在氧化物层上形成钝化表面的中间体和方法及由其产生的产品.pdf

本发明描述了在氧化物层上形成钝化表面的中间体和方法及由其产生的产品。使氧化物表面上的羟基或氢氧化物基团与式Y(L-Pol)m的金属试剂反应，其中Y是过渡金属、镁或铝，L是氧、硫、硒或胺，并且“Pol”表示诸如聚乙二醇、烃或碳氟化合物的钝化剂。还能够使所得的改性表面与具有磷酸酯官能团的钝化剂或包含钝化部分和与Y反应或形成配合物的多个官能团的多价试剂反应。所述钝化剂还能够包括诸如生物素的官能团以便提供具有期望的功能性的表面。所述钝化表面显示出对生物分子的最小结合并且能够用于单分子检测方案。

1.  改性载体表面的方法，所述方法包括：
使所述表面与金属试剂接触，其中所述表面包含羟基和/或氧化物阴离子基团；以及
使所述金属试剂与所述表面上的羟基和/或氧化物阴离子基团反应以形成改性表面；
其中所述金属试剂具有下式所示的结构：
Y(L-Pol)_m
其中：
Y是过渡金属、镁或铝，
L是氧、硫、硒或胺，
每一“Pol”基团独立地表示聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物，并且
m是整数。

2.  如权利要求1所述的方法，其还包括：
使所述改性表面与包含以下式(I)、式(II)或式(III)的化合物的钝化组合物接触：

其中：
X是O、N或亚甲基基团；
R₃是聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物；并且
R₄是N(R₂)₄或M，其中M是Li、Na、K或Cs并且其中R₂是烷基基团。

3.  如权利要求2所述的方法，其中所述钝化组合物包含所述式(II)的化合物或所述式(III)的化合物。

4.  如权利要求3所述的方法，其中R₄是N(R₂)₄，其中R₂是烷基基团。

5.  如权利要求1所述的方法，其还包括在使所述载体的表面与所述金属试剂接触之前预处理所述载体的表面，其中预处理包括用氧等离子体处理所述载体的表面或使所述载体的表面与四丁基铵氢氧化物、甲醇中的氢氧化钾、硫酸中的过氧化氢、硫酸中的硝酸、氨水中的过氧化氢、硫酸、氢氟酸、EDTA或其组合接触。

6.  如权利要求5所述的方法，其中使所述载体的表面与碱接触并且其中所述碱是四丁基铵氢氧化物。

7.  如权利要求1所述的方法，其中所述载体包含金属氧化物。

8.  如权利要求1所述的方法，其中所述载体包含硅、铝、锗、镓、铟、镁或锡的氧化物。

9.  如权利要求1所述的方法，其中至少一种“Pol”基团是聚乙二醇或取代的聚乙二醇。

10.  如权利要求9所述的方法，其中至少一种“Pol”基团是包含生物素部分的聚乙二醇。

11.  如权利要求2所述的方法，其中所述钝化组合物包含具有第一R₃基团的所述式(I)、(II)或(III)的第一磷酸酯化合物和具有第二R₃基团的所述式(I)、(II)或(III)的第二磷酸酯化合物，并且其中所述第一R₃基团与所述第二R₃基团不同。

12.  如权利要求2所述的方法，其中R₃是聚乙二醇或取代的聚乙二醇。

13.  载体，其由权利要求1所述的方法制备。

14.  载体，其由权利要求2所述的方法制备。

15.  以下式(I)、式(II)或式(III)的化合物：

其中：
X是O、N或亚甲基基团；
R₃是聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物；以及
R₄是N(R₂)₄或M，其中M是Li、Na、K或Cs并且其中R₂是烷基基团。

16.  如权利要求15所述的化合物，其中所述化合物是所述式(II)的化合物或所述式(III)的化合物。

17.  如权利要求16所述的化合物，其中R₄是N(R₂)₄。

18.  如权利要求17所述的化合物，其中R₂是丁基基团。

19.  如权利要求15所述的化合物，其中R₃是聚乙二醇或取代的聚乙二醇。

20.  组合物，其包含权利要求15所述的化合物。

21.  如权利要求20所述的组合物，其中所述组合物包含所述式(I)、(II)或(III)的第一磷酸酯化合物和与所述第一磷酸酯化合物不同的所述式(I)、(II)或(III)的第二磷酸酯化合物。

22.  下式的化合物：
Y(L-Pol)_m
其中Y是过渡金属、镁或铝，
L是氧、硫、硒或胺，
每一“Pol”基团独立地表示聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物，并且
m是整数。

23.  如权利要求22所述的化合物，其中Y选自Ta、Ti、Nb、Zr和Al。

24.  组合物，其包含权利要求22所述的化合物。

25.  方法，其包括：
使下式的第一化合物：
Y(OR₆)_m
与一个或多个下式的第二化合物反应：
Pol-LH
以形成下所述式的金属酯化合物
Y(L-Pol)_m
其中：
Y是过渡金属、镁或铝，
R₆是C₁-C₅烃，
L是氧、硫、硒或胺，
每一“Pol”基团独立地表示聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物，并且
m是整数。

26.  如权利要求25所述的方法，其中使所述一个或多个第二化合物与所述第一化合物以至少m∶1的摩尔比反应。

27.  固体载体，其包含：
包含硅、铝、锗、镓、铟、镁或锡的氧化物的氧化物层；以及
所述氧化物层的表面上的部分，所述部分具有以下式(I)或式(II)所示的结构：

其中：
X是O、N或亚甲基基团
Y是过渡金属、镁或铝，
L是氧、硫、硒或胺或L是金属络合剂，
每一“Pol”基团独立地表示聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物，
R₃是聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物，以及
m是整数；并且
其中所述氧原子在所述氧化物层中与相同的或不同的硅、铝、锗、镓、铟、镁或锡原子结合。

28.  如权利要求27所述的载体，其中Y选自Ta、Ti、Nb、Zr和Al。

29.  化合物，其包含与钝化剂轭合的金属络合剂，其中：
所述金属络合剂选自羧酸酯、多巴胺和anachelin；并且
所述钝化剂选自聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物和取代的碳氟化合物。

30.  如权利要求1所述的方法，其还包括：
使所述改性表面与包含与钝化剂轭合的金属络合剂的钝化组合物接触，其中：
所述金属络合剂选自羧酸酯、多巴胺和anachelin；并且
所述钝化剂选自聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物和取代的碳氟化合物。

31.  如权利要求27所述的固体载体，其中L是选自羧酸酯、多巴胺和anachelin的金属络合剂。

32.  如权利要求1所述的方法，其还包括：
使所述改性表面与包含钝化部分和与Y反应或与Y形成配合物的多个官能团的多价试剂接触，其中所述钝化部分选自取代的聚乙二醇、未取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物和取代的碳氟化合物。

33.  如权利要求32所述的方法，其中与Y反应或与Y形成配合物的所述多个官能团选自羟基基团、胺基基团、磷酸酯基团、膦酸酯基团、硫醇基团、烷基磷酸酯基团、羧基基团及其组合。

34.  如权利要求32所述的方法，其中所述多价试剂用下式表示：

其中：
R是H、烷基、芳基或官能团；
L是连接基团或共价键；
每一W和Y独立地是O、NH、S或膦酸酯；
每一X和Z独立地是H、磷酸酯、烷基甲酰基或烷基磷酸酯；
n是3至100；
o是1至8；
p是0至8；以及
q是1至3。

35.  如权利要求34所述的方法，其中所述连接基团L用式-(C)_S-(C＝O)-Q-R’-Q-(C＝O)-表示，其中每一Q独立地是-O-或-NH-，R’是脂肪族或芳香族基团并且s是0至10的整数。

36.  如权利要求32所述的方法，其中所述多价试剂用下式表示：

其中n是正整数。

37.  如权利要求32所述的方法，其中所述多价试剂用下式表示：

其中是正整数。

38.  载体，其由权利要求32所述的方法制备。

39.  固体载体，其包含：
包含硅、铝、锗、镓、铟、镁或锡的氧化物的氧化物层；
与所述氧化物层结合的选自过渡金属、镁和铝的金属原子；以及
包含钝化部分的钝化试剂，所述钝化部分选自取代的聚乙二醇、未取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物和取代的碳氟化合物；
其中所述钝化试剂在多个位置与一个或多个所述金属原子共价结合或形成配合物。

在氧化物层上形成钝化表面的中间体和方法及由其产生的产品
本申请要求于2006年11月21日提交的第60/860,215号美国临时专利申请和于2006年11月22日提交的第60/860,480号美国临时专利申请的优先权。将每一上述申请的全部内容以参考的方式并入本文。
本文使用的章节标题仅用于组织的目的，不应以任何方式被解释为限制本文所述的主题。
背景
技术领域
本申请一般涉及表面改性技术，并具体涉及在氧化物层上形成钝化表面的中间体和方法及由其产生的产品。
技术背景
实时DNA测序需要探询由聚合酶引起的各个并入事件，优选在表面上。通常，这些并入事件通过检测在并入的核苷上作为单个分子的标记物(即单分子检测)来鉴定。最常见的标记物是荧光染料。被标记的核苷在表面上甚至很小的非特异性吸收都会产生错误的阳性信号。因此，底物与表面的结合应当最小化。
仍然亟需改进的钝化技术，其将允许形成薄的钝化层并使表面显示出对生物分子的最小吸收。
概述
根据第一实施方案，提供了改性载体表面的方法，其包括：
使表面与金属试剂接触，其中所述表面包含羟基和/或氧化物阴离子基团；以及
使金属试剂与表面上的羟基和/或氧化物阴离子基团反应以形成改性表面；
其中金属试剂具有下式所示的结构：
Y(L-Pol)_m
其中：
Y是过渡金属、镁或铝；
L是氧、硫、硒或胺；
每一“Pol”基团独立地表示聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物；并且
m是整数。
该实施方案所述的方法还能够包括使改性表面与多价试剂接触，所述多价试剂包含钝化部分和与Y反应或与Y形成配合物的多个官能团，其中钝化部分选自取代的聚乙二醇、未取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物和取代的碳氟化合物。
根据第二实施方案，提供了如下的式(I)、式(II)或式(III)所表示的化合物：

其中：
X是O、N或亚甲基基团；
R₃是聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物；并且
R₄是N(R₂)₄或M，其中M是Li、Na、K或Cs并且其中R₂是烷基基团。
根据第三实施方案，提供了包含与钝化剂轭合的金属络合剂的化合物，其中：
所述金属络合剂选自羧酸酯、多巴胺和anachelin；并且其中
所述钝化剂选自聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物和取代的碳氟化合物。
根据第四实施方案，提供了下式表示的化合物：
Y(L-Pol)_m
其中：
Y是过渡金属、镁或铝，
L是氧、硫、硒或胺，
每一“Pol”基团独立地表示聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物，并且
m是整数。
根据第五实施方案，提供了方法，其包括：
使下式的第一化合物：
Y(OR₆)_m
与一个或多个第二化合物反应，每一所述第二化合物如下所示：
Pol-LH
以形成下式的金属酯化合物
Y(L-Pol)_m
其中：
Y是过渡金属、镁或铝，
R₆是C₁-C₅烃，
L是氧、硫、硒或胺，
每一“Pol”基团独立地表示聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物，并且
m是整数。
根据第六实施方案，提供了固体载体，其包含：
包含硅、铝、锗、镓、铟、镁或锡的氧化物的氧化物层；和
在氧化物层的表面上的部分，该部分具有如下的式(I)或式(II)所示的结构：

其中：
X是O、N或亚甲基基团；
Y是过渡金属、镁或铝；
L是氧、硫、硒或胺或L是金属络合剂；
每一“Pol”基团独立地表示聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物；并且
R₃是聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物；并且
其中氧原子在氧化物层中与相同的或不同的硅、铝、锗、镓、铟或锡原子结合。
所述金属络合剂的非限制性实例包括羧酸酯、多巴胺和anachelin。
根据第七实施方案，提供了固体载体，其包含：
包含硅、铝、锗、镓、铟、镁或锡的氧化物的氧化物层；
与氧化物层结合的选自过渡金属、镁和铝的金属原子；以及
包含钝化部分的钝化试剂，所述钝化部分选自取代的聚乙二醇、未取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物和取代的碳氟化合物；
其中钝化试剂在多个位置与一个或多个金属原子共价结合或形成配合物。

附图简述
技术人员会理解，如下所述的附图仅用于说明的目的。附图不以任何方式来限制本发明教导的范围。
图1A是描述根据一实施方案能够被钝化的、包含羟基的氧化物表面的示意图。
图1B是描述根据另一实施方案能够被钝化的、包含氢氧化物阴离子基团的表面的示意图。
图2显示了能够用来改性氧化物表面的金属试剂的制备。
图3显示了由金属试剂化合物与氧化物表面的反应得到的改性表面。
图4A、4B和4C说明了含有磷酸酯基团的钝化剂的化学结构，所述磷酸酯基团能够与用金属试剂处理的表面反应以形成钝化表面。
图5是显示用金属试剂处理过的表面与包含磷酸酯基团的钝化剂相互作用结果的示意图。
图6示出用包含多个羟基基团的多价PEG钝化剂在表面上置换不稳定的单价钝化剂。
图7A至7E是显示具有TaPEG₅₅₀/TEG磷酸酯改性表面的盖玻片的共焦荧光成像的结果的图表，其中所述图表是100×100μm图像像素的计数率柱状图。
图8A至8C是显示使用硫代-Liz dCTP的TaPEG₅₅₀(无磷酸酯)改性表面的计数率柱状图的图表。
图9A是得自在常规制备的5％PEG硅烷(Pegsilane)改性盖玻片上的0.1nM Liz-dGTP的相关曲线，其在长的滞后时间(例如10ms)时显示拖尾(tail)，该拖尾表示表面上的粘性染料。
图9B和9C显示了得自在TaPEG₅₅₀表面改性盖玻片上扩散的玫瑰精染料和硫代Liz dCTP的稀释溶液的荧光相关谱(FCS)的相关曲线。
图10A显示了用Ta(单甲基-PEG₅₅₀)₅处理然后用五(羟基)单甲基-PEG₅₅₀的乙醇溶液处理的石英表面上的1nm荧光LIZ染料溶液的非特异性结合数据。
图10B显示了用Ta(单甲基-PEG₅₅₀)₅处理然后用五(羟基)单甲基-PEG₅₅₀的乙醇溶液处理石英表面，在缓冲液的存在下4小时后，该改性表面上的1nm荧光LIZ染料溶液的非特异性结合数据。
图10C显示了用Ta(单甲基-PEG₅₅₀)₅处理然后用五(羟基)单甲基-PEG₅₅₀的乙醇溶液处理的石英表面上的100nm荧光LIZ染料溶液的非特异性结合数据。
图10D显示了用Ta(单甲基-PEG₅₅₀)₅处理然后用五(羟基)单甲基-PEG₅₅₀的乙醇溶液处理石英表面，在缓冲液的存在下4小时后，该改性表面上的100nm荧光LIZ染料溶液的非特异性结合数据。
图11A显示了用Ta(单甲基-PEG₅₅₀)₅处理的石英表面上的1nM荧光LIZ染料溶液的非特异性结合数据。
图11B显示了用Ta(单甲基-PEG₅₅₀)₅处理的石英表面上的100nM荧光LIZ染料溶液的非特异性结合数据。
图11C显示了用Ta(单甲基-PEG₅₅₀)₅处理石英表面，在缓冲液的存在下4小时后，该改性表面上的1nM荧光LIZ染料溶液的非特异性结合数据。
图12A和12B是显示在DNA延伸缓冲液中孵育之前(图14A)和之后(图14B)用TaPEG₅₅₀然后用PEG₃₅₀-三磷酸酯处理的熔融硅石的照片，其中所述硅石片用100nM LIZ-dATP孵育然后用水清洗以除去任何未粘附的染料。
发明详述
本文使用的“或”表示“和/或”，除非另有说明或者当用“和/或”明显不合适时。本文使用的冠词“a”表示“一个或多个”，除非另有说明或者当用“一个或多个”明显不合适时。“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”的使用是可互换的并且不用于限制。此外，当一个或多个实施方案的描述使用术语“包含(comprising)”时，本领域技术人员会理解，在某些特定情况下，能够使用术语“基本由...组成”和/或“由...组成”可选地描述该实施方案或这些实施方案。还应当理解，在某些实施方案中，在本发明的教导仍可操作的情况下，步骤的顺序或进行某些操作的顺序是非实质性的。另外，在某些实施方案中，两个或多个步骤或操作能够同时进行。
本发明提供了在氧化物(例如二氧化硅)表面上形成非常薄的铝或过渡金属化合物(例如酯)的技术，目的是产生用于在钝化剂尾部与官能团反应的钝化表面或改性表面。所述钝化剂能够是不自组装的聚乙二醇(即PEG)。所述官能团能够是具有四丁基铵抗衡离子的磷酸盐基团或二磷酸盐基团，使试剂适合在有机溶剂中使用。
Ta(5+)、Ti(4+)和Zr(4+)的过渡金属酯是可商购的(如甲基酯、乙基酯和异丙基酯)。然而，这些酯与痕量水的反应产生不溶的氧化物，阻止了它们在水环境中用于涂层表面。另外，它们在有机溶剂中的溶解度有限，尤其是可商购的Ti(4+)的酯，阻止了这些试剂在许多有机溶剂中的使用。
本发明人已经发现，可商购的Ta(5+)和Ti(4+)的酯能够与四或更多当量的中分子量(即2个或更多EO单元)的PEG单甲基酯反应以产生在大多数有机溶剂中具有优异溶解度的试剂，并且该试剂能够以可很好预测的方式在诸如二氧化硅表面的氧化物表面上形成那些金属的很薄的层。在某些情况下，所述沉积产生适合用于单分子检测方案的钝化表面。在其它情况下，改性表面还能够与PEG的磷酸酯或二磷酸酯衍生物或另一钝化剂反应而产生期望的表面。
整体方案总结在图1至图5中。
图1A是含有反应性羟基基团的氧化物材料(例如硅酸盐玻璃或石英)的表面的示意性描述。通过用碱处理能够将表面上的羟基基团转化成氢氧化物阴离子。图1B是含有反应性氢氧化物阴离子基团的氧化物材料(例如硅酸盐玻璃或石英)的表面的示意性描述。根据一实施方案，通过用四丁基铵氢氧化物处理能够将表面上的羟基基团转化成氢氧化物阴离子。这导致了能够在有机介质中非常容易溶解的季铵盐的形成。
在钝化之前能够用氧等离子体或用四丁基铵氢氧化物、甲醇中的氢氧化钾、硫酸中的过氧化氢(即“食人鱼(piranha)”溶液)、硫酸中的硝酸(即“王水”)、氨水中的过氧化氢(即“RCA”溶液)、硫酸、氢氟酸、EDTA或这些处理的相继结合来处理氧化物表面。
图2示出能够用来改性氧化物表面的金属试剂的制备。为了合成该试剂，能够添加多于所需当量数(即m)的Pol-LH化合物，使金属上的低分子量醇全部置换。在添加至金属酯之前应当将PEG干燥。数小时后，能够将该溶液排空以除去帮助促使反应完成的被置换的低分子量醇。
图3显示了金属试剂与氧化物表面的反应结果。大体上，残余的“Pol”(例如PEG)基团留在金属酯的未反应部位上，其后来被用于转化成不溶的金属伴侣(metal-partner)对。这些“Pol”基团的存在使得能够使用多种溶剂(例如作为实例的乙酸乙酯、甲苯、二氯甲烷)以利用不同的极性和回流温度，如果需要其中任何一种来优化沉积速度的话。已经发现，用金属试剂改性表面导致在多种条件下形成很薄的层(由通过XPS对表面进行的元素分析所证实)。
在某些情况下，用金属试剂处理氧化物表面得到钝化表面。在其它情况下，通过用金属试剂处理形成的改性表面是用另外的钝化步骤处理形成钝化表面的中间产物。图4A显示具有诸如磷酸酯基团或膦酸酯基团的络合剂的聚合钝化剂的化学结构，所述钝化剂能够用来处理金属试剂改性的氧化物表面以形成钝化表面。在图4A中，取代基R₃能够是聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物。
如图4B和4C所示，能够将磷酸酯转化成它们的盐(例如四丁基铵盐)以改善在多种有机溶剂中的溶解度。在图4B和4C中，取代基R₄能够是N(R₂)₄或M，其中R₂是烷基基团并且M是Li、Na、K或Cs并且取代基R₃能够是聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物。
另外，聚合钝化剂能够含有取代基以提供全部或部分具有期望功能性的表面。例如，图4A至图4C中所示的磷酸酯的R₃取代基可以包括生物素部分。另外，金属试剂处理的表面能够与包含具有不同聚合元素的钝化剂的混合物的组合物接触以提供为具体的最终用途应用而优化的表面。例如，钝化制剂可以包含PEG磷酸酯或二磷酸酯与碳氟化合物磷酸酯或二磷酸酯的混合物以便获得期望的表面性质。期望的表面性质能够通过试验根据经验来确定。在图4A至图4C中，X能够是O、N或亚甲基基团并且R₃取代基能够是聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物。而且在图4B和4C中，每一R₄取代基能够是N(R₂)₄或M，其中M是Li、Na、K或Cs并且其中R₂是烷基基团。
图5显示通过用包含磷酸酯基团的钝化剂处理氧化物表面形成的表面，其中所述氧化物表面已经预先用金属试剂处理。从图5能够看出，这种技术在氧化物表面上形成钝化剂薄层。在图5中，R₃取代基能够是聚乙二醇、取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物或取代的碳氟化合物。而且在图5中，Y能够是过渡金属、镁或铝并且Z能够是O、N或亚甲基基团。
使用本文所述的金属试剂能够在各种氧化物表面上受控制地形成很薄的金属前体层。另外，所述表面能够在很温和的条件下形成。金属试剂也易于制备并且在使用前不需要纯化。
使用金属试剂前置层和磷酸酯功能钝化剂使得能够使用易于获得的功能性磷酸酯以用于沉积期望的表面。磷酸酯能够由氧氯化磷和钝化剂的醇溶液方便地合成。合成的磷酸酯能够被转化成易溶于多种溶剂的衍生物(例如季铵衍生物)，并且该衍生物仍保持它们与金属试剂改性表面的反应性。磷酸酯与表面的反应不需要有尾的磷酸酯在表面上的大范围加热或自组装。
使用金属试剂和磷酸酯功能钝化剂还使得能够通过设计具有不同聚合基团的磷酸酯而产生多种表面类型和性质。例如，在与金属试剂处理过的氧化物表面接触之前，能够将烃、碳氟化合物和PEG醇的磷酸酯混合以获得对特定应用具有期望性质的改性表面。另外，能够使用含有特定功能性(例如生物素)的磷酸酯以获得会结合另一分子(例如链霉亲和素)的表面。
用多价钝化剂处理金属试剂改性表面
根据某些实施方案，随后能够用多价钝化剂处理上述用金属试剂处理的载体的表面，所述多价钝化剂包含钝化部分和能够在表面上与金属原子形成共价键或形成配合物的多个官能团。例如，多价钝化剂能够在过渡金属氧化物表面置换单价钝化剂，同时保留氧化物表面和钝化剂之间的过渡金属层。用多价钝化剂置换单价钝化剂的示意性描述如图6所示。这样，多价钝化剂能够赋予钝化表面基本的水解稳定性。
多价钝化剂上的钝化部分能够是选自取代的聚乙二醇、未取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物和取代的碳氟化合物的部分。
与表面上的金属原子起反应或与表面上的金属原子形成配合物的多个官能团能够是羟基基团、胺基基团、磷酸酯基团、膦酸酯基团、硫醇基团、烷基磷酸酯基团、羧基基团或其组合。
多价钝化剂的通式如下所示。

其中：R是H、烷基、芳基或官能团；L是连接基团或共价键；每一W和Y独立地是O、NH、S或膦酸酯；每一X和Z独立地是H、磷酸酯、烷基甲酰基或烷基磷酸酯；n是3至100；o是1至8；p是0至8；并且q是1至3。如上式所示，多价钝化剂包含未取代的聚乙二醇作为钝化部分。尽管描述了未取代的聚乙二醇钝化部分，但也能够使用如上所述的其它钝化部分。
合成包含聚乙二醇钝化部分和多个羟基官能团的多价钝化剂的方法如下所示。

如以上的反应方案所示，包含聚乙二醇部分的氨基功能性化合物能够在80℃下与3，4，5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-酮反应而形成多价钝化剂。对于这种多价钝化剂，以上通式中变量的定义如下：R是甲基；n是11，s是1，q是1，M是C＝O，N是-NH-C-C-NH-(C＝O)-，o是4，W和Y是O，X和Z是H，并且p是1。
如上所述，上式中的连接符号L能够是连接基团。示例性的连接基团包括但不限于式-(C)_s-(C＝O)-Q-R’-Q-(C＝O)-所示的基团，其中每一Q独立地是-O-或-NH-，R’是脂肪族或芳香族基团并且s是0至10的整数。
与以上通式对应的示例性多价试剂由下式表示：

其中n是正整数。例如，n能够是3至100。
根据某些实施方案，多价试剂能够通过下式表示：

其中n是正整数。例如，n能够是3至100。
本发明还提供了具有用如上所述的多价钝化剂处理的表面的固体载体。根据某些实施方案，本发明提供了固体载体，其包含：包含硅、铝、锗、镓、铟、镁或锡的氧化物的氧化物层；与氧化物层结合的选自过渡金属、镁和铝的金属原子；以及包含钝化部分的钝化试剂，所述钝化部分选自取代的聚乙二醇、未取代的聚乙二醇、烃、取代的烃、碳氟化合物和取代的碳氟化合物；其中钝化试剂在多个位置与一个或多个金属原子共价结合或形成配合物。
如上所述，用金属酯进行表面改性使得能够在很温和的条件下在多种氧化物表面形成很受控制的、很薄的金属前体层的沉积。金属酯非常易于制备，并且使用前不需要纯化。金属酯沉积然后多价钝化剂沉积的联合使用能够产生各种表面类型和性质。例如，在最后的表面改性期间，能够使用具有不同官能团的多价钝化剂处理表面。
包含磷酸酯部分的多价钝化剂的合成
使用已知的化学合成技术能够容易地合成所述多价钝化剂。对于包含作为钝化部分的聚乙二醇和能够与载体表面上的金属原子结合的多个羟基官能团的多价钝化剂，示例性的合成技术如上所述。合成包含聚乙二醇钝化部分和多个磷酸酯部分的多价钝化剂的方法描述如下。磷酸酯部分能够与载体表面上的金属原子形成配合物。
甲基PEG₂₀₀₀-乙酸的合成与纯化
该方法的第一步包括合成甲基PEG₂₀₀₀-乙酸中间体。这种中间体能够通过如下过程合成。

该过程描述如下。
1)将甲基-PEG₂₀₀₀醇(100克，平均0.05摩尔)溶于添加了NaOH(6g，0.15摩尔)并在氮中于冰上冷却的100ml无水二氯甲烷(DCM)中。
2)搅拌下分批加入溴乙酸正丁酯(30g，0.15摩尔)。将最终混合物在室温下搅动(由于形成NaBr固体而使搅拌变得困难)24小时。
3)通过离心或倾析除去NaBr沉淀。在旋转蒸发仪上除去大部分DCM。添加己烷以萃取出未反应的溴乙酸正丁酯。用HCl(浓缩)将倾析出己烷后的半固体调节至pH 1.0并在室温下搅拌过夜。
4)用DCM萃取产物三次(总共500ml)，用盐水洗涤，并用无水NaSO₄干燥。在旋转蒸发仪上除去大部分DCM。搅拌下逐滴添加至冷己烷以使产物沉淀。
5)收集白色固体产物(85克)，用己烷洗涤，真空干燥，并用基质辅助激光解吸电离(MALDI)的正和负两种模式的质谱(MS)表征。收率为83％。
mPEG2K乙酰氨基-Tris-醇的合成与在纯化
然后甲基PEG2K-乙酸中间体反应产物能够与2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1，3-二醇如下所述进行反应，形成包含多个羟基基团的第二中间体(即mPEG2K乙酰氨基-Tris-醇)。

该过程描述如下。
1)将甲基PEG₂₀₀₀-乙酸(12克，平均0.006摩尔)与无水甲苯和乙腈分别共蒸发三次(每次30ml)并再溶解在干燥的二氯甲烷(10ml)中。干氮中添加三乙胺(TEA)(0.75ml，0.006摩尔)。搅拌下在氮中分批添加琥珀酰氨基碳酸酯(DSC)(3克，0.012摩尔)。使反应在室温下进行4小时并在旋转蒸发仪上除去溶剂。添加无水二氧杂环己烷(10ml)以溶解残余物，并在剧烈搅拌下将溶液逐滴加入至饱和的三羟甲基氨基甲烷(Tris碱)水溶液中。使反应在室温下进行两小时然后用DCM萃取三次(总共100ml)。用硫酸钠干燥DCM相并在除去溶剂后获得油状粗产品。
2)在用5％MeOH-DCM填充的硅胶(100ml)柱上纯化残余物并用5％MeOH-DCM洗脱。流份12至20通过MALDI-MS和质子核磁共振谱(HNMR)被鉴定为期望产物(9.5克)。收率为76％。
3)产物在二氧化硅TLC板上、10％MeOH-DCM中的Rf值为约0.5。
甲基PEG-2K乙酰氨基-Tris-三磷酸酯的合成与纯化
mPEG₂₀₀₀乙酰氨基-Tris-醇中间体随后能够如下所述与双(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺反应而形成多价钝化剂。

该过程描述如下。
1)将mPEG2K乙酰氨基-Tris-醇(2.2克，1毫摩尔)与无水甲苯和乙腈分别共蒸发三次(每次30ml)。在氮中添加双(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(FW＝271.6，1.22g，4.5毫摩尔)和四唑乙腈溶液(15ml，0.45M，6.75毫摩尔)。在室温下搅拌反应混合物3小时。添加叔丁基过氧化氢(70％水溶液，6ml，45毫摩尔)并在室温下搅拌该混合物2小时。在旋转蒸发仪上除去溶剂。用DCM萃取残余物三次并用重碳酸钠缓冲液(pH 9)洗涤，并用硫酸钠干燥。残余物用硅胶柱纯化，洗脱剂为DCM中的10％甲醇。流份15至20通过MS和HNMR被鉴定为期望产物。
2)产物在二氧化硅TLC板上、10％MeOH-DCM中的R_f为0.55。
3)将纯化的膦酸酯放入NH₃·H₂O(5ml)中并在室温下孵育过夜。在真空下除去氨水，再溶解于水中并在Sephadex DEAE A-25柱(用2M重碳酸钾平衡并用水彻底清洗)上纯化。用2M醋酸三乙胺缓冲液洗脱磷酸酯。通过反复与水在真空下共蒸发除去缓冲液，并通过MALDI-MS、质子NMR和磷NMR表征产物(1.7克)。收率是70％。
甲基PEG-350乙酰氨基-Tris-三磷酸酯的合成与纯化
使用平均分子量为350的起始材料甲基PEG 350醇，按照与甲基PEG-2K乙酰氨基-Tris-三磷酸酯相同的合成步骤合成甲基PEG-350乙酰氨基-Tris-三磷酸酯。
实验
本发明的全方位教导还可以根据以下实施例进行理解，所述实施例不应以任何方式被解释为对本发明教导范围的限制。
用金属试剂和TEG磷酸酯处理的表面
在表面上进行如下操作以后，钽PEG酯改性的二氧化硅表面的XPS数据如下表所示：
在77℃下，用15mM钽(5)的溶液处理石英盖玻片16小时，所述钽(5)已经通过在乙酸乙酯中用PEG 550交换乙基醇盐而被转化成它的PEG 550(单甲基酯)酯；
然后在110℃下用甲苯中的20mM四乙二醇(单甲基)单磷酸酯(TEG磷酸酯)的四(正丁基)铵盐处理4天。