对猪进行现场检测
用本试剂盒检测上海一屠宰场1564头成年猪，结果有1142头猪被检测出阳性，阳性率为72.9％，本方法检测结果表明上海地区的食用猪的戊肝感染率很普遍。
注：上述各溶液的配方：
PBS液(500ml，pH7.4)：0.575g Na2HPO4和0.114g NaH2PO4加蒸馏水溶解，定容至入500ml。
包被液(1000ml，pH9.6)：1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3加蒸馏水溶解，定容至入1000ml。
TBS液(2000ml，pH8.6)：16g NaCl、0.4g KCl和2.42g Trizma-Base加蒸馏水溶解，定容至入2000ml。
TBST液(1000ml，Tween-20的浓度为0.1％)：1000ml TBS液加入1.0ml Tween-20。
柠檬酸缓冲液(100ml，pH3.5-4.0)：0.84g柠檬酸和0.294g柠檬酸钠加蒸馏水溶解，定容至入100ml。
终止液(500ml，1M HCl)：40.88ml浓盐酸溶解于459.12ml蒸馏水。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。