一种纳米微球免疫比浊法检测ΒSUB2/SUB微球蛋白试剂盒.pdf

本发明涉及一种测定血清中的β2-微球蛋白的试剂盒。所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好，适用于各种类型的全自动生化分析仪的纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒。技术方案是：一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒，包括；a、试剂R1：缓冲液、防腐剂、稳定剂、电解质、表面活性剂，其余为纯化水；b、试剂R2：缓冲液、结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球、防腐剂，纳米微球直径为50-150nm；c、参考校准品：缓冲液，稳定剂，防腐剂以及根据浓度需要确定的一定量的重组人β2-微球蛋白纯品，其余为纯化水。

1.  一种纳米微球免疫比浊法检测β₂-微球蛋白试剂盒，包括试剂R₁、试剂R₂以及参考校准品；其中：
a、试剂R₁：一种使样本中β₂-微球蛋白抗原位点充分暴露，有利于与抗β₂-微球蛋白抗体试剂充分结合的β₂-微球蛋白溶液，包括5-200mmol/L缓冲液、0.1-5mmol/L防腐剂、0.5-5mmol/L的稳定剂、50-200mmol/L电解质、0.1-4mmol/L表面活性剂，其余为纯化水；
b、试剂R₂：一种结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球溶液，包括5-200mmol/L缓冲液、0.1％-5％重量比的结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球、适量的防腐剂，纳米微球直径为50-150nm；
c、参考校准品：一种用来与样本比较，进行结果计算的β2-微球蛋白溶液，包括缓冲液100-200mmol/L，稳定剂166-180mmol/，适量防腐剂2mmol/L以及根据浓度需要确定的一定量的重组人β2-微球蛋白纯品，其余为纯化水。

2.  根据权利要求1所述的一种纳米微球免疫比浊法检测β₂-微球蛋白试剂盒，其特征在于所述β₂-微球蛋白试剂R1中还加入反应加速剂，浓度为3-10mmol/L。

3.  根据权利要求1或2所述的一种纳米微球免疫比浊法检测β₂-微球蛋白试剂盒，其特征在于所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠中的一种或多种的混合。

4.  根据权利要求1或2所述的一种纳米微球免疫比浊法检测β₂-微球蛋白试剂盒，其特征在于所述缓冲液是三羟甲基氨基甲烷或CAPSO。

5.  权利要求1所述的一种纳米微球免疫比浊法检测β₂-微球蛋白试剂盒，其特征在于所述结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球溶液的制备方法是：用缓冲液在室温下稀释重量比例为1∶1的抗人β₂-MG抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温振荡吸附2小时，加入含0.1％BSA的缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用缓冲液稀释至浓度为0.3％，并加入适量防腐剂。

一种纳米微球免疫比浊法检测β₂-微球蛋白试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于测定血清成份的试剂盒，特别是测定血清中的β2-微球蛋白(β2-MG)的试剂盒，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。
背景技术
β₂-微球蛋白(β₂-MG)是一种低分子量(11800)的蛋白质，最先在肾小管性肾炎的病人尿中分离；β₂-MG存在于几乎所有有核细胞表面，是人类白细胞抗原(HLA)分子轻链的组成部分。作为HLA代谢和分解的产物，β₂-MG以低浓度的游离形式出现在血清、尿液和其他体液中。游离β₂-MG通过肾小球滤过肾小管重吸收排出和降解。因为β₂-MG每天在体内生成率较为恒定，且只被肾脏排泄，测定血β2-MG可作为肾小球滤过率的指标。
已知测定β₂-微球蛋白(β₂-MG)的方法有免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫分析法、酶联免疫法(ELISA法)。这些方法存在着操作繁琐，需要特殊的设备，样本需要预处理，不能进行批量样本分析和不能直接上全自动生化分析仪检测等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种β2-微球蛋白检测试剂的改进，所提供的试剂应具有样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好，适用于各种类型的全自动生化分析仪的纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒。
本发明提供的技术方案是：
一种纳米微球免疫比浊法检测β₂-微球蛋白试剂盒，包括试剂R₁、试剂R₂以及参考校准品；其中：
a、试剂R₁：一种使样本中β₂-微球蛋白抗原位点充分暴露，有利于与抗β₂-微球蛋白抗体试剂充分结合的β₂-微球蛋白溶液，包括5-200mmol/L缓冲液、0.1-5mmol/L防腐剂、0.5-5mmol/L的稳定剂、50-200mmol/L电解质、0.1-4mmol/L表面活性剂，其余为纯化水；
b、试剂R₂：一种结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球溶液，包括5-200mmol/L缓冲液、0.1％-5％重量比的结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球、适量的防腐剂，纳米微球直径为50-150nm；
c、参考校准品：一种用来与样本比较，进行结果计算的β2-微球蛋白溶液，包括缓冲液100-200mmol/L，稳定剂166-180mmol/，适量防腐剂以及根据浓度需要确定的一定量的重组人β2-微球蛋白纯品，其余为纯化水。将重组人β2-微球蛋白纯品加入上述溶液中，获得所需浓度的β₂-MG参考校准品(该β2-微球蛋白参考校准品为添加重组人β2-微球蛋白纯品的人血清或其它类似血清基质的液体)。
β₂-MG参考校准品的浓度可以是高浓度单点参考校准品，在使用时用生理盐水稀释成多个不同浓度的参考校准品；也可以直接制备成多个不同浓度的参考校准品。这里没有特别的限制，只要制得的β₂-MG参考校准品能够与样本比较，能够测定样本中β₂-MG的含量即可。
所述β₂-微球蛋白试剂R1中还加入反应加速剂，浓度为3-10mmol/L。
所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠中的一种或多种的混合。
所述缓冲液是三羟甲基氨基甲烷或CAPSO。
所述防腐剂是广谱杀菌剂。
所述结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球溶液的制备方法是：用缓冲液在室温下稀释重量比例为1∶1的抗人β₂-MG抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温振荡吸附2小时(即常规的物理吸附法)，加入含0.1％BSA的缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用缓冲液稀释至浓度为0.3％，并加入适量防腐剂。
抗人β₂-MG抗体多克隆抗体包括羊抗抗人β₂-MG抗体多克隆抗体或兔抗抗人β₂-MG抗体多克隆抗体或鼠抗抗人β₂-MG抗体多克隆抗体。
本发明所需主要原料
1、羊抗人β₂-微球蛋白多克隆抗体；可外购或委托浙江伊利康生物技术研发中心按常规方法制备，该抗体仅与人β₂-微球蛋白反应，与其它抗原无免疫交叉反应，效价能够满足本试剂要求。
2、纳米微球；市场上有许多商品化的纳米微球可供选择，包括美国Sigma公司、德国默克公司、日本UNF公司；可选择多种直径的纳米微球，本发明采用了直径为80～120nm的微球，相应的试剂检测主波长为600nm。
3、重组β2-微球蛋白纯品；可外购，或由浙江伊利康生物技术研发中心制备，用于制备本试剂所需参考校准品。
其余生化原料均可外购。
本发明测定样本的原理是利用抗原抗体反应，先加入试剂R1(样本稀释液)，解除样本中抗原周围的电子层和水化层，使抗原位点充分暴露；然后加入试剂R₂(抗人β₂-MG抗体的纳米微球溶液)，使β₂-MG抗体的纳米微球与样本中相应的β₂-MG抗原反应，形成不溶性的抗原-抗体复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的β₂-MG含量成正比；在规定波长下测定该不溶性抗原-抗体复合物的吸光度值，与已知浓度的β₂-MG参考校准品进行比较，则可计算出样本中β₂--MG的含量。
试剂R2中纳米微球与抗人β2-微球蛋白抗体的结合可以采用物理吸附法或化学交联法制备，优选物理吸附法。
本发明提供的试剂为液体双试剂，具有特异性好，灵敏度高，准确性好及抗干扰能力强等优点，而且测定时操作简单、样本不用预稀释，可用于检测体液中β₂-微球蛋白的浓度，适用于临床全自动生化分析仪。
附图说明
图1为采用本发明实施例1进行测定所得β₂-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的β₂-MG测得值的相互关系示意图。
图2为采用本发明实施例2进行测定所得β₂-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的β₂-MG测得值的相互关系示意图。
图3为采用本发明实施例3进行测定所得β₂-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的β₂-MG测得值的相互关系示意图。
具体实施方式
β₂-MG检测试剂的制备实施例：
实施例一
1、β₂-MG溶液(试剂R₁)
三羟甲基氨基甲烷缓冲液              50mmol/L
吐温-20(表面活性剂)                 0.5mmol/L
NaCL(电解质)                        100mmol/L
PEG-6000(反应加速剂)                4mmol/L
广谱杀菌剂(防腐剂)                  3mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)            5mmol/L
其余为纯化水
2、抗人β₂-MG抗体溶液(试剂R₂)
用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.4)在室温下稀释羊抗人β₂-MG抗体多克隆抗体和80nm纳米微球(抗体和微球的重量比例为1∶1)，将两者混匀后室温振荡吸附2小时(即本领域技术人员已公知的物理吸附法)，加入封闭液(含0.1％BSA三羟甲基氨基四烷缓冲液)封闭1小时，离心去上清，用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3％，并加入适量的防腐剂；即获得β₂-微球蛋白检测试剂盒试剂(R₂)。
3、血清型β₂-MG溶液(参考校准品)
CAPSO  (缓冲液)                100mmol/L
广谱杀菌剂(防腐剂)                2mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)          2mmol/L
牛血清白蛋白(稳定剂)              3mmol/L
氯化钠(稳定剂)                    166mmol/L
其余为纯化水
按照所需要的β₂-MG参考校准品浓度将相应量的重组β₂-MG纯品40mg/L加入上述溶液中，制备得40mg/L浓度的β₂-MG参考校准品。
采用本实施例对样本进行测定，所得β₂-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的β₂-MG测得值进行比较(参见图1，并进行回归分析)；获知相关性r＝0.9995(y＝1.007x+0.0236)；显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。
实施例二
1、β₂-MG溶液(试剂R₁)
三羟甲基氨基甲烷(缓冲液)          150mmol/L
吐温-20(表面活性剂)               4mmol/L
NaCL(电解质)                      60mmol/L
PEG-6000(反应促进剂)              8mmol/L
广谱杀菌剂(防腐剂)                0.1mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)          0.5mmol/L
其余为纯化水
2、抗人β₂-MG抗体溶液(试剂R₂)
用150mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)在室温下稀释羊抗人β₂-MG抗体多克隆抗体和100nm纳米微球(抗体和微球的重量比例为1∶1)，将两者混匀后室温振荡吸附2小时(即本领域技术人员已公知的物理吸附法)，加入含0.1％BSA的三羟甲基氨基四烷缓冲液封闭1小时，离心去上清，用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为4％，并加入适量的防腐剂；即获得β₂-微球蛋白检测试剂盒试剂(R₂)。
3、血清型β₂-MG溶液(参考校准品)
CAPSO(缓冲液)                       150mmol/L
广谱杀菌剂(防腐剂)                  5mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)            3mmol/L
牛血清白蛋白(稳定剂)                3mmol/L
氯化钠(稳定剂)                      166mmol/L
其余为纯化水
按照所需要的β₂-MG参考校准品浓度将相应量的重组β₂-MG纯品60mg/L加入上述溶液中，制备得60mg/L浓度的β₂-MG参考校准品。
采用本实施例对样本进行测定，所得β₂-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的β₂-MG测得值进行比较(参见图2，并进行回归分析)；获知相关性r＝0.9985(y＝1.0264x+0.0149)；显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。
实施例三
1、β₂-MG溶液(试剂R₁)
三羟甲基氨基甲烷缓冲液            200mmol/L
吐温-20(表面活性剂)               2mmol/L
NaCL(电解质)                      200mmol/L
PEG-6000(反应促进剂)              5mmol/L
广谱杀菌剂(防腐剂)                3mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)          2mmol/L
其余为纯化水
2、抗人β₂-MG抗体溶液(试剂R₂)
用200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)在室温下稀释羊抗人β₂-MG抗体多克隆抗体和120nm纳米微球(抗体和微球的重量比例为1∶1)，将两者混匀后室温振荡吸附2小时(即本领域技术人员已公知的物理吸附法)，加入含0.1％BSA的三羟甲基氨基四烷缓冲液封闭1小时，离心去上清，用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为2％，并加入适量的防腐剂；即获得β₂-微球蛋白检测试剂盒试剂(R₂)。
3、血清型β₂-MG溶液(参考校准品)
CAPSO(缓冲液)                 200mmol/L
广谱杀菌剂(防腐剂)            2mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)      0.5mmol/L
牛血清白蛋白(稳定剂)          5mmol/L
氯化钠(稳定剂)                166mmol/L
其余为纯化水
按照所需要的β₂-MG参考校准品浓度将相应量的重组β₂-MG纯品80mg/L加入上述缓冲液中，制备得80mg/L浓度的β₂-MG参考校准品。
采用本实施例对样本进行测定，所得β₂-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的β₂-MG测得值进行比较(参见图3，并进行回归分析)；获知相关性r＝0.9992(y＝1.0062x+0.0285)；显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。
本发明的测定条件及步骤：

结果的计算：
式中：
β2-MG(mg/L)=CS×ΔATΔAS(mg/L)]]>
ΔAT待测样品平均每分钟吸光度变化值
ΔAS校准液平均每分钟吸光度变化值
CS校准液中β₂-MG的浓度
尚需补充的是：本文中凡未特别标明的比例均为重量比。