一种微囊藻毒素-LR的免疫分析试剂盒及其检测方法 【技术领域】
一种微囊藻毒素-LR(MC-LR)的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法，用于水体中MC-LR含量的检测，属于光激化学发光免疫分析(LICA)技术领域。
背景技术
微囊藻毒素(Microcystin)是蓝藻水华释放出的一类具有强烈毒副作用的肝脏毒素，其中微囊藻毒素-LR(MC-LR)是该毒素中毒性最强的一种。研究表明MC-LR可引起家禽、家畜及野生动物死亡。且饮用水中低剂量的MC-LR就能引起人的肝脏损伤甚至肝癌。目前淡水水体中的藻毒素已成为全球性的环境问题，世界各地经常发生微囊藻毒素中毒事件。被藻毒素污染的饮用水和水产品，给人类健康带来巨大的威胁，我国于2007年7月1日起实施的新版《生活饮用水标准》，已将微囊藻毒素列入水质检测指标，标准为1μg/mL。
MC-LR是一种环状七肽，分子量995.2，易溶于水，无挥发性，化学性质及其稳定，如高温、光照、蛋白酶等均不能将其破坏。水处理工艺的混凝沉淀、过滤也不能将其有效去除，在紫外线的照射下和水中某些细菌的作用下可以降解。
由于MC-LR造成的损伤快速且不可逆，因而建立快速敏感的检测方法来监测水体中的毒素含量将起到很好的预警作用。利用MC-LR的生理化学特性如分子量、生色团和反应性，目前已建立了MC-LR的测定方法有生物测定法、化学测定法和免疫测定法，而其中的生物毒性试验、蛋白磷酸酶抑制法(PPI)、HPLC检测法和ELISA检测法是目前国内外较为常用的方法。在传统检测方法得到广泛应用的同时，人们也不断将新技术引入MC-LR的检测，以期建立更敏感、更稳定、更简便的MC-LR检测技术。
光激化学发光免疫分析(LICA)是以纳米级高分子微粒为基础的新一代化学发光免疫技术，该项技术将被广泛地应用于研究生物分子的相互作用。又称为AlphaLISA分析法(PE公司)，被誉为免洗的ELISA。其主要原理是由光激发产生的均相化学发光技术，它具有快速、均相(免洗)、高灵敏、量程宽和操作简便的特点。LICA试剂由含有感光化合物的感光微粒和含有发光化合物的发光微粒组成，微粒直径约188nm，表面覆盖多糖水凝胶。水凝胶能减少非特异性结合，同时，增加微粒的悬浮性。微粒通过水凝胶表面的功能团与生物分子共价连接。纳米级微粒大大增加了反应的表面积，每个微粒表面覆盖着成百上千个生物分子，可捕获目标分子。
LICA技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小(约为200nm)。如果发光微粒在200nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能级的光(520nm-620nm)。相反，如果在200nm直径范围内没有发光微粒，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是LICA均相反应的基础。通常在该反应体系中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了两个微粒的距离，例如形成免疫夹心或受体-配体复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种检测MC-LR的试剂盒及其检测方法，用于对水体中MC-LR含量的检测。
本发明的技术方案：一种微囊藻毒素-LR(MC-LR)的光激化学发光免疫分析试剂盒，由白色不透明微孔板(1)，MC-LR标准品(2)，包被有MC-LR-BSA的发光微粒(3)，生物素化抗MC-LR单克隆抗体溶液(4)和包被有链霉亲和素的感光微粒(5)组成。
所述的试剂盒检测MC-LR的方法，测定的基础是标记免疫反应。依次向白色不透明微孔板中加入包被有MC-LR-BSA的发光微粒、MC-LR标准品或处理好地样品、生物素化抗MC-LR单克隆抗体溶液进行免疫反应；接着加入包被有链霉亲和素的感光微粒进行反应，反应后检测光信号，以加入MC-LR标准品的检测值绘制标准曲线，以加入被测样品的检测值从标准曲线计算样品中的MC-LR含量。
具体操作为：取包被有MC-LR-BSA的发光微粒20μL、MC-LR标准品或处理好的样品20μL以及生物素化抗MC-LR单克隆抗体溶液20μL依次加到白色不透明微孔板中，37℃孵育30分钟；加入包被有链霉亲和素的感光微粒175μL，37℃孵育10分钟；在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线测算出样品中的MC-LR含量。
本发明的有益效果：发光微粒上的MC-LR-BSA与游离MC-LR竞争连接到生物素化抗MC-LR单克隆抗体上，再与包被链霉亲和素的感光微粒形成复合物，在红光激发下，通过单线态离子氧的产生和传递，将能量传递给发光微粒产生荧光，用光激化学发光检测仪检测，光信号强度与样品中MC-LR浓度成反比，对照标准曲线测得样品中MC-LR含量。本发明用于水体中MC-LR含量的检测，该检测试剂盒结构简单，操作简便、检测时间短、灵敏度高。
【附图说明】
图1：检测MC-LR的试剂盒示意图。1、白色不透明微孔板，2、MC-LR标准品，3、包被有MC-LR-BSA的发光微粒，4、生物素化抗MC-LR单克隆抗体溶液，5、包被有链霉亲和素的感光微粒。
图2：MC-LR-LICA反应示意图。
图3：MC-LR-LICA标准曲线图。
【具体实施方式】
实施例1：制备试剂盒和检测水样
包被有MC-LR-BSA的发光微粒制备：在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5μL 1％Tween-20，0.05mg MC-LR-BSA人工抗原，10μL硼氢化氰钠，用0.1M、pH 6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时。加入10μL 0.3M pH 5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，分离得到已连接MC-LR-BSA的发光微粒，稀释后备用。
标准品MC-LR试剂的配制：(0ng/mL，0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，5ng/mL)，从MC-LR纯品中稀释得到，稀释液为PBS(0.01mmol/L，pH 7.4)。
试剂盒的组成：
(1)、白色不透明微孔板(12条×8孔，可以拆分为单孔)。
(2)、1×包被有MC-LR-BSA的发光微粒：2mL。
(3)、6×MC-LR标准品，1.0mL/瓶，标准液浓度为：0，0.1，0.2，0.5，1，5ng/mL。
(4)、1×生物素化抗MC-LR单克隆抗体溶液2mL。
(5)、1×包被有链霉亲和素的感光微粒：20mL。
测定时注意事项
1、使用之前将所有试剂回升至室温(18-30℃)。
2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射。
检测步骤
样品处理：
澄清水样可直接用于检测。若水样浑浊，取混匀后的水样2mL于3mL试管中，3000rpm离心20min，转移澄清层至另一试管中，待检测。
取包被有MC-LR-BSA发光微粒、MC-LR标准品或处理好的样品、生物素化抗MC-LR抗体溶液三种试剂各20μL加到白色不透明微孔板中，37℃孵育30分钟；加入175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃孵育10分钟；在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线测算出样品中的MC-LR含量。结果见表1，由标准曲线求得水样所含MC-LR浓度分别为0.342、1.21ng/mL。
表1