一种定量测定血浆中同型半胱氨酸的方法.pdf

本发明涉及一种定量测定血浆中同型半胱氨酸的方法，包括：(1)血标本处理：血浆中加入2.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸、0.6mol/L三丁基磷混匀，冰浴中放置30分钟，加入含有1mmol/L EDTA的0.6mol/L高氯酸。混匀，室温放置10分钟，10000rpm离心5分钟，吸取上清液，加入1.55mol/L NaOH、含有4mmol/L EDTA的0.125mol/L硼酸缓冲液、1mg/ml SBD-F，混匀后于60℃水浴中放置1小时，冰浴冷却后，进样。(2)流动相的配制：2mol/L醋酸缓冲盐溶液35ml，加入甲醇(色谱纯)10～20ml，加水至1000ml，摇匀，过0.45μm微孔滤膜。(3)色谱条件：分析柱为C18色谱柱；流速为0.7～1.2ml/min；柱温为20～30℃；进样量15μl；荧光检测条件：激发波长390nm，发射波长470nm。属于医药领域。

1.  一种血浆中Hcy浓度的定量测定方法，包括：
(1)血标本处理：血浆中加入2.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸、0.6mol/L三丁基磷混匀，冰浴中放置30分钟，加入含有1mmol/L EDTA的0.6mol/L高氯酸，混匀，室温放置10分钟，10000rpm离心5分钟，吸取上清液，加入1.55mol/L NaOH、含有4mmol/L EDTA的0.125mol/L硼酸缓冲液、1mg/ml SBD-F，混匀后于60℃水浴中放置1小时，冰浴冷却后，进样；
(2)流动相的配制：2mol/L醋酸缓冲盐溶液35ml，加入甲醇(色谱纯)10～20ml，加水至1000ml，摇匀，过0.45μm微孔滤膜；
(3)色谱条件：分析柱为C18色谱柱；流速为0.7～1.2ml/min；柱温为20～30℃；进样量15μl；荧光检测条件：激发波长390nm，发射波长470nm。

一种定量测定血浆中同型半胱氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种定量测定血浆中同型半胱氨酸的方法，本发明属于医药领域。
背景技术
目前血浆中Hcy的定量测定主要包括放射免疫法、荧光偏振免疫分析法、毛细电泳法(HPEC)及高效液相法(HPLC)。在采用HPLC法测定中，根据检测方法的不同分别有衍生化荧光(HPLC-FLD)、电化学(HPLC-ECD)和质谱(HPLC-MS)检测三种。免疫法虽然操作相对简便，但专属性较差难以满足临床研究的准确测定要求，且检测价格昂贵短期难以在国内普及。HPEC、HPLC-ECD、HPLC-MS质谱检测虽然灵敏度高、专属性强，但是国内实验室很少配置这几种价格昂贵的仪器设备，很难满足开展大规模的临床Hcy研究的需要。因此，建立一种简便、快速、准确的人血浆中Hcy的HPLC-FLD定量测定方法，是目前临床研究十分需要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种血浆中Hcy浓度的定量测定方法，包括：
(1)血标本处理：血浆中加入2.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸、0.6mol/L三丁基磷混匀，冰浴中放置30分钟，加入含有1mmol/L EDTA的0.6mol/L高氯酸。混匀，室温放置10分钟，10000rpm离心5分钟，吸取上清液，加入1.55mol/L NaOH、含有4mmol/L EDTA的0.125mol/L硼酸缓冲液、1mg/ml SBD-F，混匀后于60℃水浴中放置1小时，冰浴冷却后，进样。
(2)流动相的配制：2mol/L醋酸缓冲盐溶液35ml，加入甲醇(色谱纯)10～20ml，加水至1000ml，摇匀，过0.45μm微孔滤膜。
(3)色谱条件：分析柱为C18色谱柱；流速为0.7～1.2ml/min；柱温为20～30℃；进样量15μl；荧光检测条件：激发波长390nm，发射波长470nm。
在本发明提供的方法中，可采取血标本收集方法：
受检者空腹12小时，取静脉血3ml(0.1％EDTA抗凝，一般5ml血用50μl 0.5mol/LEDTA抗凝)，立即置于冰上，因红细胞可合成同型半胱氨酸，所以标本需在1小时内离心(3000rpm，10min)使血浆与红细胞分离，收集血浆。置于-20℃冰箱内保存。
在本发明提供的方法中，  0.9％NaCl、4mmol/L EDTA-Na2的配置：称取NaCl 2.25g和EDTA-Na2 0.372g，置于250ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用。
在本发明提供的方法中，25mmol/L N-乙酰半胱氨酸的配置：取N-乙酰半胱氨酸40mg，精密称取，置于10ml量瓶中，用配好的S.E.液稀释至刻度，摇匀备用。
在本发明提供的方法中，2.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸的配置：取10A液5ml，置于50ml量瓶内，用配好的S.E.液稀释至刻度，摇匀备用，作为内标。
在本发明提供的方法中，0.6mol/L三丁基磷的配置：称取90％的三丁基磷1.358g，置于10ml量瓶内，加入N，N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀备用。
在本发明提供的方法中，含有1mmol/L EDTA的0.6mol/L高氯酸的配置：称取29.2mgEDTA，量取8.4ml高氯酸(71％)，置于100ml量瓶内，加水稀释至刻度，摇匀备用。
在本发明提供的方法中，1.55mol/L NaOH的配置：称取0.62g NaOH到10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀备用。
在本发明提供的方法中，含有4mmol/L EDTA的0.125mol/L硼酸缓冲液(pH9.5)的配置：称取硼砂4.767g置于100ml烧杯内，加水约90ml，加入EDTA-Na20.149g，超声使之完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH至9.5，转移至100ml量瓶内，加入水稀释至刻度，摇匀备用。
在本发明提供的方法中1mg/ml SBD-的配置：称量荧光剂一瓶(25mg)全部转移至25ml量瓶中，加入4mmol/L EDTA的0.125mol/L硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀备用。
在本发明中血标本处理的优选方法：
取血浆120μl置1.5ml离心管内，加2.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸30μl，再加入0.6mol/L三丁基磷15μl，涡旋混匀，置于冰浴中放置30分钟，取出，加入冷的含有1mmol/L EDTA的0.6mol/L高氯酸150μl，涡旋混匀，室温下放置10分钟，10000rpm离心5分钟，吸取上清液50μl置于1.5ml离心管内，加1.55mol/L NaOH 10μl、含有4mmol/L EDTA的0.125mol/L硼酸缓冲液125μl和1mg/ml SBD-F 50μl，涡旋混匀，置于60℃水浴中放置1小时后，取出冰浴冷却后，进样15μl分析。
本发明预处理方法操作简便；采用单元泵等度洗脱，仪器成本较低；样品检测专属性强，灵敏度高；单个样品检测时间短(约15min)，检测效率高；能快速、准确的满足临床大量样本测定研究的需求。
具体实施方式
实施例1
1.血标本采集及预处理
(1)血标本收集
受检者空腹12小时，取静脉血3ml(0.1％EDTA抗凝，一般5ml血用50μl 0.5mol/L EDTA抗凝)，立即置于冰上，因红细胞可合成同型半胱氨酸，所以标本需在1小时内离心(3000rpm，10min)使血浆与红细胞分离，收集血浆。置于-20℃冰箱内保存。
(2)试剂的配制
a.S.E.液(0.9％NaCl、4mmol/L EDTA-Na2)：称取NaCl 2.25g和EDTA-Na2 0.372g，置于250ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用。
b.10A液(25mmol/L N-乙酰半胱氨酸)：取N-乙酰半胱氨酸40mg，精密称取，置于10ml量瓶中，用配好的S.E.液稀释至刻度，摇匀备用。
c.A液(2.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸，I.S.)：取10A液5ml，置于50ml量瓶内，用配好的S.E.液稀释至刻度，摇匀备用，作为内标。
d.B液(0.6mol/L三丁基磷)：称取90％的三丁基磷1.358g，置于10ml量瓶内，加入N，N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀备用。
e.C液(0.6mol/L高氯酸，1mmol/L EDTA)：称取29.2mg EDTA，量取8.4ml高氯酸(71％)，置于100ml量瓶内，加水稀释至刻度，摇匀备用。
f.D液(1.55mol/L NaOH)：称取0.62g NaOH到10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀备用。
g.E液(硼酸缓冲液0.125mol/L，pH9.5，4mmol/L EDTA)：称取硼砂4.767g置于100ml烧杯内，加水约90ml，加入EDTA-Na20.149g，超声使之完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH至9.5，转移至100ml量瓶内，加入水稀释至刻度，摇匀备用。
h.F液(1mg/ml SBD-F，荧光剂)：称量荧光剂一瓶(25mg)全部转移至25ml量瓶中，加入E液稀释至刻度，摇匀备用。
(3)血标本处理 
取血浆120μl置1.5ml离心管内，加A液30μl，再加入试剂B液15μl，涡旋混匀，置于冰浴中放置30分钟，取出，加入冷的试剂C液150μl，涡旋混匀，室温下放置10分钟，10000rpm离心5分钟，吸取上清液50μl置于1.5ml离心管内，加试剂D液10μl、试剂E液125μl和试剂F液50μl，涡旋混匀，置于60℃水浴中放置1小时后，取出冰浴冷却后，进样15μl分析。
2.HPLC-FLD测定条件
(1)流动相的配制：
a.醋酸缓冲盐：称取无水醋酸钠82.03g置于500ml烧杯中，加入约300ml冰醋酸，加入水约100ml，超声使之完全溶解，用冰醋酸调节pH值到4，转移至500ml量瓶中，加入水稀释至刻度，最终使醋酸缓冲液浓度为2mol/L。
b.流动相：量取醋酸缓冲盐溶液35ml，加入甲醇(色谱纯)20ml，加入水945ml，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
(2)色谱条件：分析柱为Diamonsil C18柱(4.6×150mm，5μm)；流速为0.7ml/min；柱温为30℃；进样量15μl；荧光检测条件：激发波长390nm，发射波长470nm。
在此条件下，Hcy和内标NAC的保留时间分别为5.8min、12.3min；Hcy在0～110μmol/L范围内线性良好。按内标法计算血标本中同型半胱氨酸的浓度。
实施例2
1.血标本采集及预处理
(1)血标本收集
受检者空腹12小时，取静脉血3ml(0.1％EDTA抗凝，一般5ml血用50μl 0.5mol/L EDTA抗凝)，立即置于冰上，因红细胞可合成同型半胱氨酸，所以标本需在1小时内离心(3000rpm，10min)使血浆与红细胞分离，收集血浆。置于-20℃冰箱内保存。
(2)试剂的配制
a.S.E.液(0.9％NaCl、4mmol/L EDTA-Na2)：称取NaCl 2.25g和EDTA-Na2 0.372g，置于250ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用。
b.10A液(25mmol/L N-乙酰半胱氨酸)：取N-乙酰半胱氨酸40mg，精密称取，置于10ml量瓶中，用配好的S.E.液稀释至刻度，摇匀备用。
c.A液(2.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸，I.S.)：取10A液5ml，置于50ml量瓶内，用配好的S.E.液稀释至刻度，摇匀备用，作为内标。
d.B液(0.6mol/L三丁基磷)：称取90％的三丁基磷1.358g，置于10ml量瓶内，加入N，N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀备用。
e.C液(0.6mol/L高氯酸，1mmol/L EDTA)：称取29.2mg EDTA，量取8.4ml高氯酸(71％)，置于100ml量瓶内，加水稀释至刻度，摇匀备用。
f.D液(1.55mol/L NaOH)：称取0.62g NaOH到10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀备用。
g.F液(硼酸缓冲液0.125mol/L，pH9.5，4mmol/L EDTA)：称取硼砂4.767g置于100ml烧杯内，加水约90ml，加入EDTA-Na20.149g，超声使之完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH至9.5，转移至100ml量瓶内，加入水稀释至刻度，摇匀备用。
h.F液(1mg/ml SBD-F，荧光剂)：称量荧光剂一瓶(25mg)全部转移至25ml量瓶中，加入E液稀释至刻度，摇匀备用。
(3)血标本处理
取血浆120μl置1.5ml离心管内，加A液30μl，再加入试剂B液15μl，涡旋混匀，置于冰浴中放置30分钟，取出，加入冷的试剂C液150μl，涡旋混匀，室温下放置10分钟，10000rpm离心5分钟，吸取上清液50μl置于1.5ml离心管内，加试剂D液10μl、试剂E液125μl和试剂F液50μl，涡旋混匀，置于60℃水浴中放置1小时后，取出冰浴冷却后，进样15μl分析。
2.HPLC-FLD测定条件
(1)流动相的配制：
a.醋酸缓冲盐：称取无水醋酸钠82.03g置于500ml烧杯中，加入约300ml冰醋酸，加入水约100ml，超声使之完全溶解，用冰醋酸调节pH值到4，转移至500ml量瓶中，加入水稀释至刻度，最终使醋酸缓冲液浓度为2mol/L。
b.流动相：量取醋酸缓冲盐溶液35ml，加入甲醇(色谱纯)20ml，加入水945ml，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
(2)色谱条件：分析柱为Diamonsil C18柱(4.6×150mm，5μm)；流速为0.8ml/min；柱温为25℃；进样量15μl；荧光检测条件：激发波长390nm，发射波长470nm。
在此条件下，Hcy和内标NAC的保留时间分别为5.5min、9.5min；Hcy在0～110μmol/L范围内线性良好。按内标法计算血标本中同型半胱氨酸的浓度。
实施例3
1.血标本采集及预处理
(1)血标本收集
受检者空腹12小时，取静脉血3ml(0.1％EDTA抗凝，一般5ml血用50μl 0.5mol/L EDTA抗凝)，立即置于冰上，因红细胞可合成同型半胱氨酸，所以标本需在1小时内离心(3000rpm，10min)使血浆与红细胞分离，收集血浆。置于-20℃冰箱内保存。
(2)试剂的配制
a.S.E.液(0.9％NaCl、4mmol/L EDTA-Na2)：称取NaCl 2.25g和EDTA-Na2 0.372g，置于250ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用。
b.10A液(25mmol/L N-乙酰半胱氨酸)：取N-乙酰半胱氨酸40mg，精密称取，置于10ml量瓶中，用配好的S.E.液稀释至刻度，摇匀备用。
c.A液(2.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸，l.S.)：取10A液5ml，置于50ml量瓶内，用配好的S.E.液稀释至刻度，摇匀备用，作为内标。
d.B液(0.6mol/L三丁基磷)：称取90％的三丁基磷1.358g，置于10ml量瓶内，加入N，N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀备用。
e.C液(0.6mol/L高氯酸，1mmol/L EDTA)：称取29.2mg EDTA，量取8.4ml高氯酸(71％)，置于100ml量瓶内，加水稀释至刻度，摇匀备用。
f.D液(1.55mol/L NaOH)：称取0.62g NaOH到10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀备用。
g.E液(硼酸缓冲液0.125mol/L，pH9.5，4mmol/L EDTA)：称取硼砂4.767g置于100ml烧杯内，加水约90ml，加入EDTA-Na20.149g，超声使之完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH至9.5，转移至100ml量瓶内，加入水稀释至刻度，摇匀备用。
h.F液(1mg/ml SBD-F，荧光剂)：称量荧光剂一瓶(25mg)全部转移至25ml量瓶中，加入E液稀释至刻度，摇匀备用。
(3)血标本处理
取血浆120μl置1.5ml离心管内，加A液30μl，再加入试剂B液15μl，涡旋混匀，置于冰浴中放置30分钟，取出，加入冷的试剂C液150μl，涡旋混匀，室温下放置10分钟，10000rpm离心5分钟，吸取上清液50μl置于1.5ml离心管内，加试剂D液10μl、试剂E液125μl和试剂F液50μl，涡旋混匀，置于60℃水浴中放置1小时后，取出冰浴冷却后，进样15μl分析。
2.HPLC-FLD测定条件
(1)流动相的配制：
a.醋酸缓冲盐：称取无水醋酸钠82.03g置于500ml烧杯中，加入约300ml冰醋酸，加入水约100ml，超声使之完全溶解，用冰醋酸调节pH值到4，转移至500ml量瓶中，加入水稀释至刻度，最终使醋酸缓冲液浓度为2mol/L。
b.流动相：量取醋酸缓冲盐溶液35ml，加入甲醇(色谱纯)20ml，加入水945ml，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
(2)色谱条件：分析柱为Diamonsil C18柱(4.6×150mm，5μm)；流速为1.0ml/min；柱温为20℃；进样量15μl；荧光检测条件：激发波长390nm，发射波长470nm。
在此条件下，Hcy和内标NAC的保留时间分别为5.2min、8.8min；Hcy在0～110μmol/L范围内线性良好。按内标法计算血标本中同型半胱氨酸的浓度。
实施例4
1.血标本采集及预处理
(1)血标本收集
受检者空腹12小时，取静脉血3ml(0.1％EDTA抗凝，一般5ml血用50μl 0.5mol/L EDTA抗凝)，立即置于冰上，因红细胞可合成同型半胱氨酸，所以标本需在1小时内离心(3000rpm，10min)使血浆与红细胞分离，收集血浆。置于-20℃冰箱内保存。
(2)试剂的配制
a.S.E.液(0.9％NaCl、4mmol/L EDTA-Na2)：称取NaCl 2.25g和EDTA-Na2 0.372g，置于250ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用。
b.10A液(25mmol/L N-乙酰半胱氨酸)：取N-乙酰半胱氨酸40mg，精密称取，置于10ml量瓶中，用配好的S.E.液稀释至刻度，摇匀备用。
c.A液(2.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸，I.S.)：取10A液5ml，置于50ml量瓶内，用配好的S.E.液稀释至刻度，摇匀备用，作为内标。
d.B液(0.6mol/L三丁基磷)：称取90％的三丁基磷1.358g，置于10ml量瓶内，加入N，N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀备用。
e.C液(0.6mol/L高氯酸，1mmol/L EDTA)：称取29.2mg EDTA，量取8.4ml高氯酸(71％)，置于100ml量瓶内，加水稀释至刻度，摇匀备用。
f.D液(1.55mol/L NaOH)：称取0.62g NaOH到10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀备用。
g.E液(硼酸缓冲液0.125mol/L，pH9.5，4mmol/L EDTA)：称取硼砂4.767g置于100ml烧杯内，加水约90ml，加入EDTA-Na20.149g，超声使之完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH至9.5，转移至100ml量瓶内，加入水稀释至刻度，摇匀备用。
h.F液(1mg/ml SBD-F，荧光剂)：称量荧光剂一瓶(25mg)全部转移至25ml量瓶中，加入E液稀释至刻度，摇匀备用。
(3)血标本处理
取血浆120μl置1.5ml离心管内，加A液30μl，再加入试剂B液15μl，涡旋混匀，置于冰浴中放置30分钟，取出，加入冷的试剂C液150μl，涡旋混匀，室温下放置10分钟，10000rpm离心5分钟，吸取上清液50μl置于1.5ml离心管内，加试剂D液10μl、试剂E液125μl和试剂F液50μl，涡旋混匀，置于60℃水浴中放置1小时后，取出冰浴冷却后，进样15μl分析。
2.HPLC-FLD测定条件
(1)流动相的配制：
a.醋酸缓冲盐：称取无水醋酸钠82.03g置于500ml烧杯中，加入约300ml冰醋酸，加入水约100ml，超声使之完全溶解，用冰醋酸调节pH值到4，转移至500ml量瓶中，加入水稀释至刻度，最终使醋酸缓冲液浓度为2mol/L。
b.流动相：量取醋酸缓冲盐溶液35ml，加入甲醇(色谱纯)10ml，加入水955ml，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
(2)色谱条件：分析柱为Diamonsil C18柱(4.6×150mm，5μm)；流速为1.2ml/min；柱温为20℃；进样量15μl；荧光检测条件：激发波长390nm，发射波长470nm。
在此条件下，Hcy和内标NAC的保留时间分别为6.5min、14.4min；Hcy在0～110μmol/L范围内线性良好。按内标法计算血标本中同型半胱氨酸的浓度。
实施例5
1.血标本采集及预处理
(1)血标本收集
受检者空腹12小时，取静脉血3ml(0.1％EDTA抗凝，一般5ml血用50μl 0.5mol/L EDTA抗凝)，立即置于冰上，因红细胞可合成同型半胱氨酸，所以标本需在1小时内离心(3000rpm，10min)使血浆与红细胞分离，收集血浆。置于-20℃冰箱内保存。
(2)试剂的配制
a.S.E.液(0.9％NaCl、4mmol/L EDTA-Na2)：称取NaCl 2.25g和EDTA-Na2 0.372g，置于250ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用。
b.10A液(25mmol/L N-乙酰半胱氨酸)：取N-乙酰半胱氨酸40mg，精密称取，置于10ml量瓶中，用配好的S.E.液稀释至刻度，摇匀备用。
c.A液(2.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸，I.S.)：取10A液5ml，置于50ml量瓶内，用配好的S.E.液稀释至刻度，摇匀备用，作为内标。
d.B液(0.6mol/L三丁基磷)：称取90％的三丁基磷1.358g，置于10ml量瓶内，加入N，N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀备用。
e.C液(0.6mol/L高氯酸，1mmol/L EDTA)：称取29.2mg EDTA，量取8.4ml高氯酸(71％)，置于100ml量瓶内，加水稀释至刻度，摇匀备用。
f.D液(1.55mol/L NaOH)：称取0.62g NaOH到10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀备用。
g.E液(硼酸缓冲液0.125mol/L，pH9.5，4mmol/L EDTA)：称取硼砂4.767g置于100ml烧杯内，加水约90ml，加入EDTA-Na20.149g，超声使之完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH至9.5，转移至100ml量瓶内，加入水稀释至刻度，摇匀备用。
h.F液(1mg/ml SBD-F，荧光剂)：称量荧光剂一瓶(25mg)全部转移至25ml量瓶中，加入E液稀释至刻度，摇匀备用。
(3)血标本处理
取血浆120μl置1.5ml离心管内，加A液30μl，再加入试剂B液15μl，涡旋混匀，置于冰浴中放置30分钟，取出，加入冷的试剂C液150μl，涡旋混匀，室温下放置10分钟，10000rpm离心5分钟，吸取上清液50μl置于1.5ml离心管内，加试剂D液10μl、试剂E液12μl和试剂F液50μl，涡旋混匀，置于60℃水浴中放置1小时后，取出冰浴冷却后，进样15μl分析。
2.HPLC-FLD测定条件
(1)流动相的配制：
a.醋酸缓冲盐：称取无水醋酸钠82.03g置于500ml烧杯中，加入约300ml冰醋酸，加入水约100ml，超声使之完全溶解，用冰醋酸调节pH值到4，转移至500ml量瓶中，加入水稀释至刻度，最终使醋酸缓冲液浓度为2mol/L。
b.流动相：量取醋酸缓冲盐溶液35ml，加入甲醇(色谱纯)20ml，加入水945ml，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
(2)色谱条件：分析柱为Kromasil C18柱(4.6×250mm，100A，5μm)；流速为1.0ml/min；柱温为25℃；进样量15μl；荧光检测条件：激发波长390nm，发射波长470nm。
在此条件下，Hcy和内标NAC的保留时间分别为5.8min、11.5min；Hcy在0～110μmol/L范围内线性良好。按内标法计算血标本中同型半胱氨酸的浓度。